CC BY
61
§ Методы оценки эффективности биоцидной
з обработки материалов
\r::i
Q *Обухов Ю.И., 2Разуваев А.В.
^ ¡ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения», Минздравсоцразвития
ф России, Москва
§ 2ЗАО «КорХимКолор», Москва
VO О
Methods of Evaluating Biocide Treatment of Materials Efficacy
1Obukhov Y.I., 2Razuvaev A.V.
1Federal State Budgetary Institution «Scientific Center for Expertise of Medical Application Products», Ministry of Health and Social Development of the Russian Federation 2CJSC «CorChemColour», Moscow
В статье описаны методы качественной и количественной оценки биоцидной обработки материалов. Сделан акцент на применение разных методов оценки с учетом используемых для обработки антимикробных препаратов (мигрирующие, немигрирующие). Даны критерии оценки результатов исследований. Отмечено, что при использовании мигрирующих препаратов приемлемы классические качественные диффузионные методы исследования и количественные методы с разведением. В случае использования немигрирующих препаратов применяются счетные методы с обязательным шюттелированием. Ключевые слова: биоцидная обработка, методы оценки эффективности обработки, мигрирующие и немигрирующие биоцидные препараты.
Библиографическое описание: Обухов Ю.И., Разуваев А.В. Методы оценки эффективности биоцидной обработки материалов // Биопрепараты. - 2011. - № 3. - С. 32-35.
The following article describes the methods of quantitative and qualitative assessment of biocide treatment of materials. The emphasis was laid on using different methods of assessment, taking into consideration antimicrobial preparations, used for treatment (migrating and non-migrating). Assessment criteria are also represented in the article. It is mentioned that when using migrating preparations, classic quantitative diffusion methods of analysis and quantitative methods with dilution. In case of using non-migrating preparations counting methods with obligatory shaking are applied.
Key words: biocidal handling, efficacy evaluation methods, migrating and non-migrating biocides, methods of biocide treatment evaluation.
Bibliographic description: Obukhov Y.I., Razuvaev A.V. Methods of evaluating biocide treatment of materials efficacy/Biopreparats (Biopharmaceuticals). - 2011. - № 3 - P. 32-35. v J
Для корреспонденции:
Обухов Ю.И. - начальник управления экспертизы противобактериальных МИБП ЦЭК МИБП ФГБУ «НЦЭСМП» Адрес: ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения», Минздравсоцразвития России 119002, Москва, пер. Сивцев Вражек, 41, microbiolog58@mail.ru Статья поступила l0.08.2011 г, принята к печати 25.08.2011 г
Проблема пиодермий (гнойничковых заболеваний кожи) актуальна и в XXI в. Заболевания кожи, обычно, вялотекущие и кроме физических страданий причиняют больному моральные, так как в отличие от других заболеваний, они имеют внешние проявления, заметные для окружающих.
К пиодермиям относятся заболевания кожи различной этиологии. Первопричиной их чаще всего являются стафило- и стрептококки, значительно реже другие микроорганизмы (протей, синегнойная или кишечная палочка и др.).
Среди факторов, способствующих возникновению патологического процесса, выделяют экзогенные (микротравматизм, потертости, повреждение эпидермиса растворами кислот и щелочей, запыленность
воздуха, высокая или низкая температура окружающей среды) и эндогенные (психоэмоциональные перенапряжения, нарушение обмена углеводов, патология желудочно-кишечного тракта и печени, гипергидроз, себорея, гиповитаминозы, несбалансированное питание, угнетение иммунного статуса). Пиодермии могут быть самостоятельными заболеваниями или осложнениями таких распространенных дерматозов, как, например, чесотка, педикулез или экзема [1].
Несмотря на улучшение качества жизни, гигиенического воспитания, соблюдение правил личной гигиены, заболеваемость ими остается высокой, без видимой тенденции к снижению, особенно в организованных коллективах. Одним из дополнительных факторов снижения кожной заболеваемости, наряду со специфиче-
ОРЕПАРАТЫ
ским лечением, является ношение нательного белья, носков, обуви, использование постельного белья с антимикробной обработкой.
Проблема качества антимикробной (биоцидной) обработки материалов, контактирующих с кожей человека, требует выбора методов проверки такой обработки. Цель данной статьи ознакомить читателей с современными методами оценки эффективности биоцидной обработки материалов.
Оценить качество биоцидной обработки может микробиологическая лаборатория, имеющая санитарно-эпидемиологическое заключение на право работы с возбудителями инфекционных заболеваний III - IV групп патогенности и аккредитованная на данный вид деятельности. Исследования с целью сертификации могут проводить лаборатории, специально аккредитованные на проведение сертификационных испытаний.
Перед началом проведения исследований специалисты микробиологи должны выяснить тип препарата, с помощью которого проведена обработка материала (мигрирующий или немигрирующий). От этого зависит выбор метода исследования. Мигрирующие препараты - препараты не закрепленные ковалентными связями с обрабатываемым материалом, свободно перемещающиеся из материала в окружающую среду. Немигрирующие препараты - препараты закрепленные ковалентными связями с обрабатываемым материалом, длительное время способные удерживаться на этом материале.
На практике применяется несколько методов контроля эффективности обработки на каком-либо определенном материале, в зависимости от самого субстрата, типа биоцидного препарата, вида микроорганизмов и конечных требований к изделию по биоцидной защите. В России, как и в других странах, существуют нормы и стандарты качественной и количественной оценки эффективности антимикробной обработки [2, 3].
Тесты на антимикробное и противогрибковое действие делятся на три основные группы:
• диффузионные или качественные (с использованием агара) - только для мигрирующих биоцидных препаратов,
• количественные (с использованием жидких питательных сред и разведений препарата),
• счетные ("count test") - в основном для ковалентно зафиксированных биоцидных препаратов.
Качественные (диффузионные) тесты, проводимые в слое агара, дают представление о качестве обработки материалов препаратами с антимикробным или противогрибковым эффектом. Исследуется степень подавления роста испытуемых микроорганизмов (бактерий или грибков). Пробы испытуемого материала (кусочки тканей размером 2x2 см) выкладываются на чашки Петри с питательным агаром, контаминирован-ным тест-микроорганизмом (108 м.к./мл). Чашки с агаром культивируются в термостате при 37°С в течение 24 - 48 ч. Контролем служат образцы тканей, не содер-
жащие антимикробных компонентов. Оценка качества антимикробной обработки испытуемого материала проводится по степени подавления роста бактерий или грибков на питательном агаре, измеряемой от края образца до границы роста микроорганизма, выраженная в миллиметрах. Показатель эффективности оценивается по зоне задержки роста, величина которой должна быть не менее 4 мм. Зона задержки роста микроорганизмов вокруг образцов зависит от степени диффузии антимикробных препаратов в слой питательного агара. Поэтому данная методика применима только для мигрирующих препаратов, не закрепленных на волокне ковалентными связями [3].
Количественный метод оценки эффективности обработки материалов мигрирующими препаратами основан на исследовании их действия (в той или иной степени разведения) на штаммы контрольных микроорганизмов. С этой целью готовится ряд разведений испытуемого препарата, а затем в каждую пробирку (флакон) с разведением вносят по 2 зараженных тест-объекта на каждую экспозицию. Экспозиция может составлять от 5 мин до 1 ч (в зависимости от препарата и его концентрации). По истечении времени экспозиции стерильным пинцетом извлекают по 2 тест-объекта и опускают в раствор нейтрализатора или стерильной водопроводной воды. В качестве нейтрализатора используют: для окислителей (хлор, йод, перекись, озон) - 0,5 - 1,0% растворы тиосульфата натрия; для альдегидсожержащих и фенолсодержащих средств -воду; для поверхностно-активных веществ - 0,1 - 1,0% растворы сульфонола; для композиционных средств -универсальный нейтрализатор, содержащий твин-80 -3%, гистидин - 0,1%, сапонин - 3% и цистеин - 0,1%.
Через 5 мин тест-объекты переносят во вторую пробирку (флакон) со стерильной водопроводной водой. Затем через 5 мин каждый тест-объект помещают в пробирку с жидкой питательной средой (мясопептон-ный бульон, питательный бульон, сахарный бульон). Контролем служат 2 тест-объекта, не подвергавшихся действию дезинфектанта. Посевы термостатируют при температуре 37°С в течение 24 ч. Результаты учитывают по отсутствию роста микроорганизмов в пробирках с жидкой питательной средой. Концентрацию препарата, оказывающего биоцидное действие, определяют по последней пробирке (флакону) в которой отсутствует рост микроорганизмов [2, 3]. Классические диффузионные методы неприемлемы для оценки эффективности немигрирующих препаратов.
Счетные тесты дают возможность оценить эффективность антимикробной обработки материалов немигрирующими препаратами. Эти тесты служат для определения задержки роста микроорганизмов на конкретном материале. Количество микроорганизмов подсчитывают после 6 - 24 ч культивирования, и сравнивают с числом микроорганизмов в начале теста. Для подсчета числа колоний микроорганизмов создают ряды разведений. Учитывая, что этот тест довольно трудоемкий он применяется лишь в тех случаях, когда неприменим качественный тест. Контроль качества
С33
биоцидной обработки с использованием счетных тестов в микробиологических лабораториях осуществляется с применением следующих международных стандартов:
• антимикробного действия (стандарты SN 195920, AATCC 147, JIS L 1902, ASTM E 21-49) [4];
• противогрибковой эффективности стандарты SAN BIO 12/94, AATCC 30, ASTM G 21-96, EN ISO 11721-1) [5];
• активности против водорослей (стандарт SAN BIO 33/99) [6];
• степени защиты от пылевого клеща (стандарты HPLC, NF G 39-011) [7];
• проверка противогнилостной активности («Похоронный тест» EN ISO 11721-1) [8].
Счетный метод (count test) контроля антимикробного действия (японский JIS L 1902, метод со встряхиванием DuPont ASTM E 21-49) заключается в следующем:
Измельченные образцы тест-объекта (материал с обработкой немигрирующим препаратом) и контрольного тест-объекта (необработанный материал) весом 2 г помещаются в пробирки с питательным бульоном, содержащим определенное количество микроорганизмов Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк) и Escherichia rnli (кишечная палочка) в виде суспензий с различной исходной концентрацией: 109, 107, 105. Испытания проводятся при непрерывном встряхивании (с использованием шюттеля или шейке-ра) герметично закрытой пробирки при комнатной температуре в течение 24 ч. Это позволяет разорвать ковалентные связи препарата с материалом. Через 24 ч отбирают по 1 мл взвеси и проводят серийные разведения в 100, 1000, 10 тыс. и 100 тыс. раз до тех пор, пока количество колоний будет доступно для подсчета. Затем осуществляют посевы на твердые питательные среды и термостатируют при температуре 37° С в течение 48 ч.
Через 48 ч производят подсчет колоний в КОЕ/мл (КОЕ - колониеобразующая единица). Полученное значение умножается на степень разведения и сравнивается с исходным количеством микроорганизмов. Снижение микробного обсеменения питательного бульона оценивается в процентах по отношению к исходной микробной нагрузке в суспензии и сравнивается с аналогичным показателем контрольного тест-объекта.
Оценка результатов тестирования проводится в баллах по следующей шкале:
0,0 - 0,1% - значительный рост, отсутствие антимикробного эффекта.
0,1 - 90% - незначительное снижение количества колоний микроорганизмов, недостаточное антимикробное действие.
90 - 95% - значительное снижение количества колоний микроорганизмов, хороший антимикробный эффект.
95 - 99% - значительное снижение количества колоний микроорганизмов, очень хороший антимикробный эффект.
99% и более - сильное снижение количества коло-
э
ний микроорганизмов, отличный антимикробный эффект [9].
Диффузионный метод проверки противогрибкового действия (SAN BIO 12/94, швейцарский SN 195 920). Подготовка чашек Петри с раствором агара проводится точно так же, как в диффузионном методе проверки антимикробного действия, но вместо штаммов бактерий вносятся стандартные споры грибов: Aspergillus niger, Candida albicans, Cladosporium sphaerospermum, Trichophyton mentagrophytes. Затем проводится встряхивание и термостатирование. Candida albicans остаются в термостате 2 сут, Trychophyton mentagrophytes, Aspergillus niger и Cladosporium sphaerospermum 7 сут при температуре (28 ± 1)°С. Оценка проводится аналогично, как в диффузионном методе проверки антимикробного действия.
Метод проверки противогрибкового действия (ASTM G 21-96) отличается от предыдущего метода тем, что не используется питательная среда, а споры грибков распыляются по поверхности материала, находящегося в чашке Петри. В данном случае инкубация проводится 28 сут при температуре (28 ± 1)°С.
Метод проверки противогнилостной активности («Похоронный тест» EN ISO 11721-1) проводится с целью испытать сопротивляемость обработанного материала к действию микроорганизмов, содержащихся в почве. Пробы испытуемого материала закапываются в биологически активную землю, содержащую природный спектр микроорганизмов, на 4 нед. и регулярно смачиваются. После чего определяется потеря веса и потеря разрывной нагрузки по сравнению с исходным образцом.
Оценка антимикробной активности проводится в соответствии с [2, 3]. Для количественной оценки антимикробной активности исследуемых материалов так же используется капельный метод заражения образцов.
На тест-объект размером 2x2 см наносят пипеткой 0,1 мл суспензии 18-часовой культуры (золотистый стафилококк, кишечная палочка). В указанном объеме суспензии должно содержаться 104 м.к. по стандартному образцу мутности (ОСО 42-28-85П). После контакта в течение 10, 20, 30, 40, 50, 60 мин тест-объекты отмывают в течение 5 мин в широких пробирках с бусами и 10 мл стерильной водопроводной воды или раствора соответствующего нейтрализатора (для дифференцирования бактерицидного или бактериостатического действия) и засевают в чашку Петри в толщу МПА по 0,5 и 1 мл. Учет результатов проводят через 24 - 48 ч, сравнивают количество выросших микроорганизмов в посевах смывной жидкости с антимикробных и контрольных образцов, высчитывают процент гибели тест-микроорганизмов.
Пример расчета: в посевах смыва с контрольного образца выросло, соответственно внесенному в агар количеству смывной жидкости, 56 и 100 колоний микроорганизмов, среднее количество м.к. в 1 мл -106, в посевах смыва с образца антимикробной ткани -4 и 10, среднее - 9.
Количество клеток, выросших в контроле, принима-
ПРЕПАРАТЫ
ют за 100%, в опыте - за Х%. Определяют значение Х, т.е. процент выросших колоний с антимикробной ткани:
106 - 100%
9 - Х%
Х = (9 х 100) : 106 = 8,49.
Высчитывают процент гибели: 100% - 8,49% = 91,51%.
Снижение числа тест-микроорганизмов при капельном способе заражения антимикробных тканей должно достигать не менее 90 - 95%.
Метод аэрозольного заражения тест-образцов имитирует естественное инфицирование образцов.
Используют 18-часовую бульонную культуру золотистого стафилококка, в которой содержится 1,5-2 млрд. жизнеспособных клеток в 1 мл. В качестве генератора аэрозолей применяют распылитель А.А. Смородинцева. На дно аэрозольной камеры (объем 1 м3) помещают тест-объекты испытуемых материалов размером 2х2 см, распыляют 3 мл бульонной культуры. Через 16 - 18 ч после распыления определяют количество выживших микроорганизмов на тест-объекте путем отмыва в стерильной водопроводной воде с последующим высевом на питательные среды и учетом результатов (см. выше).
Снижение числа тест-микроорганизмов при аэрозольном способе заражения антимикробных тканей должно составлять не менее 70%.
Суспензионный метод позволяет определить зависимость антимикробной активности тканей от микробной нагрузки.
В пробирки с 1 мл мясопептонного бульона (рН 7,2 -7,4), содержащие 10-кратно уменьшающееся количество клеток (109, 108, 107, 106, 105, 104, 103 м.к./мл) тест-культур (золотистый стафилококк, кишечная палочка) помещают тест-объект исследуемого материала размером 1 см2. Учет результатов производят после 24 ч инкубации посевов в термостате при 37° С, констатируя отсутствие роста в пробирках с максимальным
Литература:
1. Шапошников О.К., Павлов С.Т. и др. Кожные и венерические болезни. - М., 1985 г.
2. Методические указания по лабораторной оценке антимикробной активности текстильных материалов, содержащих антимикробные препараты. - М., ВНИИДиС, 1984 г.
3. Методы испытаний дезинфекционных средств, для оценки их безопасности и эффективности. Утверждены Главным государственным санитарным врачом. - М., 1998 г.
числом внесенных клеток тест-культур.
Определение эффективности антимикробной обработки материалов суспензионным методом осуществляется по росту микроорганизмов в пробирках с образцами опытных материалов, микробная нагрузка которых не ниже 105 м.к./мл.
Авторами проведены собственные сравнительные исследования возможности оценки эффективности биоцидной обработки материалов немигрирующими препаратами. В результате отмечено, что определить биоцидный эффект данных материалов возможно только с использованием счетных тестов со встряхиванием.
Выводы:
1. Оценить качество обработки материала биоцид-ными препаратами может микробиологическая лаборатория, имеющая санитарно-эпидемиологическое заключение на право работы с возбудителями инфекционных заболеваний III - IV групп патогенности и аккредитованная на данный вид деятельности. Исследования с целью сертификации могут проводить лаборатории, специально аккредитованные на проведение сертификационных испытаний.
2. Перед началом проведения исследований специалисты микробиологи должны выяснить тип препарата, с помощью которого проведена обработка материала (мигрирующий или немигрирующий). От этого зависит выбор метода исследования.
3. В случае использования мигрирующих препаратов приемлемы классические качественные диффузионные методы исследования и количественные методы с разведением.
4. В случае использования немигрирующих препаратов применяются счетные методы с обязательным шюттелированием (встряхиванием) в течение 24 ч.
4. Стандарты SN 195920, AATCC 147, JIS L 1902, ASTM E 21-49.
5. Стандарты SAN BIO 12/94, AATCC 30, ASTM G 21-96, EN ISO 11721-1.
6. Стандарт SAN BIO 33/99.
7. Стандарты HPLC, NF G 39-011.
8. Тест EN ISO 11721-1.
9. Счетный метод (count test) контроля антимикробного действия (японский JIS L 1902, метод со встряхиванием DuPont ASTM E 21-49).
