CC BY
111
УДК: 632.937.16/632.654
Методы молекулярной биологии для контроля численности насекомых-фитофагов
А.В. ИЛЬИНЫХ, ведущий научный сотрудник Института систематики и экологии животных СО РАН
e-mail: ail@sibmail.ru
В популяциях насекомых, дающих вспышки массового размножения, распространены болезни, вызываемые энтомопатогенными вирусами, которые имеют большое значение в регуляции численности своих хозяев. Кроме того, в популяциях фитофагов широко представлены латентные вирусные инфекции, способные при определенных условиях перейти в острую форму. Вирусы насекомых относятся к 13 семействам (группам), из которых наиболее полно изучено сем. Бакуловирусов (Baculo-viridae). К настоящему времени известно около 700 бакуловирусов. К ним относятся вирусы ядерного полиэд-роза, поражающие насекомых из отрядов Diptera, Hymenoptera, Lepido-ptera, и вирусы гранулеза, поражающие Lepidoptera [8].
Как в нашей стране, так и за рубежом, на основе бакуловирусов разработаны препараты для биологического контроля массовых видов насекомых-фитофагов. Бакуловиру-сы узкоспецифичны - имеют ограниченный круг хозяев, поражают один или несколько видов и не влияют на нецелевых членистоногих, позвоночных животных и растения. К недостаткам препаратов на их основе относится сравнительно длительный (от 4-6 до 14-17 дней) период от момента применения до гибели (или прекращения питания) насекомых, за который насекомые нередко успевают нанести весьма ощутимый ущерб.
Нестабильность результатов применения препаратов связана и с распространением в популяцияхна-секомых-фитофагов латентных ви-
русных инфекций. В некоторых случаях успех проведения защитных мероприятий мог быть обусловлен активацией скрытой вирусной инфекции в популяциях насекомых. Однако методов, позволяющих диагностировать латентные инфекции, еще в недалеком прошлом не было.
Имелись попытки применения различных соединений (суперфосфата, сульфата железа, стильбено-вых и др.) в качестве активаторов скрытой вирусной инфекции для контроля численности насекомых в природных популяциях. Однако они не давали устойчивого положительного результата, потому что не были исследованы молекулярно-биоло-гические основы латентности бакуловирусов [1].
В настоящее время в международной базе данных Gene bank (https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/ GenomesGroup.cgi?taxid=1044) насчитывается 62 бакуловируса, для которых определена полногеномная нуклеотидная последовательность (см. таблицу). В их числе вирусы, выделенные из таких насекомых-вредителей, как американская белая бабочка Hyphantria cunea (Drury), яблонная плодожорка Cydia pomonella (L.), озимая совка Agrotis segetum (Schiff.), хлопковая совка Helicoverpa armigera (Hubner), репная белянка Pieris rapae (L.), непарный шелко-
пряд Lymantria dispar (L.), рыжий сосновый пилильщик Neodiprion sertifer (Geoffr.) и др.
Секвенирование геномов бакуловирусов и идентификация фрагментов генома сделали возможным создание штаммов вирусов с заданными свойствами. В частности, недостаток бакуловирусов, заключающийся в длительном латентном периоде при заражении насекомых, был преодолен разработкой реком-бинантных штаммов. Для этого в геном бакуловирусов с помощью генно-инженерных методов были встроены гены инсектицидных токсинов, в частности, яда скорпионов и пауков. Введение генов токсинов во многих случаях значительно сокращало «период ожидания» энто-мопатогенных препаратов на основе рекомбинантных вирусов при сохранении относительно высокой биологической эффективности и без изменения круга насекомых-хозяев [6]. Однако применение этих препаратов существенно ограничено не лишенным оснований недоверием общества к использованию ГМО, хотя в данном случае рекомбинант-ные бакуловирусы не включаются напрямую в цепи питания, как, например, трансгенные растения, некоторые из которых (или продукты их переработки) непосредственно употребляются в пищу человеком.
Для ряда бакуловирусов, выделенных из природных популяций насекомых, показана гетерогенность их генотипического состава, что, в частности, выражается в различной вирулентности штаммов бакуловирусов. Так, секвенирование образцов ВЯП непарного шелкопряда из
Современная классификация бакуловирусов
Отряд Число вирусов,
у которых определена
Группа поражаемых полногеномная
насекомых нуклеотидная последовательность
Альфабакуловирусы (вирусы ядерного полиэдроза) Lepidoptera 42
Бетабакуловирусы (вирусы гранулеза) Lepidoptera 15
Гаммабакуловирусы Hymenoptera 3
Дельтабакуловирусы Diptera 1
Неклассифицированные бакуловирусы 1
Северной Америки, Европы и Азии выявило их полиморфизм, а определение биологической активности показало, что наибольшей вирулентностью обладают североамериканские штаммы [5]. То есть исследование генотипов бакуловирусов позволяет осуществлять отбор штаммов с повышенной вирулентностью по отношению к насекомому-хозяину.
Установлено, что вирусная инфекция может влиять на гормональный баланс инфицированных особей. Для ряда бакуловирусов показано наличие egt-гена, инактивирующего гормон линьки насекомых [9]. Так, инфицирование гусениц непарного шелкопряда вирусами, содержащими egt-ген, приводило к нарушению процессов линьки и аномальному росту насекомых, выражавшемуся в продлении возраста [10]. В настоящее время запатентован ряд баку-ловирусов с повышенной вирулентностью и способностью инактивиро-вать гены, кодирующие процесс линьки насекомых. В частности, на основе такого бакуловируса в США разработан препарат против Auto-grapha californica (Speyer). Созданы и бакуловирусные штаммы, содержащие гены-ингибиторы апоптоза, как одного из возможных способов преодоления вирусной инфекции клетками насекомых.
Усилению инсектицидной активности вирусов способствует и применение энхансинов - белков, разрушающих перитрофическую мембрану насекомых, в частности, защищающую их от проникновения патогенов.
Благодаря методу ПЦР (полиме-разная цепная реакция) была внесена ясность в вопрос об источнике скрытого вирусоносительства. На примере индийской мучной моли Plodia interpunctella (L.) была исследована вертикальная передача вируса (от родителей потомкам через внутреннее содержимое яйца) и показано, что источником скрытой вирусной инфекции является экзогенное инфицированное насекомых, а скрытый вирус может передаваться потомкам выживших после зараже-
ния насекомых в течение, как минимум, 5 генераций [2].
Наряду с ПЦР применяются также рекомбинантные ВЯП с зеленым флуоресцентным геном белка (GFP) и рестрикционный анализ вирусной ДНК, чтобы дифференцировать гибель насекомых от вируса, внесенного в популяцию, и наступившую в результате активации скрытого вируса.
Во всех исследованных случаях уровень вирусоносительства у насекомых был значительно выше, чем частота проявления полиэдроза, то есть наличие вируса у насекомых не означает неизбежной гибели хозяев. Вероятно, вирусная ДНК может полностью или частично утратить свою инфекционность, хотя и выявляться в образцах насекомых. Кроме того, развитие вироза может подавляться механизмами резистентности насекомых к вирусной инфекции. Актуальным остается вопрос -в течение скольких генераций вирус сохраняет способность к индукции вирусной репликации при вертикальной передаче?
Применение метода ПЦР показало, что латентный вирус обнаруживался в популяциях яблонной плодожорки Cydia pomonella в Британской Колумбии (Канада) на уровне 23 % [4], а в различных популяциях капустной совки Mamestra brassicae на территории Великобритании - 50100 % [3]. Для непарного шелкопряда было продемонстрировано, что скрытый вирус диагностировался во всех исследованных популяциях на территории России, а численность насекомых-вирусоносителей возрастала в ходе вспышки. При этом, как уже отмечалось, уровень вирусоносительства был выше, чем смертность насекомых от спонтанного или индуцированного полиэдроза [1]. Следовательно, в популяциях непарного шелкопряда существует определенный фон вирусоносительства, который не приводит к активации скрытого вируса. Дальнейшие исследования скрытого вирусоносительства у насекомых-фитофагов в природных условиях могут позволить более целенаправленно применять
активаторы скрытого вируса для создания искусственных эпизоотий. Это потенциально весьма перспективное направление, поскольку в данному случае биологический контроль не связан с получением и применением вирусных препаратов.
Другим практическим аспектом применения методов ПЦР может быть диагностика фаз вспышек массового размножения, в частности, дендрофильных насекомых-филло-фагов, что важно не только для прогноза развития и затухания вспышки. Так, для некоторых видов насекомых было установлено, что чувствительность личинок к патогенам различной природы в значительной степени может зависеть от фазы вспышки массового размножения [7]. Кроме того, было показано, что биологическая активность вирусных изолятов, выделенных в разные фазы вспышки, может значительно отличаться. Это позволяет оптимизировать отбор высоковирулентных изолятов для наработки энтомопа-тогенных препаратов на основе бакуловирусов.
Работа выполнялась при частичной финансовой поддержке Интеграционного проекта СО РАН № 88.
ЛИТЕРАТУРА
1. ИльиныхА.В., Ульянова Е.Г. Латент-ность бакуловирусов // Известия РАН. Серия биологическая, 2005, № 5, с. 599606.
2. Burden J.P., Griffiths C.M., Cory J.S., Smith P., Sait S.M. Vertical transmission of sublethal granulovirus infection in the Indian meal moth, Plodia interpunctella // Molecular Ecology, 2002, vol. 11, p. 547-555.
3. Burden J.P., Nixon C.P., Hodgkin-sonA.E., Rossee R.D., SaitS.M., King L.A., Hails R.S. Covert infections as a mechanism for long-term persistence of baculovi-ruses // Ecology Letters, 2003, vol. 6, p. 524-531.
4. Eastwell K.C., Cossentine J.E., Bernardy M.G. Charakterisation of Cydia pomonella granulovirus from codling moths in a laboratory colony and in orchards of British Columbia // Annals of Applied Biology, 1999, vol. 134, p. 285-291.
5. HarrisonR. L., Keena M. A., RowleyD.L. Classification, genetic variation and pathogenicity of Lymantria dispar nucleopoly-hedrovirus isolates from Asia, Europe, and
УДК 632.752:633.15
Вредоносность хлопковой совки на кукурузе на востоке Украины*
North America. Journal of Virology, 2013, Dec 25; 116C: 27-35. doi: 10.1016/ j.jip.2013.12.005.
6. Herniou E.A., Olszewski J.A., O'Reilly D.R., Cory J.S. Ancient coevolution of baculoviruses and their insect hosts // Journal of Virology, 2004, vol. 78, p. 32443251.
7. IlyinykhA., KurenschikovD., Ilyinykh Ph., Imranova E., Polenogova O., Baburin A. Sensitivity of gypsy moth Lymantria dispar larvae from geographically removed populations to nucleopolyhedrovirus // SHILAP Revista De Lepidopterologia, 2013, vol. 41, p. 349-356.
8. Rohrmann G.R. Baculovirus molecular biology, 2008. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ books/NBK1736/
9. Shikata M., Shibata H., Sakurai M., Sano Y., Hashimoto Y., Matsumoto T. The ecdysteroid UDP-glucosyltransferase gene of Autographa californica nucleopolyhedro-virus alters the molting and metamorphosis of a non-target insect, the silkworm, Bombyx mori (Lepidoptera, Bombycidae) // Journal of General Virology, 1998, vol. 76, p. 1547-1551.
10. Slavicek J.M., Popham H.J.R., Riegel C.I. Deletion of the Lymantria dispar multicapsid nucleopolyhedrovirus ecdy-steroid UDP-glucosyltransferase gene enhances viralkillingspeed in the last instar of the gypsy moth // Biological Control, 1999, vol. 16, p. 91-103.
Аннотация. Показано, что методы молекулярной биологии могут применяться для оптимизации биологического контроля насекомых-фитофагов. Получены рекомбинантные бакуловирусы с относительно высокой биологической активностью, коротким инкубационным периодом и без изменения круга хозяев. При дальнейших исследованиях метод ПЦР может быть применен для диагностики фаз вспышек массового размножения лесных насекомых-филлофагов.
Ключевые слова. Насекомые-филло-фаги, биологический контроль, методы молекулярной биологии, бакуловирусы, вирулентность.
Abstract. It is shown that molecular biology methods can be used for optimization of the biological control of phytophagous insects. A recombinant baculoviruses are received with a comparatively high biological activity, a short latent period and without change of hosts circle. Under further investigations the PCR method can be applied for diagnostics of the outbreaks phases of forest phyllophagous insects.
Keywords. Phytophagous insects, biological control, molecular biology methods, baculoviruses, virulence.
В.П. ФЕДОРЕНКО, академик НААН Украины А.В. КУЗЬМИНСКИЙ, аспирант Института защиты растений НААН Украины e-mail: predatoryo86@ya.ru
Хлопковая совка Helicoverpa armígera Hb., в прошлые годы заявлявшая о себе только в периоды вспышек массового размножения, становится на Востоке Украины одним из распространенных и опасных вредителей кукурузы [2, 5, 9]. Аналогичная ситуация наблюдалась на юге Украины в начале 1950-х годов, когда площади посевов кукурузы превышали 5 млн га [3]. Положение усугубляется процессами иммиграции хлопковой совки из зон постоянной вредоносности в регионах Северного Кавказа [7, 8].
Целью наших исследований было изучение особенностей развития и вредоносности хлопковой совки на кукурузе в восточной части Северной Степи. Исследования проводились путем закладки опытов на отдельных участках полей Луганского
* Фотографии - на вкладке.
национального аграрного университета и маршрутных обследований производственных посевов в Луганской области в 2011-2013 гг.
Климат здесь - континентальный, с выраженными засушливо-суховейными явлениями и недостаточным количеством осадков [1]. Изучалась поврежденность районированных гибридов кукурузы в серии экологических испытаний образцов, представленных селекционными центрами Украины. За три года исследовано 42 гибрида. Иммунологическую дифференциацию проводили по трем группам устойчивости: устойчивые (У) - повреждено до 25 % початков; среднеустойчивые (СУ) -от 25 до 50 %; восприимчивые (В) -повреждено более 50 % початков. Энтомологические наблюдения выполнялись в соответствии с общепринятыми методиками [4, 6].
В годы исследований хлопковая совка отмечалась на многих сельскохозяйственных культурах, но больше всего повреждала кукурузу. Заселялись все посевы кукурузы с повреждением от 25 до 100 % початков. В 2011-2012 гг. вредитель нахо-
Годы
Динамика посевных площадей кукурузы на Украине
