CC BY
41
МЕТОДЫ
КОМПЬЮТЕРНОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ
для разработки новых лекарственных препаратов ПРОТИВ
В последнее десятилетие в процессе создания новых лекарственных препа ратов возрастает роль методов компьютерного
ffл¡y молекулярного моделирования, позволяющих значительно сократить сроки разработки лекарств и существенно уменьшить финансовые расходы [1]. С помощью этих методов нами были сконструированы трехмерные структуры мишени ВИЧ-1 - петли У3 белка др120, ее потенциальные лиганды -«водорастворимые» аналоги гликолипида в-галактозилцерамида ф^а!Сег), построены их структурные комплексы и проанализиро ваны типы межмолекулярных взаимодействий, стабилизирующих комплексы, а также рассчитаны свободные энергии их образования. В результате были идентифицированы гликолипиды, кото-Ж рые могут рассматриваться как первоочередные кандидаты Ж на роль ингибиторов проникновения ВИЧ-1 с широкой ^
№ Ж „,,™й -™,пи„,„мй ппп „V п™п„,л„,пгп
вирусной нейтрализацией для их последующего химического синтеза и тестирования
#
#
на анти-ВИЧ активность.
ЭТАПЫ МОДЕЛИРОВАНИЯ
I.
Конструирование трехмерных структур петли V3 белка gp120 ВИЧ-1. Методами гомологичного моделирования были построены корректные модели трехмерных структур петли У3 белка §р120 ВИЧ-1 для четырех различающихся по генетическим характеристикам штаммов ВИЧ-1 [2]. Согласно результатам тестирования программой «РЯОСНЕСК», во всех
рассматриваемых структурах преобладающее число аминокислотных остатков локализовано в энергетически благоприятных областях карты Рамачандрана, а их двугранные углы х принимают значения, удовлетворяющие данным библиотеки ротамеров боковых цепей [3].
В результате сравнительного анализа трехмерных структур петли У3 в пространстве декартовых координат атомов и двугранных углов было установлено, что, несмотря на генетическое разнообразие ВИЧ-1, У3-домен образует как минимум три консервативных элемента структуры, включающих функционально важные аминокислоты белка §р120, что объясняет ее
Вариант ВИЧ-1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35
N249-env-10 C T R P N N N T R K G I H M G P G K A F Y T T G D I IG D I R Q A H C
Moc-Det-Mn-10 C T R P N N N T R T S I R I G P G Q T F Y A L G G V IG D I R R A H C
N304-env C T R P N N N T R T S IR I G P G Q A F Y A T G G V IG E P R K A H C
Scab-env-10 C T R P Y N N T R K G IH I G P G R A F Y A T G D I IG D I R Q A H C
Рис. 1.
Аминокислотные последовательности петли У3 для вариантов №49-ем-10, Мос-ОеМИп-Ю, Ш04-ет/ и БсэЬ-епу-10 ВИЧ-1
(выделены консервативные остатки петли У3)
важную роль в процессе проникновения вируса в клетку-мишень. Эти инвариантные элементы структуры петли У3 ВИЧ-1 представляют собой слабые звенья в системе защиты вируса и поэтому могут рассматриваться как универсальные мишени для создания эффективных лекарственных препаратов с широким диапазоном нейтрализующего действия [4].
Расчеты проводили в два этапа. На первом шаге вычислений применялись методы гомологичного моделирования. Нуклеотидные последовательности области гена гну, соответствующей петле У3 белка §р120, для выбранных модификаций ВИЧ-1 были предоставлены завлабораторией диагностики ВИЧ и сопутствующих инфекций РНПЦ эпидемиологии и микробиологии В.Ф. Ереминым. Их трансформировали в аминокислотные последовательности (рис. 1) с помощью программы «БюЕ^Ъ» (версия 7.0.9) [5]. При этом трехмерные структуры петли У3, установленные ранее с помощью спектроскопии ЯМР [6]
Рис. 2.
Трехмерные структуры петли У3 для вариантов А - Ы249-епу-10, Б - Мос-0еЬМп-10, В - Ш04-епу Г - БсэЬ-епу-10
и рентгеноструктурного анализа [7], представляли в расчетах шаблон, а ее первичные структуры - цель. Во всех случаях шаблон включал пять экспериментальных структур. Гомологичное моделирование выполнялось с помощью компьютерной программы «MODELLER9.6» [8]. В процессе расчетов налагались ограничения на геометрию дисульфид-ного мостика между консервативными остатками «Cys-1» и «Cys-35» [9]. Для каждой пары шаблон/цель моделировался набор структур, включающий 100 моделей, качество которых оценивалось с помощью статистического потенциала DOPE, входящего в состав программного пакета «MODELLER» [10]. На втором этапе расчетов из каждого набора отбирались лучшие по значению оценочной функции структуры, подвергшиеся двухстадийной процедуре имитационного отжига в силовом поле «Amber» (набор параметров ff03) с использованием пакета «Amber 10» [11]. Первую стадию расчетов проводили в приближении вакуума, вторую - в неявном растворителе; остальные параметры в обоих случаях задавали одинаковыми. В процессе отжига структура нагревалась до температуры 1000 К в течение 550 пс, после чего осуществлялся расчет молекулярно-динамической траектории длительностью 100 пс в изотермических условиях. Далее структура постепенно охлаждалась до 0 К за 800 пс; при этом общее время отжига составляло 1450 пс. Для численного решения уравнений движения использовалась стандартная схема интегрирования «leapfrog» c шагом 0,5 пс на этапах нагрева и высокотемпературной динамики; на стадии охлаждения системы этот параметр равнялся 1 фс. Контроль температуры осуществлялся с помощью термостата Ланжевена с частотой столкновений 10 (пс)-1 [11].
Полученные методом имитации теплового отжига структуры с наименьшими значениями энергии
рассматривались в качестве наиболее вероятных статических трехмерных моделей петли V3 для соответствующих вариантов ВИЧ-1, а остальные четыре структуры использовались на завершающей стадии анализа для исследования конфор-мационной подвижности третьего вариабельного домена белка gp120.
Для оценки качества построенных моделей привлекался программный комплекс «PROCHECK».
Данные о двугранных углах ф, ty аминокислотных остатков в оптимизированных моделях петли V3 использовались для определения элементов вторичной структуры. При идентификации ^-изгибов применяли классификацию Хатчинсона и Торнтон [12], а также информацию о специфических межатомных расстояниях Cai.. .Cai+3, вычисленных из координат атомов расчетных структур.
В качестве меры подобия трехмерных структур применялись среднеквадратичные отклонения (RMSD) декартовых координат атомов (cRMSD), а для оценки их локального сходства в геометрическом пространстве двугранных углов использовались величины RMSD между соответствующими углами (aRMSD) [13]. Молекулярно-динамические (МД) расчеты осуществлялись в пакете «Amber 10» [11] с использованием силового поля «Amber» (набор параметров ff03). В качестве начального приближения привлекались статические трехмерные структуры петли V3, построенные для модификаций N304-env, N249-env-10, Scab-env-10 и Moc-Det-Mn-10 ВИЧ-1 методами гомологичного моделирования и имитации теплового отжига (рис. 2). Стартовые структуры помещались в ячейку с формой усеченного октаэдра так, чтобы наименьшее расстояние между ее гранями и атомами петли V3 превосходило 10 А. Модель воды TIP3P [14] использовалась для явного задания свойств растворителя, на который накладывали периодические граничные условия. Перед проведением МД расчетов исходная молекулярная система, состоящая из петли V3 и молекул воды, подвергалась двухстадийной процедуре минимизации энергии, заключавшейся в последовательном применении 500 шагов метода градиентного спуска и 500 шагов метода сопряженных градиентов. На первом этапе расчетов осуществлялся нагрев системы от 0 до 300 K во временном интервале 1 нс при постоянном объеме ячейки. Следующий шаг - в течение 1 нс уравновешивалось давление в системе, установленное на значении 1 атм посредством динамического
изменения размеров ячейки согласно схеме Берендсена и соавт. [15] с характерной частотой
2,0 (пс)-1.
На этапах нагрева и уравновешивания давления накладывались дополнительные ограничения на положения атомов петли V3 в пространстве с помощью потенциала параболической формы с силовой постоянной, равной 1 и 0,5 ккал/моль. Далее эти ограничения снимались и система вновь подвергалась релаксации в течение 2 нс в изобарно-изотермических условиях. На заключительном этапе моделирования проводился расчет МД-траекторий длительностью 50 нс. Для контроля температуры использовали термостат Ланжевена [11] с частотой столкновений 2,0 (пс)-1. Интегрирование уравнений движения Ньютона осуществлялось с помощью алгоритма «leapfrog» [11] с шагом интегрирования 2 фс. Для фиксации длин всех связей, в образовании которых участвуют атомы водорода, применялся алгоритм [16]. Максимальное расстояние, на котором учитывались невалентные взаимодействия, равнялись 8,0 А. Расчеты выполнялись на суперкомпьютере «СКИФ-ОИПИ» ОИПИ НАН Беларуси [17].
II.
Конструирование пространственных структур производных Р-Са!Сег и их комплексов с петлей V3. Методами квантовой химии были рассчитаны пространственные структуры 12 сконструированных аналогов Р-Оа1Сег, а затем с помощью процедуры молекулярного докинга построены их структурные комплексы с петлей У3 ВИЧ-1 [18, 19].
Для конструирования аналогов ^-Оа1Сег использовалась кристаллическая структура а-Оа1Сег (код 17Т4 в Международном банке белков [20]), которая модифицировалась с помощью методов молекулярного моделирования:
■ а-Э-галактозу преобразовывали в ее аномер Р-Э-галактозу;
■ гидроксильную группу при четвертом атоме углерода 4-гидроксидигидросфингозина удаляли и заменяли одинарную связь С4 - С5 на двойную связь
в транс-конформации.
Полученный таким образом ^-Оа1Сег привлекался в качестве стартовой модели для построения аналогов гликолипида, в которых осуществлялось замещение остатка жирной кислоты на остатки растворимых кислот,
Рис. 3. Трехмерные структуры аналогов р-Са!Сег, построенные методами молекулярного моделирования (обозначены потенциальные доноры и акцепторы водородной связи)
разделенные на две группы в зависимости от наличия в их составе ароматических колец. Выбор заместителей остатка жирной кислоты P-GalCer проводился с целью усиления специфичности и эффективности связывания за счет возможного п-стэкинга ароматических фрагментов гликолипидов c консервативными остатками Pro-4, Pro-16, Phe-20, Tyr-21 и His-34 петли V3 ВИЧ-1 и/или формирования дополнительных межмолекулярных водородных связей с участием их полярных групп [18, 19].
Оптимизация трехмерных структур глико-липидов проводилась методами квантовой химии в пакете «Gaussian» [21]. Для расчета электронной конфигурации использовался метод самосогласованного поля Хартри - Фока с валентно-расщепленным базисом 6-31G* [22]. Геометрические параметры молекул оптимизировали с помощью модифицированного метода Ньютона - Рафсона [23]. Для вычисления характерных зарядов атомов применяли модель «RESP» [24]. Полученные в ходе моделирования трехмерные структуры аналогов ^-GalCer представлены на рис. 3.
В качестве биологической мишени для глико-липидов использовались трехмерные структуры петли V3 из пяти модификаций ВИЧ-1, включающих штаммы подтипов А и B вируса и его две
рекомбинантные формы [7]. Эти структуры петли V3 существенно различаются между собой, однако образуют три консервативных участка, расположенных в ее центральной области, а также на N- и С-концевых сегментах [4].
Молекулярный докинг выполнялся с помощью программы «AutoDock Vina» [25] с учетом конформационной подвижности гликоли-пида, перебирая все его возможные ориентации относительно молекулы-рецептора. Для каждого лиганда рассматривались девять комплексов, лучших по величине оценочной функции программы «AutoDock Vina», включающей ван-дер-ваальсовы силы, электростатические взаимодействия и водородные связи [25]. Так как для всех рассматриваемых примеров наиболее предпочтительные структуры имели близкие значения оценочной функции, для более точной их локализации на шкале энергий использовался метод имитационного отжига [25], который проводился в интервале температур от 500 до 0 K без ограничений на подвижность лиганда и рецептора в присутствии явного растворителя в программном пакете «AMBER11» [26]. Затем выбирались лучшие по значению энергии комплексы, которые подвергались молекулярно-динамическому моделированию с целью оценки стабильности надмолекулярных структур путем расчета свободной энергии их образования. МД-моделирование осуществлялось в программном пакете «AMBER11». Расчеты проводились в изобарно-изотермических условиях в силовом поле «Amber» c набором параметров ff10 в течение 30 нс [26].
Для задания свойств растворителя использо-
трехточечная модель воды «Т1Р3Р» [14]. Первые 5 нс отводили на релаксацию системы. Расчет свободной энергии образования комплексов выполнялся с помощью метода «ММ-РБ/БЛ» [27], в пакете «AMBER.11» [26]. Для оценки стабильности комплексов применялись средние значения свободной энергии и соответствующие им стандартные отклонения. При анализе МД траекторий рассматривались 500 точек, разделенных временным интервалом в 50 пс.
Анализ статических и динамических моделей структурных комплексов сконструированных аналогов ^-Оа1Сег с петлей У3 из различных модификаций ВИЧ-1 свидетельствует о том, что специфичность связывания гликоли-пидов с этим функционально важным участком белка §р120 обусловлена нестандартными ХН—л-водородными связями пиранозного кольца остатка галактозы с л-сопряженными системами его консервативных остатков РЬе-20/ Туг-21 или Н1з-34. Кроме ХН—л-взаимодействий существенный вклад в формирование комплексов вносят л-л-взаимодействия, а также стандартные водородные связи с участием функционально важных аминокислотных остатков петли У3, расположенных преимущественно в ее центральной области, а также на М- и С-концевых сегментах. При этом петля У3 формирует два потенциальных сайта для взаимодействия с гли-колипидами, один из которых расположен на иммуногенной «верхушке» У3-домена, а второй - у его основания, примыкающего к дисуль-фидному мостику Су8-1 - Суз-35. Оба этих участка петли У3 ВИЧ-1 образуют консервативные элементы структуры, включающие аминокислоты белка §р120, критические для связывания вируса с корецепторами ССБ.5 и/или СХСБ.4. Структурные комплексы, построенные методами молекулярного докинга, энергетически стабильны и не подвергаются существенным структурным изменениям в течение МД расчетов [19].
Таким образом, полученные данные показывают, что сконструированные нами аналоги Р-Оа1Сег, которые, согласно данным компьютерного моделирования, способны к блокаде инвариантных элементов структуры петли У3, могут быть использованы как базовые соединения для создания новых эффективных лекарственных препаратов против широкого набора вариантов ВИЧ-1.
В ходе выполнения компьютерного моделирования был проведен химический синтез и биологическое тестирование деацилированного аналога ^-Оа1Сег - ^-галактозилсфингозина,
ВИЧ-ингибирующие свойства которого предсказаны ранее [1] методами компьютерного моделирования.
В результате биологических испытаний в-га-лактозилсфингозина установлено, что полученный растворимый аналог в-GalCer обладает анти-ВИЧ активными свойствами [28]. Индекс защиты клеток в диапазоне концентраций 1,00,2 мкг/мл составил 51-53% (для азидотимидина этот показатель колебался в диапазоне 56-100%). Максимально переносимая концентрация в-га-лактозилсфингозина для клеток МТ-4 оказалась равной 8 мкг/мл. Химиотерапевтический индекс (соотношение максимально переносимой концентрации и минимально активной концентрации препарата) составил 40, что свидетельствует о высокой степени антивирусной активности [28].
Таким образом, исследования in vitro показали, что полученный деацилированный аналог в-GalCer обладает ВИЧ-ингибирующими свойствами и формирует перспективную базовую структуру для создания новых противовирусных препаратов с широким спектром нейтрализующей активности [28]. СИ
Работа поддержана Белорусским республиканским фондом фундаментальных исследований (проекты X12-022, X15-022).
Юрий Корноушенко,
научный сотрудник Института биоорганической химии НАН Беларуси Александр Тузиков,
генеральный директор Объединенного института проблем информатики НАН Беларуси, член-корреспондент
Михаил Кисель,
завлабораторией химии липидов Института биоорганической химии НАН Беларуси, профессор, доктор химических наук
Александр Андрианов,
главный научный сотрудник Института биоорганической химии НАН Беларуси, доктор химических наук Литература
1. Андрианов А.М. Конформационный анализ белков: теория и приложения / Ин-т биоорган. химии НАН Беларуси.- Минск: Беларус.навука, 2013.
2. Структурный анализ петли V3 белка gp120 ВИЧ-1 для вариантов вируса, циркулирующих в Республике Беларусь // Доклады НАН Беларуси. 2011. Т. 55, № 6. С. 79-86.
3. Определение инвариантных элементов структуры третьего вариабельного домена белка gp120 ВИЧ-1 методами молеку- 8 лярного моделирования // Математическая биология и биоинформатика. 2011. Т. 6, № 2. С. 140-153. о.
4. Structural analysis of the envelope gp120 V3 loop for some HIV-1 variants circulating In the countries of Eastern Europe // J. Biomol. J Struct. Dyn. 2013. Vol. 31, N7. P. 665-683. —
5. BioEdit // Biological sequence alignment editor for Win95/98/NT/2K/XP/7// http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit /page2. html. Ь
6. Andrianov A.M. Determination of structurally conservative amino acids of the HIV-1 protein gp120 V3 loop as promising targets for s; drug design by protein engineering approaches // Biochemistry (Moscow). 2006. Vol. 71. P. 906-914. —
7. Structure of a V3-containing HIV-1 gp120 core // Science. 2005. Vol. 310, N5750. P. 1025-1028. |
8. Sali A. Comparative protein modeling by satisfaction of spatial restraints // J. Mol. Biol. 1993. Vol. 234. P. 779-815. g
о
9. Assignment of intra-chain disulfide bond and characterization of potential glycosylation sites of the type 1 recombinant human x immunodeficiency virus envelope glycoprotein (gp120) expressed in chinese hamster ovary cells // J. Biol. Chem. 1990. Vol. 265. P. 10373-10382. i
10. Fiser A. Modeling of loops in protein structures // Protein Science. 2000. Vol. 9. P. 1753-1773. <
$
x
Полный список литературы размещен на сайте
[5 See: http://innosfera.by/2017/01/computer-based_modeling 37
