CC BY
25Методы лабораторных исследований функций
тромбоцитов
Азиза Анваровна Каримова Севара Аскаровна Касимова Севара Шерали кизи Иброхимова Ташкентская медицинская академия
Аннотация: Тромбоциты человека - это безъядерные высокодифференцированные и высокоспециализированные клетки, обладающие уникальным строением и функциями. Проявление тромбоцитами функциональной активности сопровождается кардинальным изменением их внутренней структуры, поэтому при изучении морфологии тромбоцитов принято выделять клетки стадии "покоя" (исходные неактивированные тромбоциты) и клетки, находящиеся на разных стадиях активации. [1].
Ключевые слова: Лабораторные методы определения функции тромбоцитов, Оценка функции тромбоцитов.
Methods for laboratory studies of platelet functions
Aziza Anvarovna Karimova Sevara Askarovna Kasimova Sevara Sherali kizi Ibrohimova Tashkent Medical Academy
Abstract: Human platelets are non-nuclear, highly differentiated and highly specialized cells with a unique structure and functions. The manifestation of functional activity by platelets is accompanied by a cardinal change in their internal structure; therefore, when studying the morphology of platelets, it is customary to isolate cells of the "rest" stage (initial non-activated platelets) and cells at different stages of activation. [one].
Keywords: Laboratory methods for determining platelet function, Evaluation of platelet function.
Тромбоциты представляют собой маленькие, 2-4 микрометра диаметром, безъядерные клеточные фрагменты (хотя иногда их называют клетками), циркулирующие в кровотоке в концентрации 200-400 тыс. на микролитр и отвечающие за ключевые этапы процесса остановки кровотечения - гемостаза.
В случае ранения они способны прикрепляться к поврежденным тканям и друг к другу, формируя тромбоцитарную пробку-агрегат, прекращающую потерю крови и препятствующую попаданию микробов в систему кровообращения. Это не единственный механизм гемостаза, но крайне важный.[2]
Тромбоциты во многих отношениях устроены просто: у них нет ядра, нет или практически нет синтеза белка, они не могут расти или делиться. Задача тромбоцита - приклеиться к месту повреждения - тоже выглядит простой и однозначной по сравнению с задачами практически любой иной клетки. Но на практике оказывается, что эта простота обманчива. Для выполнения своей функции они должны активироваться в процессе, который управляется добрым десятком активаторов, действующих через многочисленные рецепторы. Сеть сигнальных путей в тромбоците, управляющих его ответом, является сложной и плохо изученной. Сам по себе ответ тромбоцита представляет собой не простое «приклеивание», а включает десятки функций, начиная от первичной адгезии и заканчивая везикуляцией. Кроме фундаментальных сложностей, тромбоциты таят в себе немало практических загадок: в настоящий момент в руках врачей нет ни сколько-нибудь адекватного теста для оценки функции тромбоцитов, ни действенного инструмента ее улучшения. Несмотря на огромный прогресс, достигнутый в конце XX века в связи с разработкой лекарственных препаратов-антагонистов гликопротеина IIb-IIIa и рецептора P2Y12, подавление активности тромбоцитов в целях борьбы с тромбозами все еще не является решенной проблемой. Наконец, сейчас разворачивается интенсивное исследование роли тромбоцитов за пределами гемостаза - в ангиогенезе, иммунитете и других системах.[2]
В настоящее время показано, что повышение агрегации тромбоцитов является важным элементом патогенеза как развития, прогрессирования сердечно-сосудистых заболеваний, так и возникновения осложнений. Механизмы активации тромбоцитов могут быть различными и зависят от состава плазмы крови, изменений функционального состояния и структуры мембран тромбоцитов. Значительная роль принадлежит и изменению функционального состояния эндотелия с утратой эндотелиальными клетками их дезагрегантных и антиадгезивных свойств. Показано, что при дисфункции эндотелия в крови повышен уровень адгезивных протеинов (intercellular adhesion molecule-1 [ICAM1], E-селектин [ELAM-1], vascular cell adhesion molecule-1 [VCAM-1], фактор фон Виллебранда [VWF], тромбомодулин). Особое значение имеет спонтанная агрегация тромбоцитов (САТ), когда избыток агрегатов тромбоцитов циркулирует в системном кровотоке. За этим следует целый ряд изменений и, прежде всего, в мелких сосудах. Длительное
повышение спонтанной агрегации тромбоцитов может приводить к ремоделированию сосудистой стенки и, прежде всего, мелких сосудов. [3]
Оценка функции тромбоцитов
«Золотым стандартом» оценки функциональной активности тромбоцитов был признан метод оптической агрегометрии (light transmission aggregometry, LTA). Метод основан на оценке фотометром светопропускающей способности (% агрегации) цитратной богатой тромбоцитами плазмы при добавлении в нее агониста агрегации (АДФ, эпинефрин, коллаген, арахидоновая кислота, тромбоксан, ристоцетин). Агрегация тромбоцитов, индуцированная ристоцетином, который активирует связывание фактора Виллебранда с комплексом гликопротеинов GPIb-IX-V, также измеряется с помощью LTA. При проведении этого анализа необходимо учитывать данные о приеме медикаментозных и гомеопатических препаратов, которые могут влиять на агрегацию тромбоцитов. На сегодняшний день известны агрегометрические особенности ряда тромбоцитопатий (таблица). Отсутствие агрегации со всеми агонистами, кроме ристоцетина, указывает на тромбастению Гланцмана. Этот диагноз может быть подтвержден проточной цитофлуориметрией -количественной оценкой рецептора мембраны тромбоцитов IIb/IIIa. Значительно пониженный ответ на все концентрации АДФ указывает на наличие дефекта АДФ-рецепторов P2Y12. Понижение второй волны агрегации под действием АДФ и эпинефрина и понижение агрегации с коллагеном может указывать на дефицит пула хранения. С целью подтверждения дефицита плотных гранул необходимо провести исследование функциональной состоятельности плотных гранул методом проточной цитофлуориметрии иэлектронную микроскопию. Таким образом, распознавание и дифференциальная диагностика тромбоцитопатий должны базироваться на комплексном исследовании гемостаза, изучении морфологии тромбоцитов методами световой и электронной микроскопии, оценке функциональной активности методом проточной цитофлуориметрии, а также проведении генетического анализа для выявления мутаций, коррелирующих с различными типами тромбоцитопатий.[4]
Лабораторные методы определения функции тромбоцитов
В настоящее время используется множество тестов для определения функции тромбоцитов. Среди них есть как технически сложные (турбидиметрический метод, проточная цитометрия), так и простые «прикроватные» методы. Для лабораторного определения действия аспирина наиболее распространенными являются следующие тесты 1. Определение уровня тромбоксана А2 посредством измерения уровня его стабильных метаболитов:
1) определение тромбоксана В2 в сыворотке или плазме крови;
2) определение 11-дегидротромбоксана В2 в моче.
2. Исследование тромбоксанзависимой функции тромбоцитов:
1) оптическая агрегометрия;
2) импедансная агрегометрия с арахидоновой кислотой;
3) verifynow с арахидоновой кислотой (тест на аспирин);
4) тромбоэластография (тест platelet mapping с арахидоновой кислотой);
5) полуавтоматическая агрегометрия в условиях высокого напряжения сдвига - анализатор функции тромбоцитов PFA-100.
3. Адгезия под действием напряжения сдвига «IMPACT cone and plate(let) analyzer».
4. Изменения на поверхности тромбоцита, связанные с его активацией арахидоновой кислотой: P-селектин, активированные гликопротеиновые рецепторы IIb/IIIa, образование тромбоцитарно-лейкоцитарных агрегатов в ответ на стимуляцию арахидоновой кислотой (проточная цитометрия). Для определения функции тромбоцитов на фоне лечения клопидогрелом используются следующие методы. 1. Оценка сигнального пути P2Y12-рецепторов: 1) анализ стимулируемого вазодилататором фосфорилирования фосфобелков (vasodilator-stimulated phosphoprotein (VASP) phosphorylation). 2. Определение функции тромбоцитов в ответ на стимуляцию АДФ: 1) оптическая агрегометрия; 2) импедансная агрегометрия с АДФ; 3) verifynow с АДФ ^Y^^ot^ 4) тромбоэластография (тест platelet mapping с АДФ); 5) адгезия под действием напряжения сдвига «IMPACT cone and plate(let) analyzer»; 6) изменения на поверхности тромбоцита, связанные с его активацией АДФ: P-селектин, активированные гликопротеиновые рецепторы IIb/IIIa, образование тромбоцитарно-лейкоцитарных агрегатов в ответ на стимуляцию АДФ (проточная цитометрия).[5]
Использованная литература
1. Макаров Максим Сергеевич.Особенности морфофункционального статуса тромбоцитов человека в норме и патологии.Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Научный руководитель: профессор, доктор медицинских наук: Хватов Валерий Борисович. Москва -2013
2. Тромбоциты и гемостаз М.А. Пантелеев1-5, А.Н. Свешникова1-3 1 Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН, Москва; 2 ФГБУ ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева Минздрава России, Москва; 3 физический факультет ФГБОУ ВПО «Московский государственный
университет им. М.В. Ломоносова»; 4 ФГБУ ГНЦ Минздрава России, Москва; 5 ООО «ГемаКор», Москва
3. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ АГРЕГАЦИИ ТРОМБОЦИТОВ. ФОКУС НА СПОНТАННУЮ АГРЕГАЦИЮ КОЗЛОВСКИЙ В.И.*, КОВТУН О.М.*, СЕРОУХОВА О.П.*, ДЕТКОВСКАЯ И.Н.**, КОЗЛОВСКИЙ И.В.*
4. Thrombocytopathy I.А. Demina1 , M.A. Kumskova1 , M.A. Panteleev1-4 1 Federal Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology named after Dmitriy Rogachev, Ministry of Health of Russia; 1 Samory Mashela St., Moscow, 117198, Russia; 2 Hematological Research Center, Ministry of Health of Russia; 4a Novo-Zykovskiy Pr-d, Moscow, 125167, Russia; 3 Theoretical Problems Center of Physical and Chemical Pharmacology, Russian Academy of Sciences; 38A, Bldg. 1, Leninskiy Prosp., Moscow, 119991, Russia; 4 M.V. Lomonosov Moscow State University; 1, Bldg. 8 Leninskie Gory St., Moscow, 119234, Russia
5. Современные методы оценки функции тромбоцитов и их клиническое значение у больных с острым коронарным синдромом И. И. Воробьева* Кафедра кардиологии ФПДО Московского государственного медико-стоматологического университета. Воробьева И. И., Рыжкова Е. В., Васильева Е. Ю., Шпектор А. В. Влияние системного воспаления на эффект антиагрегантной терапии у больных с острым коронарным синдромом // Креативная кардиология. 2012. В печати. Габбасов З. А., Попов Е. Г., Гаврилов И. Ю. и др. Новый высокочувствительный метод анализа агрегации тромбоцитов // Лаб. дело. 1989. Т. 10. С. 15-18.
