CC BY
424
УДК 619:636.085.3
МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКОТОКСИНОВ В СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ ПРОДУКЦИИ И КОРМАХ
Д.С. Буклагин, доктор технических наук ФГБНУ «Росинформагротех» E-mail: d.buklagin@yandex.ru
Аннотация. Возрастающие требования к качеству продукции сельского хозяйства обуславливают необходимость развития и применения современных методов контроля безопасности продукции сельского хозяйства и кормов. Поэтому выявление и анализ методов и средств контроля безопасности сельскохозяйственной продукции и кормов в процессе производства, переработки и хранения является актуальной задачей. Дан анализ основных методов оценки биологически активных веществ в сельскохозяйственной продукции и кормах. Использовался метод информационно-логического анализа отечественной и зарубежной научно-технической информации, а также материалы изучения рынка технологий и средств измерения микотоксинов в сельскохозяйственной продукции и кормах. Микотоксины являются биологическими контаминантами - природными загрязнителями микроскопическими плесневыми грибами зерна злаковых, бобовых, семян подсолнечника. Показано, что в основе современных систем определения мико-токсинов (охратоксина А, афлатоксина В1, зеараленона и др.) лежат методы высокоэффективной жидкостной хроматографии, тонкослойной хроматографии и иммуноферментного анализа. Для определения микотоксинов в сельскохозяйственной продукции и кормах получили развитие физико-химические методы анализа. В качестве подтверждающего метода наибольшее распространение получили методы высокоэффективной жидкостной хромотографии, в качестве скрининговых методов - методы тонкослойной хроматографии, трехфазного иммуноферментного анализа и иммунохимические методы. Ключевые слова: сельскохозяйственная продукция, корма, микотоксины, измерение, показатель, тест-системы, качество.
Введение. Научно-технологическое развитие требует создания и внедрения конкурентоспособных отечественных технологий, основанных на развитии селекции, генетики, производстве пестицидов и агрохимикатов биологического происхождения, развития систем контроля качества сельскохозяйственной продукции, сырья и продовольствия [1,2].
Для сельскохозяйственного производства характерны постоянное возрастание требований к безопасности выпускаемых продуктов и кормов, ужесточение методов контроля, тенденция к использованию количественных критериев при оценке качества.
Контроль безопасности продукции растениеводства - это получение информации о состоянии объекта контроля и сопоставление полученных результатов с существующими требованиями санитарных правил и норм, гигиенических нормативов к содержанию опасных веществ в реализуемой растениеводческой и животноводческой продукции.
К основным показателям безопасности зерна относятся:
- органолептические (цвет, состояние, запах - головневый, плесневый, полынный, затхлый, солодовый, посторонний);
- примеси (минеральная, вредная, метал-ломагнитная);
- зерно испорченное, головневое, маранное, синегузочное, фузариозное;
- зараженность вредителями в явной и скрытой формах;
- загрязненность вредителями;
- наличие токсичных элементов (свинец, мышьяк, кадмий, ртуть);
- микотоксины (афлотоксин В1, дезокси-ниваленон, Т-2 токсин, зеараленон, охроток-син);
- пестициды (гексахлорциклогексан), ДДТ и его метаболиты, бенз(а)пирен, нитра-замины, радионуклиды (цезий-137) и др.
Микотоксины являются биологическими контаминантами - природными загрязнителями микроскопическими плесневыми гри-
бами зерна злаковых, бобовых, семян подсолнечника, которые вызывают отравление у животных вследствие поедания кормов, загрязненных микотоксинами. Они вызывают иммунодепрессии животных, что приводит к различным инфекционным заболеваниям, снижению продуктивности, повреждению внутренних органов, язвенному стоматиту и другим болезням [3]. Поэтому выявление и анализ методов и средств контроля безопасности сельскохозяйственной продукции и кормов является актуальной задачей.
Цель исследования. Дать анализ основных методов определения микотоксинов в сельскохозяйственной продукции и кормах.
Материалы и методы. Использовался метод информационно-логического анализа отечественной и зарубежной научно-технической информации, а также материалы изучения рынка технологий и средств измерения микотоксинов в сельскохозяйственном сырье и кормах.
Результаты и обсуждение. В настоящее время известно около 300-400 микотоксинов, которые могут образовываться как до, так и после сбора урожая, накапливаться при хранении, поэтому необходим постоянный мониторинг содержания токсичных микотокси-нов в пищевых продуктах и кормах для животных [5]. Наиболее распространенными микотоксинами, представляющими опасность для здоровья человека и животных, являются афлатоксины, Т-2 токсин, зеарале-нон, охратоксин А, дезоксиниваленол (ДОН), фумонизины. Эти вещества достаточно устойчивы к воздействиям окружающей среды и не разрушаются даже при термической обработке [6].
В соответствии с системой ХАССП при оценке риска, обусловленного наличием ми-котоксинов, в процессе производства и потребления зерна и комбикормов было выделено 7 критических контрольных точек, на которых необходимо предпринимать меры для предотвращения контаминации: состояние и качество семян; качество обработки почвы; период прорастания; уборка урожая; период после уборки урожая; хранение и переработка. Для того, чтобы избежать загряз-
нения зерна и кормов микотоксинами, необходимо тщательно придерживаться технологических норм в первых шести критических контрольных точках. Если загрязнение все-таки произошло, то следует принять меры по обеззараживанию (деконтаминации) зерна и кормовых субстратов до использования и по профилактике микотоксикозов животных при использовании токсичных кормов [3].
Микотоксины синтезируются различными грибами. В основе механизма токсического действия лежит способность ингиби-ровать синтез белка. Большинство изученных микотоксинов образуются в результате деятельности плесневых грибов трех родов: Aspergillus, Pénicillium и Fusarium. Основные виды микотоксинов, вызывающие токсикозы у крупного рогатого скота, включают афлак-токсины, Т-2 токсин, фумонизины, зеарале-нон, охратоксины и дизоксиниваленон. Например, афлатоксин B1 продуцируют грибы Aspergillus flavus и Aspergillus _parasiticus, ох-ратоксин вырабатывается грибами родов As-pergillus и Pénicillium, зеараленон синтезируется грибами из рода Fusarium (F. Graminea-rum, F. tricinctum) [3, 7]
В основе контроля качества и безопасности продукции растительного и животного происхождения лежат нормативы содержания различных компонентов и показатели безопасности продовольственного сырья и пищевой продукции, предусмотренные нормативными правовыми актами (технические регламенты, ГОСТы, ТУ, МУ и др.), обеспечивающие необходимую периодичность контроля, использование соответствующих методов определения, методик выполнения измерений и оценку достоверности полученных результатов. Оценка качества и безопасности продукции осуществляется аккредитованными в законодательном порядке научно-исследовательскими институтами, межобластными лабораториями и референтными центрами системы «Россельхознадзора» [8].
Техническим регламентом Таможенного союза «О безопасности зерна» установлены предельно допустимые уровни содержания микотоксинов в зерне, поставляемом на пищевые и кормовые цели (таблицы 1, 2) [9].
Таблица 1. Предельно допустимые уровни микотоксинов в зерне, поставляемом на пищевые цели
Наименование продукции Показатели Допустимые уровни, мг/кг, не более Примечание
Злаковые культуры (пшеница, рожь, тритикале, овес, ячмень, просо, гречиха, рис, кукуруза, сорго) Афлатоксин В1 0,005
Дезоксинива-ленол 0,7 1,0 Пшеница Ячмень
Т-2 токсин 0,1
Зеараленон 1,0 Пшеница, ячмень, кукуруза
Охратоксин А 0,005 Пшеница, ячмень, рис рожь, овес
Фумонизин 4,0 Кукуруза (сырая)
Зернобобовые культуры (горох, фасоль, нут, чечевица, бобы, маш, чина Афлатоксин В1 0,005
Масличные культуры (подсолнечник, соя, хлопчатник, лен, рапс, горчица, кунжут, арахис) Афлатоксин В1 0,005
Таблица 2. Предельно допустимые уровни мико-токсинов в зерне, поставляемом на кормовые цели
Наименование Показатели Допустимые уровни, мг/кг, не более
Злаковые (пшеница, ячмень, овес, рожь, тритикале, просо, сорго, кукуруза) Афлатоксин В1 0,02
Охратоксин А 0,05
Т-2 токсин 0,1
Дезоксиниваленол 1,0
Зеараленон 1,0
Фумонизин 5,0 (Кукуруза)
Сумма афлотоксинов В1, В2, G1, G2 0,02
Зернобобовые культуры (горох, люпин, кормовые бобы, вика, фасоль, нут, чечевица, чина) Афлатоксин В1 0,02
Охратоксин А 0,05
Т-2 токсин 0,1
Дезоксиниваленол 1,0
Зеараленон 1,0
Сумма афлотоксинов В1, В2, G1, G2 0,02
Масличные культуры (подсолнечник, соя, рапс) Афлатоксин В1 0,02
Охратоксин А 0,05
Т-2 токсин 0,1
Дезоксиниваленол 1,0
Зеараленон 1,0
Особую опасность представляют мико-токсины, которые могут развиваться на поверхности зерна при неблагоприятных условиях хранения. Такие микотоксины, как аф-латоксины и охратоксины, поражают печень и обладают выраженным канцерогенным действием [10].
ВНИИ зерна и продуктов его переработки (ВНИИЗ) совместно с Институтом питания РАМН разработаны предложения по содержанию дезоксиниваленола (ДОН) в зерне и зернопродуктах; при этом нормы более жесткие, чем в ЕС (таблица 3) [11].
Во ВНИИЗ разработаны нормы допустимого содержания микотоксинов в зерне и зернопродуктах с помощью дифференцированного подхода, принятого в ЕС [11].
Таблица 3. Нормирование дезоксиниваленола _в зерне и зернопродуктах_
Продукты Предельно допустимый уровень, мг/кг
ЕС РФ
Неподработанное зерно твердой пшеницы, овса и кукурузы 1,75 -
Неподработанное зерно прочих культур 1,25 0,7-пшеница 1,0-ячмень
Мука, крупа, отруби, зародыш 0,75 0,7-из пшеницы 1,0-из ячменя
Макаронные изделия 0,75 0,7
Хлеб, кондитерские изделия 0,50 0,7
Продукты детского питания 0,20 0,05
Ориентировочное содержание микоток-синов в продуктах помола устанавливается путем перемножения их содержания в исходном зерне на соответствующий ориенти-
ровочный коэффициент и сопоставляется с действующим ограничительным нормативом (таблица 4). На этой основе разработан уровень ПДК зеараленона в муке и крупе.
Так как химические методы анализа качества готовой продукции и сельскохозяйственного сырья достаточно трудоемки, занимают много времени, требуют специальных реактивов и квалифицированных специалистов-аналитиков, в настоящее время все шире применяются инструментальные (физико-химические) методы анализа, в том числе - для определения микотоксинов в сельскохозяйственной продукции и сырье.
Для определения содержания микотокси-нов наиболее часто используются хромато-графические методы (газожидкостная хроматография совместно с масс-спектрометрией, высокоэффективная жидкостная хроматография с УФ-спектрометрической, флуорес-центой или масс-спектрометрической детекцией) с различными вариантами пробопод-готовки [6], а также более экономичные скрининговые методы.
Применение метода высокоэффективной жидкостной хроматографии обеспечивает высокую точность результатов, позволяет определять несколько микотоксинов одного или разных классов, используется в качестве подтверждающего метода, но требует наличия квалифицированных кадров и дорогостоящего оборудования [5]. Скрининг-методы отличаются быстротой и удобны для проведения серийных анализов, позволяют быстро и надежно разделять загрязненные и незагрязненные образцы. К ним относятся такие широко распространенные методы, как методы тонкослойной хроматографии (ТСХ) для одновременного определения до 30 раз-
личных микотоксинов, метод трехфазного иммуноферментного анализа (ИФА) и им-мунохимические методы (ИХМ), обладающие высокой селективностью благодаря применению специфических антител. Хотя скри-нинговые методы с использованием экспресс -тестов не столь точны, но позволяют оперативно определять наличие микотоксинов и оперировать большими выборками проб.
В последние годы для определения содержания микотоксинов активно применяются молекулярно-генетические методы. Из образца зерна делается мука, и из нее выделяется ДНК. В этом образце общей ДНК есть ДНК и растения, и вирусов, и бактерий, и грибов, которые там присутствуют. Современные методы позволяют определить, какое количество ДНК целевого объекта присутствует в этом образце общей ДНК [3].
Арбитражными методами количественного определения микотоксинов являются: газожидкостная хроматография (для Т-2 токсина); высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) с использованием УФ-фотометрического детектора (для дезоксини-валенола), с использованием флуоресцентного детектора (для афлатоксинов и зеаралено-на) [12]. Иммуноферментный анализ обычно используется для мониторинга наличия ми-котоксинов выше определенного уровня (или их отсутствия) в испытуемом образце.
Принципы хроматографии, получившие доминирующее развитие, весьма универсальны, благодаря чему они оказались пригодны для изучения объектов самой различной природы [13]. Хроматография - это метод разделения и определения веществ, основанный на распределении компонентов между двумя фазами - подвижной и неподвижной. Неподвижной (стационарной) фазой служит твердое пористое вещество (часто его называют сорбентом) или пленка жидкости, нанесенная на твердое вещество. Подвижная фаза представляет собой жидкость или газ, протекающий через неподвижную фазу, иногда под давлением. Приборы высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) позволяют определить в пищевых продуктах и кормах содержание
Таблица 4. Коэффициенты распределения микотоксинов
Продукт Микотоксины
ДОН Зеараленон Афлатоксины
Мука 2 сорта 0,5 0,3 1,3
Мука 1 сорта 0,5 0,2 0,5
Мука высшего сорта 0,5 0,1 0,2
Манная крупа 0,3 0,1 -
Отруби 3,1 2,3 3,3
микотоксинов, антибиотиков, алкалоидов, консервантов, гистамина и других токсичных компонентов.
В современной жидкостной хроматографии используют приборы различной степени сложности - от наиболее простых систем до хроматографов высокого класса, снабженных различными дополнительными устройствами для количественного измерения содержания каждого компонента. Высокоэффективная жидкостная хроматография - наиболее перспективный аналитический вариант классической колоночной хроматографии в современном приборостроении. Этот метод позволяет реализовать почти все механизмы разделения, применяемые в хроматографии. При этом, независимо от механизма разделения, подвижная фаза в ВЭЖХ - жидкость.
Хроматографические методы имеют следующие преимущества: значительно большая эффективность хроматографического разделения по сравнению со статическими методами сорбции и экстракции; возможность селективного разделения широкого круга веществ; на разделяемые вещества можно накладывать различные дополнительные поля (гравитационное, электрическое, магнитное и др.), которые расширяют возможности хроматографии [14].
В состав любого хроматографа входят пять обязательных составных частей:
а) насос для подачи подвижной фазы через колонку;
б) дозатор для введения пробы в колонку;
в) разделительная колонка - сердце хроматографа;
г) детектор - устройство для получения аналитического сигнала, пропорционального концентрации компонента;
д) система обработки - преобразователь аналитического сигнала в форму, удобную для восприятия человеком (или системой автоматического управления). Блочно-модуль-ный принцип построения позволяет производить комплектацию хроматографических систем для решения конкретных задач [15].
Для определения микотоксинов в сельскохозяйственной и пищевой продукции с использованием метода ВЭЖХ разработаны соответствующие ГОСТы и аттестованные методики выполнения измерений. Метод ВЭЖХ, предусмотренный действующими стандартами при определении микотоксинов в сельскохозяйственной продукции и кормах, представлен в таблице 5, методики его применения для измерения содержания различных микотоксинов, разработанные ЗАО «Аквилон», приведены в таблице 6 [8, 16].
Таблица 5. Действующие стандарты определения микотоксинов в сельхозпродукции и кормах
Стандарт Введение в действие
ГОСТ 28001-88 Зерно фуражное, продукты его переработки, комбикорма. Методы определения микотоксинов: Т-2 токсина, зеараленона (Ф-2) и охратоксина А. 01.01.1990
ГОСТ 30711-2001 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения содержания афлатоксинов В1 и М1» 2002-07-01
ГОСТ 31748-2012 Продукты пищевые. Определение афлатоксина В1 и общего содержания афлатоксинов В1, В2, G1 и G2 в зерновых культурах, орехах и продуктах их переработки. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии 2013-07-01
ГОСТ 31691-2012 Зерно и продукты его переработки, комбикорма. Определение содержания зеараленона методом высокоэффективной жидкостной хроматографии 2013-07-01
ГОСТ 32587-2013 Зерно и продукты его переработки, комбикорма. Определение охра-токсина А методом высокоэффективной жидкостной хроматографии 2015-07-01
ГОСТ 32251-2013 Корма, комбикорма. Метод определения содержания афлатоксина В1 2015-07-01
ГОСТ 33780-2016 Продукты пищевые, корма, комбикорма. Определение содержания афлатоксина В1 методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с применением очистки на оксиде алюминия. 2017-07-01
ГОСТ 31653-2012 Корма. Метод иммуноферментного определения микотоксинов 2013-07-01
ГОСТ 34140-2017 Продукты пищевые, корма, продовольственное сырье. Метод определения микотоксинов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием 2018-07-01
ГОСТ Р 52471-2005 Корма. Иммуноферментный метод определения микотоксинов 01.01.2007
Таблица 6. Методики выполнения измерений микотоксинов, разработанные ЗАО «АКВИЛОН»
Нормативный документ Название методики Определяемые компоненты Диапазоны измерений, мг/кг
ФР.1.31.2008.04629 Свидетельство №29-08 от 04.03.2008 Методика выполнения измерений массовой доли афлатоксинов В1. В2, в1, в2 в пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. В1 В2 Gl G2 0.0025 - 0,010 0.0005 - 0,010 0.005 - 0,02 0,0005 - 0,001
ФР.1.31.2008.04630 Свидетельство №32-08 от 04.03.08 Методика выполнения измерений массовой доли зеараленона в пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии Зеараленон 0,10 - 0,8
ФР.1.31.2008.04631 Свидетельство №33-08 от 04.03.08 Методика выполнения измерений массовой доли дезоксиниваленола в пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии Дезоксиниваленол 0,35 - 2,0
ФР.1.31.2012.13727 Свидетельство №42-09 от 21.08.09 Методика выполнения измерений массовой доли охратоксинаА в пищевых продуктах, продовольственном сырье и комбикормах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии Охратоксин А: зерно, зерновые, крупяные, зернобобовые, мука, масличные культуры, хлебобулочные и макаронные изделия, крупа, хлеб, орехи, комбикорма 0,0005 - 0,020
Метод тонкослойной хроматографии применяется для разделения, оценки чистоты и идентификации органических соединений. Он основан на применении пластин с нанесенной неподвижной фазой и подвижной фазой (растворитель). Идентификация анализируемого вещества проводится при одновременном внесении на пластину экстракта образца и стандартных растворов с известной концентрацией. Различные соединения в смеси продвигаются по пластине с различной скоростью вследствие различия в закономерностях их разделения между мобильной жидкой и неподвижной фазами. На этом принципе основано разделение веществ в смеси экстракта. Флуоресцирующие вещества выявляются в УФ-свете, все остальные - с помощью специфических реагентов.
Совершенствование метода путем уменьшения толщины слоя неподвижной фазы (до 100 мкм) и величины частиц (до 5 мкм) привело к более быстрому и лучшему разделению веществ. Этот метод получил название высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ). Методы тонкослойной хроматографии доступны почти для всех ми-котоксинов. Обнаружение и специфическая идентификация разработаны для каждого отдельного микотоксина с использованием молекулярных свойств или реакций трансформации веществ реагентов [17].
К недостаткам тонкослойной хроматографии относятся: малая производительность; концентрация анализируемого вещества должна быть в диапазоне 0,01-0,1%; использование токсичных и летучих веществ в качестве растворителя.
Наиболее распространенным скрининго-вым методом является твердофазный имму-ноферментный анализ (ИФА), основанный на высокоспецифичной реакции антиген-антитело, детектирование которой осуществляется за счет введения ферментативной метки с последующим ее выявлением с помощью соответствующего субстрата, изменяющего свою окраску. Твердой фазой в иммунофер-ментном анализе обычно служит поверхность лунки микропланшета [6].
Из-за разнообразия объектов, многообразия принципов связывания и условий проведения ИФА существует большое количество вариантов этого метода, имеющих как принципиальные, так и второстепенные отличия. Обычно рассмотрение методов ИФА осуществляется с позиций разделения на гетерогенные и гомогенные, т. е. по принципу проведения всех стадий анализа с участием твердой фазы или же только в растворе [8].
Метод ИФА (ELISA) относится к группе иммунохимических методов биохимического исследования и обладает определенными преимуществами:
- оперативность;
- высокая производительность (на одном планшете проводится несколько десятков анализов одновременно);
- простота пробоподготовки и проведения измерений;
- низкая стоимость анализа по сравнению с хроматографическими методами;
- малый объем тестируемого образца.
Иммуноферментный анализ обычно используется для мониторинга наличия мико-токсинов выше определенного уровня (или их отсутствия) в испытуемом образце.
Подавляющее большинство тест-систем для иммуноферментного определения содержания микотоксинов, представленных на рынке, выпускается иностранными фирмами: Ridascreen (компания R-Biopharm, Германия), Agra Quant (Romer Labs, Австрия), Ve-ratox (Neogen Corporation, США), ELISA Kit
и Test Kit (Elabscience Biotechnology Co, Ltd, Китай), B ZERO (Tecna, Италия) и др. [6, 18, 19]. С учетом некоторых недостатков метода ИФА (трудоемкость, построение калибровочных кривых, невысокая точность) компанией Charm Sciences (СШа) был разработан более удобный и экономичный иммунохро-матографический анализ микотоксинов, который называется ROSA-тест [20].
Тест-системы Ridascreen (Ридаскрин) выпускаются под контролем системы качества ISO 9000 и предназначены для обнаружения сверхмалых концентраций микотоксинов в пищевых продуктах, в сырье, а также в кормах для животных методом ИФА (таблица 7) [21]. Тест-системы для измерения содержания микотоксинов в зерновых культурах и кормах, выпускаемые фирмами США и Бельгии, представлены в таблице 8 и на рисунках 1-3 [22].
Таблица 7. Тест-системы Ridascreen для определения сверхмалых концентраций микотоксинов
Микотоксины Тест-система Время пробоподготовки, мин. Время анализа, мин. Предел обнаружения, мкг/кг
Афлатоксин B1 B2 G1 G2 RIDASCREEN Aflatoxin Total 30 30 1,75
RIDASCREEN B1 30/15 45 45 1
Охратоксин А RIDASCREEN Ochratoxin A 15 15 0,005
RIDASCREEN Ochratoxin A 30/15 30 45 мг/кг 0,00125 мг/кг
Зеараленон RIDASCREEN FAST Zearalenon 15 15 50
RIDASCREEN FAST Zearalenon SC 10 45 5
RIDASCREEN Zearalenon 20 2,5 часа 1,75
Дезоксиниваленол (Дон) RIDASCREEN FAST DON 10 10 0,2 мг/кг
RIDASCREEN FAST DON SC 10 8 0,074 мг/кг
RIDASCREEN DON 10 45 18,5
Т-2 токсин RIDASCREEN FAST T-2 Toxin 10 15 20
RIDASCREEN T-2 Toxin 30 1,5 ч 3,5
Фумонизин RIDASCREEN FAST Fumonisin 15 15 0,222 мг/кг
RIDASCREEN Fumonisin 30 60 0,025 мг/кг
Рис. 1. Экспресс тест-система Neogen Reveal Q+
с)
Рис. 2. Экспресс-тесты: Charm ROSA DONQ2 (а), ROSA WET (b), Охратоксин А (с)
Тест-системы ROSA WET позволяют определять микотоксины в зерне и кормах без использования органических растворителей (этанола и метанола), т. е. тестирование может быть проведено вне лаборатории, в момент приемки сырья. Такая технология позволяет повысить безопасность сотрудников, снизить накопление опасных химических отходов [20].
Характеристика тест-наборов B ZERO приведена в таблице 9 [19].
Наличие микотоксина
Отсутствие микотоксина Рис. 3. Результаты определения афлатоксина с применением набора REVEAL
Таблица 8. Тест-системы для измерения содержания микотоксинов в зерновых культурах и кормах
Микотоксины Тест-системы Производитель Примечание
Охратоксин А Charm ROSA Charm Sciensces, Inc. (США) Время анализа 10 мин.
Дезоксиниваленол (Дон) ROSA DONQ2 Charm Sciensces, Inc. Время анализа 2 мин. 26 видов зерновых и кормовых культур
Афлатоксин ROSA WET Charm Sciensces, Inc. Зерновые и кормовые культуры
Зеараленон Фумонизим Т-2 токсин Афлатоксин Neogen Reveal Q+ Neogen Corporation (США) Зерновые и кормовые культуры
Т-2 токсин «T-2SENSOR QUANTI» (иммунохрома-тографические тест-полоски) Unisensor (Бельгия) Зерновые и кормовые культуры
Охратоксин А «OCHRASENSOR QUANTI» (иммуно-хроматографические тест-полоски)
Фумонизим «FUMOSENSOR QUANTI» (иммуно-хроматографические тест-полоски)
Афлатоксин AFLASENSOR QUANTI» (иммунохро-матографические тест-полоски)
Дезоксиниваленол (Дон) «DONSENSOR QUANTI» (иммунохро-матографические тест-полоски)
Одновременное выявление микотоксинов Т-2, DON и др. «4MYCOSENSOR» (иммунохромато-графические тест-полоски)
Таблица 9. Характеристика тест-наборов для оп
)еделения микотоксинов компании Tecna (Италия)
Наименование тест-набора Нижний предел обнаружения, мкг/кг Диапазон измерения, мкг/кг Общее время инкубации, мин.
B ZERO AFLA B1 для определения афлатоксина B1 1 1-4G 15
B ZERO OCHRA для определения охратоксина 2 (злаки) 4 (отруби пшеничные) 2-5G 2G
B ZERO T2 для определения T2 токсина 25 25-1GG 2G
B ZERO DON для определения Дезоксиниваленола (Дон) 40 (пшеница, корма, кукуруза), 120 (пшеница), 240 (отруби пшеницы) 4G-5GGG 2G
B ZERO FUM для определения фунизинов B1/B2/B3 750 (злаки) 75G-6GGGG 2G
B ZERO ZEA для определения зеараленона 10 1G-2GGG 2G
Для анализа большого количества образцов представляют интерес эффективные им-мунохимические методы анализа, основанные на высокоспецифическом взаимодей-
ствии антигена и антитела. Имея невысокую стоимость и относительную простоту, имму-ноанализ позволяет проводить количественный или качественный скрининг множества
образцов за короткое время [4]. Для определения содержания микотоксинов (афлаток-сина В1, охратоксина А, Т-2 токсина, зеара-ленона, фумонизина В1 и других) в зерновых кормах, зернобобовых кормовых культурах, искусственно высушенных и грубых кормах, продукции комбикормовой промышленности, сырье для производства кормов и кормовых добавках (за исключением кормовых добавок минерального происхождения и продукции органического синтеза) иммуно-ферментным методом разработан соответ-
ствующий ГОСТ [23]. Для экспресс-определения микотоксинов в пробах зерна, кормов и компонентов для их производства методами иммунохимического анализа разработаны специальные методические указания [24].
Зарубежные тест-системы имеют достаточно высокую стоимость, поэтому представляют интерес отечественные наборы реагентов и методики для иммуноферментного определения микотоксинов производства ООО «ХЕМА» и ООО НПО «Иммунотэкс» (таблицы 10, 11).
Таблица 10. Перечень методик измерения микотоксинов, разработанных ООО «ХЕМА»[6|
Наименование методики Номер и дата свидетельства об аттестации Диапазон измерений массовой доли, мкг/кг
Методика измерений массовой доли афлатоксина В1 в пробах зерновых культур, кормов и орехов методом иммуноферментного анализа с помощью набора реагентов «АФЛАТОКСИН-ИФА» 241.0192 / ЯА. ЯИ. 311866 / 2017 от 03.07.2017 г. 0,3-20 20-62,4
Методика измерений массовой доли Т-2 токсина в пробах зерновых культур и кормов методом иммуноферментного анализа с помощью набора реагентов «Т-2 ТОКСИН-ИФА» 241.0194 / ЯА. ЯИ. 311866 / 2017 от 03.07.2017 г. 24-240 240-960
Методика измерений массовой доли зеараленона в пробах зерновых культур, кормов и орехов методом иммуноферментного анализа с помощью набора реагентов «ЗЕАРАЛЕНОН-ИФА» 241.0195 / ЯА. ЯИ. 311866 / 2017 от 03.07.2017 г. 9-120 120-2400
Методика измерений массовой доли охратоксина А в пробах зерновых культур и кормов методом иммуноферментного анализа с помощью набора реагентов «ОХРАТОКСИНИФА» 241.0193 / ЯА. ЯИ. 311866 / 2017 от 03.07.2017 г. 2,4-19,2 19,2-76,8
Методика измерений массовой доли дезоксиниваленола в пробах зерновых культур, кормов и орехов методом иммуноферментного анализа с помощью набора реагентов «ДЕЗОКСИНИ-ВАЛЕНОЛ-ИФА» 241.0196 / ЯА. ЯИ. 311866 / 2017 от 03.07.2017 г. 100-1350 1350-5400
Методика измерений массовой доли фумонизинов В1 и В2 в пробах зерновых культур и кормов методом иммуноферментного анализа с помощью набора реагентов «ФУМОНИЗИН-ИФА» 241.0199 / ЯА. ЯИ. 311866 / 2017 от 03.07.2017 3,6-86,4 86,4-5184
Таблица 11. Наборы для определения микотоксинов методом иммуноферментного анализа
производства ООО НПО «Иммунотэкс» в зерне и кормах*
Наименование набора Диапазон определяемых концентраций, нг/л Время подготовки проб, мин. Время исследования, мин.
Набор для определения общего афлатоксина (АФ) 20-320 15-20 45-60
Набор для определения фумонизина В1 (ФУМ) 500-40500 15-20 45-60
Набор для определения Т-2 токсина 50-4050 15-20 45-60
Набор для определения охратоксина А (ОХР) 100-8100 15-20 75-90
Набор для определения дезоксиневаленола (ДОН) 3000-243000 15-20 75-90
Набор для определения афлатоксина В1 10-810 15-20 45-60
Набор для определения зеараленона (ЗЕН) 300-24300 15-20 45-60
* материал предоставлен ООО НПО «Иммунотэкс»
Для экспресс-определения содержания микотоксинов: зеараленона, Т-2 токсина, аф-латоксинов в зерновых культурах, комбикормах и орехах методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием зарубеж-
ных тест-систем разработаны соответствующие методические рекомендации: методические рекомендации по экспресс-определению микотоксинов в зерновых культурах, кормах и орехах с помощью тест-систем "п-
dascreen fast" производства фирмы R-bio-pharm AG, Германия [25]; методические рекомендации по экспресс-определению афла-токсина В1 в зерновых культурах и орехах с помощью тест-системы "aflaplate" производства фирмы R-Bio-pharm Rhone Ltd.
Выводы. Микотоксины являются биологическими контаминантами - природными загрязнителями микроскопическими плесневыми грибами зерна злаковых, бобовых, семян подсолнечника, которые вызывают отравление у животных, приводят к различным инфекционным заболеваниям, снижению продуктивности, повреждению внутренних органов, язвенному стоматиту и другим болезням. Наиболее распространенными мико-токсинами, представляющими опасность для животных, являются афлатоксины, Т-2 токсин, зеараленон, охратоксин А, дезоксинива-ленол (ДОН), фумонизины. Эти вещества достаточно устойчивы к воздействиям окружающей среды и не разрушаются даже при термической обработке.
В основе контроля безопасности продукции растительного происхождения лежат нормативы содержания различных компонентов, предусмотренные нормативными правовыми актами (технические регламенты, ГОСТы, ТУ, МУ и др.), обеспечивающие необходимый контроль и применение соответствующих методик выполнения.
Для определения содержания микотокси-нов наиболее часто используются хромато-графические методы с различными вариантами пробоподготовки, а также более экономичные скрининговые методы, среди которых наибольшее распространение получил метод ИФА, относящийся к группе иммуно-химических методов анализа. Преимущество этого метода: оперативность, высокая производительность, простота пробоподготовки и проведения измерений, низкая стоимость анализа и малый объем тестируемого образца. Подавляющее большинство тест-систем для иммуноферментного определения содержания микотоксинов, представленных на рынке, выпускаются фирмами Германии, Австрии, США, Китая, Италии и др. Зарубежные тест-системы имеют достаточно вы-
сокую стоимость, поэтому представляют интерес отечественные наборы реагентов и методики для иммуноферментного определения микотоксинов отечественного производства (ООО «ХЕМА», ООО НПО «Иммуно-тэкс» и др.). Развитие методов определения микотоксинов идет в направлении сокращения времени анализа, повышения чувствительности и точности метода.
Оценка содержания микотоксинов в кормах и продовольственном сырье позволяет специалистам соблюдать установленные нормы по их содержанию, принимать оперативные управленческие решения по корректировке технологий производства, транспортировки и хранения, обеспечивающие безопасность сельскохозяйственной продукции.
Литература:
1. О мерах по реализации государственной НТП в интересах развития с. х. URL: http//publikacation.pravo. gov.ru/Do-kument/View/0001201607220024//
2. Федеральная научно-техническая программа развития с. х. на 2017-2025 г. М., 2017. 52 с.
3. Микотоксины. URL: https://www.syngenta.ru/
4. Урусов А.Е., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Иммуно-химические методы анализа микотоксинов // Прикладная биохимия и микробиология. 2010. № 3. С. 276.
5. Иммунохимические методы определения микоток-синов / Горячева И.Ю. и др. // Журнал аналитической химии. 2009. № 8. С. 788-806.
6. Экспрессные методики иммуноферментного определения содержания микотоксинов в зерне, кормах и орехах / Медведевских М.Ю. и др. // Пищевая промышленность. 2018. № 2. С. 56-58.
7. Микотоксины. URL: https://ru.wikipedia.org/wiki/
8. Федоренко В.Ф., Буклагин Д.С. Методы и инструменты контроля качества с.-х. продукции. М., 2017.
9. О безопасности зерна. URL: http: //www.tehreg.ru/ TP_TC/TP_TC_015_2011/TP_TC_015_2011.htm
10. Показатели качества и безопасности зерна. URL: http://www.fczerna.ru/About.aspx?pageid=254
11. Мелешкина Е.П. Инновационные методы управления качеством сельскохозяйственной продукции // Аграрный вестник Юго-Востока. 2015. № 1-2. С. 26-28.
12. Микотоксины и методы их определения. URL: https://helpiks.org/6-11619.html
13. Шаповалова Е.Н., Пирогов А.В. Хроматографиче-ские методы анализа. URL: http://www.chem.msu.su/ rus/teaching/analyt/chrom/part1.pdf
14. Шатц В.Д. Высокоэффективная жидкостная хроматография. URL: http://gosm.narod.ru/shatc1.pdf
15. Хроматографы «Стайер» и Стайер-М». М., б.г.
16. Методическое обеспечение АКВИЛОН. URL: http: //www.prochrom.ru/ru/?idp=met
17. Лабораторные методы диагностики микотоксико-зов. URL: https://www.allvet.ru/articles/ar-ticl e74/
18. ИФА для определения микотоксинов. URL: http:// белкиантитела.рфЛодш/?усЬа=6417103558458761832
19. Контроль микотоксинов в кормах на тест-системах «Tecna B ZERO» - надежно и экономично. URL: https://prodrinok.ru/kontrol-mikotoksinov-v-kormah-na-test-sistemah-tecna-b-zero-nadezhno-i-ekonomichno
20. Куричьев А., Антипова Т. Система CHARM EZ-M - современный и точный экспресс-контроль содержания микотоксинов // Ценовик. 2015. № 7. С. 72-73.
21. Микотоксины. URL: https://stylab.ru/ridascreen.html
22. Лабораторное оборудование для АПК. URL: https: //eltemiks-agro. ru/shop
23. ГОСТ 31653-2012. Корма. Метод иммуноферментного определения микотоксинов. Опубл. 01.07.13
24. Методические указания по экспресс-определению микотоксинов. URL: https ://files.stroyinf. ru/Index2/1/ 4293736/4293736593.htm
25. Мет. рекомендации по определению микотоксинов. URL: https://www.lawmix.ru/expertlaw/131936
Literatura:
1. O merah po realizacii gosudarstvennoj NTP v interesah razvitiya s. h. URL: http//publikacation.pravo.gov.ru/Do-kument/View/0001201607220024//
2. Federal'naya nauchno-tekhnicheskaya programma razvitiya s h. na 2017-2025 g. M., 2017. 52 s.
3. Mikotoksiny. URL: https://www.syngenta.ru/
4. Urusov A.E., ZHerdev A.V., Dzantiev B.B. Immuno-himicheskie metody analiza mikotoksinov // Prikladnaya biohimiya i mikrobiologiya. 2010. № 3. S. 276.
5. Immunohimicheskie metody opredeleniya mikotoksi-nov / Goryacheva I.YU. i dr. // ZHurnal analiticheskoj hi-mii. 2009. № 8. S. 788-806.
6. Ekspressnye metodiki immunofermentnogo opredeleniya soderzhaniya mikotoksinov v zerne, kormah i ore-khah / Medvedevskih M.YU. i dr. // Pishchevaya promy-shlennost'. 2018. № 2. S. 56-58.
7. Mikotoksiny. URL: https://ru.wikipedia.org/wiki/
8. Fedorenko V.F., Buklagin D.S. Metody i instrumenty kontrolya kachestva s.-h. produkcii. M., 2017.
9. O bezopasnosti zerna. URL: http: //www.tehreg.ru/TP _TC/TP_TC_015_2011/TP_TC_015_2011.htm
10. Pokazateli kachestva i bezopasnosti zerna. URL: http: //www.fczerna.ru/About.aspx?pageid=254
11. Meleshkina E.P. Innovacionnye metody upravleniya kachestvom sel'skohozyajstvennoj produkcii // Agrarnyj vestnik YUgo-Vostoka. 2015. № 1-2. S. 26-28.
12. Mikotoksiny i metody ih opredeleniya. URL: https:// helpiks.org/6-11619.html
13. SHapovalova E.N., Pirogov A.V. Hromatografiches-kie metody analiza. URL: http://www.chem.msu.su/rus/ teaching/analyt/chrom/part1.pdf
14. SHatc V.D. Vysokoeffektivnaya zhidkostnaya hroma-tografiya. URL: http://gosm.narod.ru/shatc1.pdf
15. Hromatografy «Stajer» i Stajer-M». M., b.g.
16. Metodicheskoe obespechenie AKVILON. URL: http: //www.prochrom.ru/ru/?idp=met
17. Laboratornye metody diagnostiki mikotoksikozov. URL: https://www.allvet.ru/articles /article74/
18. IFA dlya opredeleniya mikotoksinov. URL: http:// belkiantitela.rf/toxins/?yclid =6417103558458761832
19. Kontrol' mikotoksinov v kormah na test-sistemah «Tecna B ZERO» - nadezhno i ekonomichno. URL: https: //prodrinok.ru/kontrol-mikotoksinov-v-kormah-na-test-si-stemah-tecna-b-zero-nadezhno-i-ekonomichno
20. Kurich'ev A., Antipova T. Sistema CHARM EZ-M-sovremennyj i tochnyj ekspress-kontrol' soderzhaniya mikotoksinov // Cenovik. 2015. № 7. S. 72-73.
21. Mikotoksiny. URL: https://stylab.ru /ridascreen.html
22. Laboratornoe oborudovanie dlya APK. URL: https: //eltemiks-agro. ru/shop
23. GOST 31653-2012. Korma. Metod immunofermentnogo opredeleniya mikotoksinov. Opubl. 01.07.13
24. Metodicheskie ukazaniya po ekspress-opredeleniyu mikotoksinov. URL: https://files.stroyinf.ru/Index2/!/ 4293736/4293736593.htm
25. Met. rekomendacii po opredeleniyu mikotoksinov. URL: https://www.lawmix.ru/expertlaw/131936
METHODS FOR MYCOTOXINS' DETERMINING IN AGRICULTURAL PRODUCTS AND FEED D.S. Buklagin, doctor of technical sciences FGBNY "of Rosinformagrotech"
Abstract. Increasing of agricultural products' quality requirements make it necessary the agricultural products and feed's safety monitoring modern methods to develop and apply. Therefore, agricultural products and feed methods and means of controlling the safety identification and analysis of production, processing and storage process's is an urgent task. The agricultural products and feed's biologically active substances evaluating by main methods are a n-alyzed. The domestic and foreign scientific-and-technical information-and-logical analysis method, as well as materials for market technologies and means for agricultural products and feed's mycotoxins measuring studying was used. Mycotoxins are biological contaminants - natural pollutants of micro-microscopic fungi of cereals, legumes, sunflower seeds. It'd shown that the modern systems for mycotoxins (A ochratoxin, Blaflatoxin, zearalenone, etc.) determining are based on high-performance liquid chromatography, thin-layer chromatography, and enzyme immunoassay. To determine mycotoxins in agricultural products and feed, physicochemical methods of analysis have been developed. Methods of high - performance liquid chromatography as a confirmation method, and of thin-layer chromatography, three-phase enzyme immunoassay, and other immunochemical methods as screening methods are the most widely used.
Keywords: agricultural products, feed, mycotoxins, measurement, indicator, test- systems, quality.
