CC BY
12ПРИРОДА И СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО (NATURE & AGRICULTURE) УДК 63.636; 612.64;591.3
Валиева Г.А.
магистр технических наук Казахский национальный аграрный исследовательский университет
(г. Алматы, Казахстан)
МЕТОДЫ ИНДУКЦИИ СУПЕРОВУЛЯЦИИ С ЦЕЛЬЮ
ПОЛУЧЕНИЯ ОПТИМАЛЬНОГО КОЛИЧЕСТВА ЭМБРИОНОВ, ПРИГОДНЫХ К ТРАНСПЛАНТАЦИИ
Аннотация: были проведены исследования по разработке и усовершенствованию высокоэффективной технологии трансплантации эмбрионов чуйской популяции овец. Изучены влияния гонадотропных гормонов фоллигон (Folligon) и плюсет (Pluset) на суперовуляторную эффективность применения на матках едильбаевской породы овец.
Ключевые слова: овцы, фоллигон, плюсет, эмбрионы, суперовуляция.
В настоящее время технология ускоренного воспроизводства с применением технологии трансплантации эмбрионов включена в долгосрочные племенные программы многих развитых стран мира по разведению, улучшению и сохранению существующих животных. Это, в свою очередь, в значительной степени зависит от разработки наиболее оптимальных и экономически выгодных решений, как в технологической цепи трансплантации эмбрионов, так и при освоении и внедрении новых биотехнологических методов получения эмбрионов и сохранения их вне организма.
Большое количество половых клеток в яичниках самок и возможность более полного использования генетического потенциала особо ценных в племенном отношении маток является базовой основой метода трансплантации эмбрионов. Эффективное использование генетически ценной самки-донора с
использованием метода трансплантации эмбрионов предполагает получение от неё в одну индуцированную охоту множества оплодотворенных яйцеклеток и пересадку их менее ценным животным для получения как можно большего количества потомства. Это позволяет значительно ускорить процессы воспроизводства генетически ценных животных.
Для гормональной стимуляции множественной овуляции применяют с разной степенью эффективности отдельно или в их сочетании гонадотропные препараты гипофизарного и сывороточного происхождения, гестагены короткого и длительного действия, а также препараты с лютеолитическим эффектом.
В литературе имеется факт наличия зависимости от дозы FSHp. Использование сверх высоких доз FSHp вызывает уменьшение продукции эмбрионов, и оказывает депрессивное действие на овец, обработанных предварительно аналогом GnRH. [1]. Поскольку, предварительной обработкой подавляется эндогенный ЛГ пик овуляция индуцируется интравенной инъекцией 3 мг свиного LH (Reprobiol-Liege, University, Belgium) через 32 часа после извлечения вагинальных губок у предварительно обработанных овец [2].
Следует подчеркнуть, что к настоящему времени разработано множество протоколов индукции суперовуляции в яичниках коров с использованием гонадотропинов в сочетании с простагландинами, в соответствующих методических рекомендациях приводится большое количество схем применения гормональных препаратов используемых в этих целях [3]. Все эти методы, в общем, позволяют вызвать множественную овуляцию в яичниках у определенного процента коров. Одним из существенных недостатков имеющихся приемов индукции суперовуляции является высокая вариабельность количества получаемых от обработанных животных эмбрионов [4,5]. Поэтому особую актуальность для решения этой проблемы приобретают вопросы выравнивания по разным биологическим характеристикам коров-доноров эмбрионов и подбор оптимального сочетания индукторов и режимов их введения
для увеличения результативности суперовуляции у коров и получения относительно лучше прогнозируемого количества эмбрионов, пригодных для эмбриотрансплантаций [6, 7].
Можно ожидать, что эффективность индукции суперовуляции во многом зависит от работы гипоталамо-гипофизарно-яичниковой системы и напрямую связана с исходной активностью процессов, происходящих в этой нейроэндокринной оси конкретного организма [8]. Разнообразие реакции яичников связывается с различиями в индуцировании суперовуляции, таких как подготовка доноров, партия и общая доза основного индуктора, использование дополнительных гормонов, а также индивидуальные особенности животных. Все эти факторы могут лежать в основе вариабельности ответа на суперовуляцию при использовании известных схем ее индукции. Известные индукторы и протоколы их введения, созданные для усиления фолликулярной волны, всё же не способны исключить вариативность реакции на суперовуляцию
[9].
Материалы и методы
Синхронизация эстральных циклов доноров и реципиентов
Путь интенсификации процесса воспроизводства является биотехнологический метод синхронизации полового цикла. Основной идеей данного биотехнологического приема является возможность управлять процессами воспроизводства, целенаправленно воздействуя и изменяя проявление тех или иных репродуктивных процессов. В данном случае речь идет о практической возможности регулировать прихождение маток в охоту.
При применении метода синхронизации достигается сразу несколько целей. Во-первых, нет необходимости ждать спонтанного прихода животных в охоту. Во-вторых, метод синхронизации позволяет регулировать количество ежедневно приходящих в охоту животных, что также делает искусственное осеменение прогнозируемым. После синхронизации половая охота проявляется одновременно в течение 36-48 час. после обработки у 90-100% животных. Это
позволяет планировать начало кампании осеменения, а также регулировать количество маток в охоте. В-третьих, при хорошо организованной синхронизации нет необходимости держать на маточной отаре пробников и проводить ежедневную трудоёмкую выборку маток в охоте. При этом очень важно, что весь приплод будет гарантированно получен от назначенных в случку производителей. В-четвёртых, значительно сокращаются сроки искусственного осеменения и соответственно ягнения и козления. В зависимости от возможностей и желания сельхозпроизводителя, а также условий хозяйствования осеменение отары (600-650 маток) проводится за 8-10 дней (в место обычных 35-40). При этом ягнение/козление продолжается 15-20 дней (вместо 40-60). При применении метода синхронизации увеличение затрат на обработку животных компенсируется значительным снижением трудозатрат, повышением технологичности проведения осеменения и ягнения/козления, отсутствием затрат на содержание пробников. В результате прямые затраты на проведение кампании осеменения снижаются в среднем на 50-60%. Для обеспечения круглогодичного цикла воспроизводства применяют метод индукции половой охоты в анэстральный период. Для синхронизации половых (эстральных) циклов у овец-доноров и у овец-реципиентов применяли препарат эстрофан (Чехия), данный препарат является аналогом простагландина F2a. При применении данного препарата прерывается лютеолитическая фаза полового цикла, т.е. его применение вызывает лизис желтого тела яичника и соответственно прекращение синтеза и выброса прогестерона, гормона беременности. В эксперименте для синхронизации половых циклов у доноров и реципиентов применяли внутримышечную инъекцию эстрофана в дозе 250 мкг для каждого животного. В течение 5 дней проверяли животных на наличие эструса с использованием баранов-пробников.
В ходе исследований по синхронизации половых циклов у доноров и реципиентов с применением эстрофана в дозе 250 мкг было выявлено, что из 36 голов (18 доноров и 18 реципиентов) синхронизация циклов была достигнута у
20 животных, что составляет 65,3%. Таким образом, применение препарата эстрофана в дозе 250 мкг уровень синхронизации половых циклов у овец-доноров и у овец-реципиентов достигает 65,3%.
Индукция суперовуляции у овец шуйской популяции в анэстральные и эстральные сезоны
Для стимуляции суперовуляции были использованы различные типы гормональных препаратов: гонадотропин гипофизарный - Плюсет (Pluset) (Laboratorios Calier S.A., Barcelona) и гонадотропин сывороточный - Фоллигон (Folligon) (Intervet International B.V., Нидерланды); плацентарный хорулон -(Chorulon) (Intervet International B.V., The Netherlands); простагландин -Эструмэйт (Estrumate) (Vet Pharma Friesoythe GmbH, Germany).
Для индукции суперовуляции у овец Фоллигон вводили в дозах 1000 -1200 МЕ, согласно приведённой схеме (табл 1).
Таблица 1 - Схема применения препарата Фоллигон.
День полового цикла Препарат Доза и способ введения
11 Фоллигон 1000-1200 М.Е., в/м
12 - -
13 Эструмейт 125-250 мкг, в/м
14-15 Хорулон (hCG) 300-500 МЕ, в/в
Охота, осеменение
Через 48 ч после начала обработки Фоллигоном вводили Эструмейт -препарат простагландина F2 альфа. Для стимуляции овуляции и повышения оплодотворяемости применяли Хорулон (СИоги1оп) однократно внутримышечно (в/м) или внутривенно (в/в) в дозе 300-500 М.Е., в день охоты перед осеменением за 3-5 часов.
Выявление овец - доноров эмбрионов в охоте проводили 2 раза в день. По мере прихода животных в охоту их случали с баранами-производителями соответствующей породы дважды в день до окончания охоты.
Активность действующего вещества в 1 мл раствора - 50 МЕ фолликулостимулирующего гормона и 50 МЕ лютеинизирующего гормона. Препарат вводили на 8 - 11 дни полового цикла, внутримышечно 2 раза в сутки, с интервалом в 12 часов, в понижающихся дозах, общая доза составляла 250-300 И.Е. (табл. 2).
Таблица 2 - Схема применения препарата Плюсет
День введения препарата Часы введения Препарат Доза Активность дозы Способ введения
День 1 07:00 ч Плюсет 1,0 мл 50 М.Е. в/м
19:00 ч 1,0 мл 50 ЕД -
День 2 07:00 ч Плюсет 0,5 мл 25 ЕД -
19:00 ч 0,5 мл 25 ЕД -
День 3 07:00 ч Плюсет 0,5 мл 25 ЕД
19:00 ч 0,5 мл 25 ЕД -
День 4 07:00 ч Плюсет Эструмейт 0,5мл 0,5мл 25 ЕД 125 мкг
19:00 ч Плюсет 0,5 мл 25 ЕД -
День 5 07:00 ч 19:00 ч Хорулон 1,0 300 М.Е. в/в
Охота, осеменение
Через 60 часов после начала обработки Плюсетом вводили препарат простагландина F2X. Эструс регистрируется через 36-40 часов после введения
простагландинов. Хорулон (Chorulon) применяли в дозе 300-500 М.Е. однократно в/м или в/в, в день охоты перед осеменением за 3-5 ч.
Выявление овец - доноров эмбрионов в охоте проводили 2 раза в день. По мере прихода животных в охоту их случали с баранами-производителями соответствующей породы дважды в день до окончания охоты.
Морфологическая оценка эмбрионов
Полученные эмбрионы сразу же после обнаружения под микроскопом (стереоскопический микроскоп МБС-9) оценивали по морфологическим признакам, под фазово-контрастным микроскопом Axiostar Plus (Zeiss, Germany) при 60-80 -кратном увеличении.
Характеристика состояния эмбрионов необходима для выявления среди них способных, к развитию и пригодных для пересадки реципиенту. При оценке учитывали стадию развития эмбриона, соответствие ее хронологическому возрасту, определяли морфологическое состояние эмбриона и, исходя из этих критериев, устанавливали его качество и пригодность для дальнейшего использования. Морфологическую оценку качества эмбрионов проводили под стереомикроскопом с увеличением в 60-80 раз. Стадии развития эмбриона согласно международной классификации (International Embryo Transfer Society, IETS).
Результаты и обсуждение
Индукция суперовуляции у овец чуйской популяции в анэстральные и эстральные сезоны
Проведены работы по выборке овец в естественной охоте для подбора групп доноров эмбрионов по принципу аналогов. Установлена продолжительность половых циклов у экспериментальных животных.
Десять овец были разделены на 2 группы. Овец I группы (n=5) стимулировали по схеме 1 (Фоллигон 1000-1400 МЕ). Через 48 ч вводили Эструмейт в дозе 250 мкг. Овец II группы (n=5) стимулировали по схеме 2
(Плюсет 250-300 И.Е.). Плюсет вводили в уменьшающихся дозах, два раза в день, начиная с 8-10 дня цикла. Препарат простагландина F2a в дозе 125 мкг вводили через 60 часов после начала обработки Плюсетом. Всем маткам вводили Хорулон (300-500 М.Е.) через 8 ч после начала эструса.
После начала течки овцы естественно случались с баранами дважды в день до конца течки. Спустя 3 дня после спаривания, была сделана паховая лапаротомия, и зарегистрировано число жёлтых тел. Эмбрионы были получены хирургически путем при промывании каждого рога матки. Результаты гормональной стимуляции овцематок приведены в таблице 3 (табл. 3).
Таблица 3 - Суперовуляторная реакция яичников в зависимости от типа гормонального препарата
Показатель Тип препарата
Фоллигон Плюсет
Обработано овец 5 5
Из них с полиовуляцией: п (%) 3(60) 5 (100)
Число овуляций на донора: среднего 7,9±4,2 8,2 ± 0,10
положительного 7,2 ± 4,5 8,0 ± 0,10
Выход эмбрионов, % 68,5 72,6
Число полноценных эмбрионов 6,5 ± 0,9 6,9 ± 0,7
Из 5 овец, которым вводили Фоллигон, у 3 животных средний уровень овуляции на положительного донора составил 7,2 ± 4,5 выход эмбрионов в среднем составил 68,5%, а количество полноценных эмбрионов 6,5±0,9 на донора. Все животные (5 голов) обработанные Плюсетом, обнаружили суперовуляторную реакцию, (8,2±0,10 на одного донора) соответственно. Выход эмбрионов и количество полноценных эмбрионов составили 72,6% и 6,9±0,7
соответственно. Статистические различия в овуляциях, выходе эмбрионов и степени оплодотворения между группами, были незначительны.
Трансплантация эмбрионов реципиентам
После морфологической оценки эмбрионов, проводили трансплантацию эмбрионов реципиентам хирургическим методом. Получены следующие результаты: первичная приживляемость составила 50,0% (табл. 4).
Таблица 4 - Изучение приживляемости при применении хирургического метода трансплантации эмбрионов
Показатель Хирургический метод
Общее количество трансплантированных эмбрионов, п 10
Общее количество реципиентов, п 10
Общее количество суягных реципиентов, п (%) (первичная приживляемость) 8
Общее количество рожденных ягнят, п (%) 5 (50%)
Выводы
Таким образом можно заключить, что в период сезона размножения показана эффективность применения гормональных препаратов фоллигон и плюсет для гормональной стимуляции суперовуляции и полученяи полноценных эмбрионов у овец чуйской популяции.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
1. Cognië, Y., Baril G., Poulin N., Mermillod P. Current status of embryo technologies in sheep and goat// Theriogenology.-2003.- Vol. 59.- P. 171-188.
2. Gharbi I., Ferrouk M., Dechicha A., Baril G., Beckers J.F., Guetarni D. Follicular status and Embryo Production in Ouled Djellal (Algeria) ewes breed
pretreated with a GnRH Agonist//J.of Animal and Veterinary Advances.- 2012.-Vol.11.- Р. 791-798.
3. Chebel RC., Demetrio DGB., Metzger J. Factors affecting success of embryo collection and transfer in large dairy herds. Theriogenology 2008;69:98-106.
4. Betteridge KJ. Farm animal embryo technologies: Achievements and perspectives. Theriogenology 2006; 65: 905-913.
5. Scherzer J., Fayrer-Hosken RA., Ray L., Hurley DJ., Heusner GL. Advancement in large animal embryo transfer and related biotechnologies.Reprod Domest Anim 2008;43:371-6.
6. Мадисон В., Мадисон Л. В помощь "новому" скотоводу // Молочное и мясное скотоводство. - 2003. - № 4. - С. 10-16.
7. Малинин В.В. Механизмы пептидной регуляции гомеостаза В.В .Малинин, В.Г.Морозов // Клиническая фармакология тимогена. — М., 2004.- гл. 1. - С. 718.
8. Ginther OJ., Beg MA., Donadeu FX., Bergfelt DR. Mechanism of follicle deviation in monovular farm species. Anim Reprod Sci 2003; 78:23 9-25 7.
9. Попов Д.В. Безбородов Н.В. Повышение качества эмбриопродуктивности у коров-доноров./Вестник Орел ГАУ 4/11.
Valiyeva G.A.
Master of Technical Sciences Kazakh National Agrarian Research University (Almaty, Kazakhstan)
METHODS OF INDUCTION OF SUPEROVULATION
IN ORDER TO OBTAIN THE OPTIMAL NUMBER OF EMBRYOS SUITABLE FOR TRANSPLANTATION
Abstract: research was carried out on the development and improvement of a highly effective technology for embryo transplantation of the Chui sheep population. To study the effect of gonadotropins Folligon and Pluset on the superovulatory efficacy of the use on the uterus of the Chui sheep population.
Keywords: sheep, folligon, pluset, embryos, superovulation.
