CC BY
1УДК 638.16 Гамолин И.С., Сочинская О.Н.
Гамолин И. С.
студент
Донской государственный аграрный университет (п. Персиановский, Россия)
Научный руководитель: Сочинская О.Н.
кандидат с.-х. наук, доцент кафедры биологии, морфологии и вирусологии Донской государственный аграрный университет (п. Персиановский, Россия)
МЕТОДЫ ОЦЕНКИ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО КАЧЕСТВА МЕДА
Аннотация: в статье изучены методы оценки микробиологических характеристик меда для выявления его флоры, и контроля в данном продукте. Мед — это продукт, богатый простыми сахарами, минералами, витаминами и биоактивными соединениями. Однако, обладая физическими и химическими свойствами, неблагоприятными для роста микрофлоры, мед может содержать большую популяцию микроорганизмов.
Ключевые слова: микробиологическое качество, мед, метод MPN, антимикробная активность, микроскопия, загрязнение меда, гигиенические практик, бактериальные споры, ферментация лактозы, лабораторный анализ.
Мы провели исследование методов анализа меда и выбрали самые интересные из них, для этого используют такие методы:
Метод техники подсчета по методу наиболее вероятного числа (MPN).
Этот метод основан на технике наиболее вероятного числа (Most Probable Number), которая включает инокуляцию в пробирки с бульоном лаурилсульфата триптозы (LST). Эта техника является наиболее часто используемой для подсчета колиформных бактерий. Наиболее вероятное число бактерий в образце
определяется с использованием таблицы доверительных интервалов с вероятностью 95% для различных комбинаций положительных пробирок в сериях из трех или пяти пробирок.
Этот метод позволяет оценить плотность жизнеспособных организмов, присутствующих в анализируемом образце, и основан на принципе, что бактерии в образце могут быть распределены равномерно, что приводит к образованию суспензии бактериальных клеток, равномерно распределенных в образце.
Метод включает инокуляцию возрастающих объемов образца в подходящую культуральную среду для роста микроорганизмов, причем каждый объем инокулируется в серию пробирок. Инокулят получают путем отбора последовательных разведений, результаты которого позволяют вычислить плотность исследуемых бактерий с помощью вероятностных расчетов.
Согласно изученным методам, подсчет общих и термотолерантных колиформ, а также E. coli методом наиболее вероятного числа проводится в четыре этапа:
Предположительный тест на общие колиформы: При использовании бульона лаурилсульфата триптозы наблюдение роста с образованием газа считается подозрительным (предположительным) на наличие колиформ. Наличие поверхностно-активного вещества в бульоне лаурилсульфата триптозы ингибирует рост грамотрицательных бактерий и способствует ферментации лактозы с выделением углекислого газа. Присутствие газа подтверждается с помощью пробирки Дюрама.
Подтверждение теста на общие колиформы: При использовании бульона бриллиантово-зеленой желчи (BGBB) наблюдается значительное развитие бактерий колиформной группы, что снова подтверждается образованием газа. Это происходит благодаря тому, что данный бульон является селективным из-за присутствия бычьей желчи и производного трифенилметанового красителя, который ингибирует рост грамотрицательных бактерий и спорообразующих ферментаторов лактозы. Этот этап исследования уменьшает вероятность ложноположительных результатов, вызванных активностью спорообразующих
бактерий и грамотрицательных ферментаторов лактозы. Наблюдение роста и образования газа в пробирках с бриллиантово-зеленой желчью подтверждает наличие общих колиформ.
Подтверждающий тест для термотолерантных колиформ: Этот метод использует бульон Escherichia coli (EC), содержащий лактозу, что является селективной средой благодаря наличию смеси фосфатов, поддерживающих pH среды. Селективность обусловлена желчными солями, которые ингибируют рост грамотрицательных микроорганизмов. Если в этих условиях происходит образование газа, наличие термотолерантных колиформ подтверждается. Положительные результаты на E. coli подозрительны на присутствие E. coli.
Подтверждающий тест для E. coli: Этот метод использует агар с эозином и метиленовым синим, что является селективной дифференциальной средой, которая позволяет отличить E. coli от других термотолерантных колиформ. Если наблюдается рост типичных колоний E. coli на этом агаре, эти колонии изолируются для биохимического подтверждения с помощью тестов на индол, метиловый красный, теста Фогеса-Проскауэра и цитрат (IMViC).
2) Метод подсчета дрожжей и плесени.
Плесени — это многоклеточные нитчатые грибы, которые могут присутствовать в почве, воздухе, воде и разлагающихся органических веществах. Как правило, они являются аэробами и менее требовательны, чем дрожжи, к влажности, pH, температуре и питательным веществам. Плесени могут использовать любой источник углерода, содержащийся в пище, а в качестве источника азота — нитрат, аммиак или органический азот. Они растут на поверхности меда только при контакте с воздухом, так как мед богат углеводами и кислотами.
Дрожжи — это нефиламентозные грибы, имеющие одноклеточную форму, которая может быть сферической, овальной, цилиндрической или треугольной. Обычно они распространяются ветром, воздушными потоками и через насекомых. Для их роста требуется больше влаги, чем для плесени, но меньше, чем для бактерий, с оптимальной температурой роста около 25-30°C.
Рост осмофильных дрожжей, которые являются важной частью микробиоты меда, усиливается при наличии жидкой среды, так как она создает благоприятные условия для анаэробных условий, необходимых для ферментации. При этом дрожжи используют сахар как источник энергии, превращая его в спирт, когда активность воды достигает хотя бы 0,65. Согласно исследованию Питта и Хокинга, большинство осмофильных дрожжей принадлежат к роду Zygosaccharomyces, включая Z. гада^ Z. bailii и Z. bisporus. Для контроля этих микроорганизмов в меде необходимо применять хорошие гигиенические практики и следить за тем, чтобы активность воды или содержание влаги находились в допустимых пределах. Когда мед извлечен из улья и имеет активность воды ниже 0,60, размножение осмофильных дрожжей не происходит
Подсчет жизнеспособных грибков применим к меду, так как он является кислым продуктом с pH ниже 4,5 и относительно низким содержанием влаги. Грибы слабо зависят от колебаний pH в диапазоне от 3,0 до 8,0. Плесени могут расти при pH ниже 2,0, а некоторые дрожжи — при pH ниже 1,5. Когда pH отклоняется от оптимального значения, которое обычно близко к 5,0, скорость роста колоний снижается, и если присутствуют другие факторы ингибирования, такие как активность воды или температура, их влияние на рост становится еще сильнее.
Высокий уровень грибков в меде может свидетельствовать о различных проблемах, например, о плохих санитарных условиях оборудования или о размножении грибков в продукте из-за ошибок в процессе производства и/или хранения. Согласно резолюции MERCOSUL GMC № 15 от 1994 года, в которой утверждены Технические регламенты по идентификации и качеству меда, мед должен быть свободен от неорганических или органических загрязнителей, таких как насекомые, личинки и песчинки, и не должен превышать максимально допустимые уровни микробиологического загрязнения или токсичных отходов. Его подготовка должна проводиться в соответствии с общими принципами гигиены пищевых продуктов, рекомендованными Комиссией Кодекс
Алиментариус (FAO/WHO). Что касается грибков, в меде допускается до 100 колониеобразующих единиц на грамм (КОЕ/г).
Метод подсчета основан на проверке способности микроорганизмов развиваться на культуральных средах с pH около 3,5 и температурой инкубации 25 ± 1°C. Использование подкисленных сред избирательно способствует росту грибков, ингибируя большинство бактерий, присутствующих в меде.
Процесс подготовки питательных сред: разбавляют среду картофельного декстрозного агара (PDA); нагревают на водяной бане до температуры 46-48°C; подкисливают среду до pH 3,5, добавляют 1,5 мл 10%-ного раствора винной кислоты на каждые 100 мл среды; наливают 15-20 мл в чашки Петри; после застывания на ровной поверхности; перед использованием высушивают их, оставив полуоткрытыми, в сушильной камере при 50°C на 15 минут или под ламинарным потоком на время, достаточное для полного высыхания поверхности.
Подготовка образца: 25 г образца помещаются в асептическую камеру и готовят разведения: 225 мл 0,1%-ной пептонной воды и перемешивают, получив первое разведение (10_1). Для второго разведения (10~2) перенесите 10 мл первого разведения в 90 мл 0,1%-ной пептонной воды и для третьего разведения (10~3) повторяют тот же процесс.
Наносят по 0,1 мл каждого разведения на поверхность чашек Петри с картофельным декстрозным агаром или агаром с дихлоран-глицеролом. С помощью шпателя Дригальски или стерильной стеклянной палочки в форме хоккейной клюшки равномерно распределяют инокулят по поверхности агара до полного впитывания.
Инкубируют при 25°C в течение 5 дней, не переворачивая чашки Петри, укладывают их стопками не более трех чашек в темноте. По окончании инкубации проверяют наличие колоний дрожжей и плесени, посчитывают их и выполняют необходимые расчеты.
Выбирают чашки Петри с 15-150 колониями и используют счетчик колоний. В выбранной чашке отдельно подсчитывают и фиксируют колонии с
нитевидным внешним видом, характерным для плесени, подсчитывают другие колонии, которые могут быть дрожжами или бактериями, которые способны к росту. Проверяют морфологию клеток под микроскопом, чтобы определить, являются ли они дрожжами, бактериями или их смесью. Колонии, содержащие дрожжи или их смесь с бактериями, считаются подтвержденными.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
1. Andrews WH, Flowers RS, Silliker J, Bailey JS. Salmonella. In: Downes FP, Ito K, editors. Compendium of methods for the microbiological examination of foods. 4th ed. Washington, DC: American Public Health Association; 2001. pp.357-380;
2. Techniques for the Evaluation of Microbiological Quality in Honey;
3. Управление качеством продуктов питания федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «керченский государственный морской технологический университет»;
4. Основы санитарно-гигиенического контроля в пищевой промышленности министерство образования и науки Российской Федерации университет ИТМО;
5. Silva N, Junqueira VCA, Silveira NFA. [Manual methods of microbiological analysis of food, in Portuguese].Manual de métodos de analise microbiologica de alimentos. Sâo Paulo: Varela; 1997. 259 p.
Gamolin I.S., Sochinskaya O.N.
Gamolin I.S.
Don State Agrarian University (Persianovsky, Russia)
Scientific advisor: Sochinskaya O.N.
Don State Agrarian University (Persianovsky, Russia)
METHODS FOR ASSESSING MICROBIOLOGICAL QUALITY OF HONEY
Abstract: the article examines methods for evaluating the microbiological characteristics of honey to identify its flora and control in this product. Honey is a product rich in simple sugars, minerals, vitamins and bioactive compounds. However, having physical and chemical properties unfavorable for the growth of microflora, honey can contain a large population of microorganisms.
Keywords: microbiological quality, honey, MPN method, antimicrobial activity, microscopy, contamination of honey, hygienic practices, bacterial spores, lactose fermentation, laboratory analysis.
