CC BY
23
membranes of the upper respiratory tract and in the air livestock buildings is Enterococcus spp. with antibiotic-resistant properties.
УДК 599.735:616.-078.7+591.131+612.1
МЕТОДОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТАРНОЙ АКТИВНОСТИ СЛЮНЫ И СЫВОРОТКИ ЖВАЧНЫХ ЖИВОТНЫХ
Покровская Е.С., Малев А.А.*, Гильмутдинов Р.Я., Махамат М.К., Хуснутдинов Н.Н.**, Караганова Н.С.**.
ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана»
ГОУ ДПО «Казанская государственная медицинская академия Федерального агенства по здравоохранению и социальному развитию»* МУЗ «Городской диагностический центр по лабораторной диагностике инфекционных заболеваний», г. Казань**
Ключевые слова: слюна, комплемент, коровы, овцы, верблюдица, человек.
Key words: saliva, complement, cows, sheeps, camelus, man.
Мощным стимулятором лизиса бактерий, циркулирующим в крови, присутствующим в ротовой полости животных и человека и принимающим ключевое участие в механизме защиты организма от инфекций, является система комплемента (Мартынова В.А., Голосова Т.В., 1989; Smith D., Taubman M., 1992). Это сложный комплекс функционально связанных между собой белков, для которых характерно быстрое многократное усиление ответа на первичный сигнал за счет каскадного процесса, когда продукт одной реакции служит катализатором последующей. Большое количество работ посвящено определению комплементарной активности сыворотки крови человека и единичных видов животных. Исследования же системы комплемента слюны немногочислены и осуществляются, в основном, в медицине зарубежными исследователями и лишь в пределах лабораторий.
Используемые в ветеринарии методики исследования комплемента, первоначально разработаны применительно к сыворотке крови человека и включают как функциональные тесты (определение активности комплемента), так и методы количественного анализа (установление уровня отдельных белков данной системы). Комплемент слюны же изучают, как правило, с помощью иммунохимических методов:
электрофореза в натрий додецил сульфат полиакриламидном геле БОБ-РЛОБ, иммуноблоттинга, радиоиммунного анализа, а функциональные тесты применительно к слюне вообще отсутствуют.
Вышеизложенное свидетельствует о необходимости разработки новых методик исследования комплементарной активности слюны животных разных видов, адаптации и совершенствования существующих для ветеринарной практики, а также повышения информативности данного показателя путем минимизации влияния методических факторов на его величину.
Материалы и методы. Слюну получали от клинически здоровых нестельных коров черно-пестрой породы в возрасте 4-6 лет массой от 300 до 400 кг (10 голов), содержавшихся на молочно-товарной ферме ООО «Серп и Молот», с. Шапши, Высокогорского района РТ, благополучного по инфекционным заболеваниям, а также от овец в возрасте 2-х лет (10 голов) и верблюдицы в возрасте 6 лет из Казанского зооботсада. Сбор ее проводили методом самоистечения после фармакологической активации секреции 1 %-ным раствором пилокарпина гидрохлорида в дозах 15; 2,5 и 15 мл коровам, овцам и верблюдице, соответственно. Кровь у животных забирали из яремной вены стерильно специальными системами во флаконы емкостью 250 мл. Кровь для получения сыворотки у людей (5 человек, в возрасте 23-25 лет) брали из локтевой вены в вакуумные пробирки, а нестимулированную смешанную слюну - методом сплевывания.
Сыворотку крови человека и животных получали по методике Н.И. Гурьянова (1992), центифугировали при 1,5 тыс. об./мин 15 мин и замораживали, после чего часть ее после размораживания пропускали через мембранные фильтры фирмы «МИНроге» диаметром пор 0,22 мкм, другую - не фильтровали. Слюну замораживали сразу после сбора, после размораживания одну ее половину центрифугировали при 3 тыс. об./мин 10 мин, после чего часть надосадочной жидкости фильтровали, другую -исследовали сразу после оттаивания, оставшуюся половину использовали нецентрифугированной.
Комплементарную активность слюны и сыворотки крови животных определяли по методикам Г.Ф. Вагнера (1963) и Л.С. Резниковой (1967). Кроме того, оценивали % гемолиза сыворотки крови и слюны человека.
Результаты исследования. Показаны крайне низкие (не более 2-3 % гемолиза в образцах сыворотки крови) вплоть до их отсутствия величины активности комплемента сыворотки крови и слюны жвачных животных при использовании методики Г.Ф. Вагнера (1963).
Результаты исследования сыворотки крови и слюны человека и животных по методике Л.С. Резниковой (1967) представлены в таблицах 1 - 3.
1. Влияние преаналитических процедур на активность комплемента (% гемолиза) нефильтрованной сыворотки крови человека и животных
Образцы Количество сыворотки, мл
сыворотки 0,05 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 1,0
Человек
Неразбавленная 8,9 17,5 33,2 51,4 68,8 85,6 165±3
Разбавленная 4,2 8,5 16,5 24,6 32,2 46,3 83±3
1:10
Коровы
Неразбавленная 1 2 3,5 5,4 7,2 9,4 31,6±3
Овцы
Неразбавленная 0,8 1,5 3 4,5 6,5 8,4 28,7±3
2. Активность комплемента (% гемолиза) слюны человека и животных
Образцы слюны Количество слюны, мл
0,05 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 1,0
Человек
Центрифугированная:
Нефильтрованная:
неразбавленная
4,3
20,4
65±3
разбавленная 1:10
Фильтрованная:
неразбавленная
1
6,7 9,2 16,4 28,7
71,4±3
Нецентрифугированная:
неразбавленная
4
17,5 25
36 44,6
89,3±3
Коровы
Центрифугированная:
Нефильтрованная:
неразбавленная
0
2,4 3,2
6,6
14±3
Нецентрифугированная:
неразбавленная
0
2,3
6,5
11,5
23±3
Овцы
Центрифугированная:
Нефильтрованная:
неразбавленная
0
1,9 2,8
5,7
12±2
Нецентрифугированная:
неразбавленная
0
1,2
3,5
10,2
20,5±2
0
1
2
0
0
0
0
0
2
4
2
0
1
1
0
1
При исследовании сыворотки крови и слюны человека и животных точка 50 % гемолиза установлена лишь у сыворотки крови человека; у
животных, как видно из таблиц, активность комплемента была крайне низкой, вплоть до ее полного отсутствия. Поэтому, чтобы повысить информативность данных (% гемолиза) мы видоизменили методику Л.С. Резниковой (1967), добавив к стандартному ряду проб еще одну, куда стали вносить по 1 мл гемолитической системы и исследуемой жидкости. При этом, как видно из таблиц, % гемолиза в пробах с неразбавленной нефильтрованной сывороткой коров повысился с 9,4 до 31,6±3; овец - с 8,4 до 28,7±3; человека - с 85,6 до 165±3. В пробах с нецентрифугированной неразбавленной слюной % гемолиза возрос у коров с 11,5 до 23±3; овец - с 10,2 до 20,5±2; верблюдицы - с 9,7 до 21,3; человека - с 44,6 до 89,3±3; с центрифугированной - у коров с 6,6 до 14±3; у овец - с 5,7 до 12±2; у верблюдицы - с 6 до 11; у человека с 20,4 до 65±3. Исходя из этого, анализ и сравнение результатов производили по данным дополнительной пробы каждого ряда исследований.
3. Активность комплемента (% гемолиза) слюны в усовершенствованной нами методике Л.С. Резниковой (1967)
Способы обработки Вид животного
человек коровы овцы
Нецентрифугированная:
неразбавленная 89,3±3 23±3 20,5±2
разбавленная:
1:2 11,4±3 7,2±1,5 6,3±1,5
1:5 7,1±1,5 5,4±0,5 4,8±0,5
1:10 5,4±0,5 3,6±0,5 2,8±0,5
1:15 3,6±0,5 1,8±0,5 1,2±0,5
1:20 1,8±0,5 0,9±0,2 0,4±0,2
Фильтрованная:
неразбавленная 71,4±3 16±2 14±2
Во всех пробах стандартного ряда (от 0,05 до 0,5 мл исследуемой жидкости), содержащих разбавленную 1:10 нефильтрованную сыворотку крови и слюну коров и овец, а также разбавленную 1:10 фильтрованную слюну человека величины активности комплемента отсутствовали. В дополнительных пробах с фильтрованной неразбавленной сывороткой коров и овец % гемолиза составил 35,5±2 и 30,9±2 соответственно, с фильтрованной неразбавленной слюной верблюдицы - 14.
Максимальная активность комплемента наблюдается в образцах неразбавленной сыворотки крови и нецентрифугированной слюны человека. Во первых % гемолиза в 5,2 и 4,6; 5,7 и 5,3 раза выше, чем в
пробах с нефильтрованной и фильтрованной сывороткой коров и овец; в последних - в 3,9 и 4,7 раза таковых у коров и овец.
Активность комплемента фильтрованной сыворотки коров и овец незначительно выше (в 1,1 и 1,07 раза соответственно) нефильтрованной. В пробах с центрифугированной нефильтрованной слюной у коров, овец, верблюдицы и человека % гемолиза в 1,1; 1,1; 1,3 и 1,09 раза ниже, чем с фильтрованной.
Комплементарная активность нецентрифугированной
неразбавленной слюны человека и животных выше центрифугированной нефильтрованной у коров, овец, верблюдицы и человека в 1,6; 1,7; 1,9 и 1,4 раза; фильтрованной - в 1,4; 1,5; 1,5 и 1,2 раза соответственно.
Активность комплемента неразбавленной нецентрифугированной слюны выше разбавленной. При этом, как видно из таблицы № 3, % гемолиза падает непропорционально степени разведения слюны.
Комплементарная активность фильтрованной сыворотки крови коров и овец выше нецентрифугированной неразбавленной слюны в 1,5 раза соответственно. В пробах с неразбавленной сывороткой крови человека % гемолиза в 1,8 раз выше, чем с нецентрифугированной неразбавленной слюной, а с разбавленной сывороткой - в 1,07 раз соответственно ниже.
При увеличении в дополнительной пробе количества неразбавленной центрифугированной слюны величина комплементарной активности возрастает: % гемолиза 1 мл слюны коров составляет 14±3; овец - 12±2; верблюдицы - 11; 1,5 мл слюны - 25±3; 23±3; 32; 2 мл слюны -43±3; 41±3; 53 соответственно. У коров при увеличении в дополнительной пробе как количества слюны, так и гемолитической системы до 1,5 мл соответственно, % гемолиза увеличивается незначительно, до 19.
Отмечаются гендерные различия в активности комплемента неразбавленной нефильтрованной сыворотки и центрифугированной слюны овец и баранов: 26,4 и 29,1; 11 и 13 % гемолиза соответственно.
Обсуждение. По методике Г.Ф. Вагнера (1963) исследуемая жидкость в опытной пробе разбавляется в 100 раз. Л.С. Резникова (1967) предлагает стандартный ряд опытных проб (10) с дозами исследуемой жидкости от 0,05 до 0,5 мл. При этом биологическая жидкость предварительно разводится в 10 раз, поэтому минимальное ее разбавление в пробе составляет 1:40, максимальное - 1:400.
В наших же исследованиях помимо разведенных 1:10 использовались и неразведенные сыворотка крови и слюна животных, поэтому минимальное их разбавление в последнем случае в пробе составило 1:4, максимальное - 1:40. В предложенной нами модификации, т.е. при добавлении дополнительной пробы к стандартному ряду, куда вносится по 1 мл гемолитической системы и исследуемой жидкости, последняя разбавляется лишь в 2 раза.
Кроме того, по методике Л.С. Резниковой (1967) концентрация эритроцитов определяется с помощью фотоэлектроколориметра по оптической плотности раствора. Это намного достовернее установления концентрации эритроцитов устаревшим и менее точным гемометром Сали, согласно методике Г.Ф. Вагнера (1963).
Как видно из таблиц, активность комплемента жвачных животных как в сыворотке, так и в слюне даже в дополнительной пробе низкая. Наши данные подтверждают сведения о слабой комплементарной активности слюны и сыворотки млекопитающих.
Возможно, низкая активность комплемента как сыворотки крови, так и слюны жвачных связана с типом питания этих животных: преобладанием в рационе растительных кормов, а также с их высокой продуктивностью (молочной, мясной, шерстной). Низкая же активность комплемента слюны жвачных также может быть связана со стимуляцией парасимпатических окончаний раствором пилокарпина, что вызывает образование большого количества слюны с низким содержанием белка. Установлено, что уровень комплемента поддерживает вегетативная нервная система: возбуждение симпатической нервной системы ведет к повышению титра комплемента, парасимпатической - наоборот (цит. по Л.С. Резниковой, 1967). Кроме того, физиологические особенности желудочно-кишечного тракта и пищеварения этих животных также могут влиять на величину данного показателя: за сутки жвачными выделяется огромное количество слюны (до 250 л у коров), поэтому последняя менее концентрированная по содержанию отдельных белков, гликопротеинов и других химических веществ в отличие от плотоядных и всеядных. Так, по данным C. Schneyer, L. Schneyer (1967), сухой остаток (в среднем 5-7 г ежедневно) в слюне человека, больше, чем на половину представлен органическими веществами; содержание сухого вещества в слюне овец ниже в 1,4 раза такового у человека, а у коров оно составляет 1,02%.
Возможно, низкий уровень активности комплемента слюны жвачных связан также с крайне малым количеством в ней пропердина (Mintaa J. et al., 1976). Кроме того, дефицит Ig G и Ig М, а также sIg А в ротовой полости может отразиться на величине данного показателя, т.к. первый усиливает фагоцитоз и киллинг микробов ротовой полости посредством активации данной систем белков или опсонизации, второй обеспечивает активацию комплемента по классическому пути, а третий - по альтернативному пути. К тому же, для активации комплемента необходимо также посредничество фагоцитов. Но фагоцитоз в полости рта слабее, чем в крови (Lehner T. 1992.). R. Boackle (1991) установил, что на активацию комплемента влияют такие факторы как ионная сила слюны (низкая в сравнении с сывороткой) и наличие главных гликопротеинов слюны. Так, кислые богатые пролином белки слюны способны разрывать
несвязанный комплекс макромолекул C1q-C1r2-C1s2, ограничивая тем самым функции комплемента.
Вероятно, высокая комплементарная активность
нецентрифугированной (интактной) слюны по сравнению с центрифугированной связана с присутствием в первой значительного количества разнообразных антимикробных факторов, губительно действующих на бактерии, и их оседанием, в том числе и отдельных фракции комплемента, при центрифугировании во второй. К тому же, после замораживания и оттаивания образцов муцин слюны, способный связывать отдельные антибактериальные факторы и тем самым понижать их активность, деградирует и при центрифугировании легко оседает. Отличие комплементарной активности нефильтрованной слюны от фильтрованной связано с наличием микробов в первой. Бактерии способны инактивировать комплемент путем адсорбции и выделения антикомплементарных веществ (цит. по Л.С. Резниковой, 1967).
Выводы. Определение комплементарной активности слюны и сыворотки жвачных животных рациональнее проводить по методике Л.С. Резниковой (1967), добавив к стандартному ряду проб еще одну, куда необходимо вносить по 1 мл гемолитической системы и исследуемой жидкости. При этом сыворотка крови и слюна животных должны быть неразбавленными, а последняя - к тому же нецентрифугированной.
ЛИТЕРАТУРА: 1. Вагнер, Г.Ф. Колориметрическое определение комплементарной энергии крови / Г.Ф. Вагнер // Лаб.дело.- 1963.-№1.- С. 44-46. 2. Гурьянов, Н.И. Усовершенствование технологий получения сывороток крови кур, бычков, эмбрионов коров и изучение их свойств при культивировании клеток и вирусов: Автореф. дисс. ... канд.биол.наук / Н.И. Гурьянов-Казань, 1992.- 19 с. 3. Мартынова, В.А. Состояние системы комплемента при инфекционных и неопластических процессах / В.А. Мартынова, Т.В. Голосова //Лаб.дело.-1989.-№2.- С.4-9. 4. Резникова, Л.С. Комплемент и его значение в иммунологических реакциях / Л.С. Резникова - М.: Медицина, 1967.-272 с. 5. Boackle, R. The interaction of salivary secretions with the human complement system - a model for the study of host defense systems on inflamed mucosal surfaces / R. Boackle // Crit. Rev. Oral. Biol. Med. - 1991.- № 2.- P. 355-367. 6. Lehner, T. Immunology of oral diseases, 3rd ed. / T. Lehner- Blackwell Scientific Publications, Oxford, United Kingdom, 1992. 7. Mintaa, J.O. et al. Distribution and levels of properdin in human body fluids / J.O. Mintaa, P.D. Jezyka, I.H. Lepowa // Clin. Immun. and Immunopathol.- V. 5.- 1976.- P. 84-90. 8. Schneyer, C. Secretory mechanisms of salivary glands / C. Schneyer, L. Schneyer- New York: Academic Press, 1967. 9. Smith, D. Ontogeny of immunity to oral microbiota in humans / D. Smith, M. Taubman // Crit. Rev. Oral. Biol. Med.- 1992.- V. 3.- P. 109-133.
МЕТОДОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТАРНОЙ АКТИВНОСТИ СЛЮНЫ И СЫВОРОТКИ ЖВАЧНЫХ ЖИВОТНЫХ
Покровская Е.С., Малеев А.А.,Гильмутдинов Р.Я., Махамат М.К., Хуснутдинов Н.Н., Караганова Н.С.
Резюме
Проведено сравнение двух методик по определению активности комплемента в слюне и сыворотке крови человека и животных. Предложено оценивать % гемолиза в слюне и сыворотке крови жвачных животных по методике Л.С. Резниковой (1967), добавив к стандартному ряду проб еще одну, куда необходимо вносить по 1 мл гемолитической системы и исследуемой жидкости. Показаны видовые особенности комплементарной активности слюны и сыворотки крови жвачных животных. Установлены гендерные различия в комплементарной активности слюны овец.
METODOLOGIC ASPECTS OF SALIVA COMPLEMENTARY ACTIVITY AND RUMINANTS' SERUM INVESTIGATION
Pokrovskaya E.S., Malev A.A., Gilmutdinov R.Y., Mahamat M.K., Husnutdinov N.N., Karaganova N.S.
Summary
Comparison of few methods of complement activity definition in saliva and serum of people and herbivorous animals was carried out. To evaluate a hemolysis % in saliva and serum of people and herbivorous animals, modificated method of L.S. Reznikova (1967) was offered. One more sample, where 1 ml hemolytic system and 1 ml testing fluid was poured in, was added to standard samples row. Low complement activity in herbivorouses saliva and serum was revealed. Species peculiarities of complement activity in herbivorouses saliva and serum were demonstrated. Sexual distinctions of salivary complement activity in sheeps were determinated.
УДК 619:614:2
ЦЕЛЕВАЯ ПРОГРАММА ПО ОБЕСПЕЧЕНИЮ БЕЗОПАСНОСТИ СИБИРЕЯЗВЕННЫХ СКОТОМОГИЛЬНИКОВ
Сабирьянов А.Ф.
ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана»
Ключевые слова: скотомогильник, безопасность, целевая программа.
