CC BY
66УДК 619:616-003.725:602.628 DOI 10.33632/1998-698Х.2021-3-33-39
МЕТОДИКА ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПОСОМАЛЬНЫХ СИСТЕМ ДОСТАВКИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ
ВЕЩЕСТВ В ОРГАНИЗМ ЖИВОТНЫХ
А.В. Поздеев- доктор биологических наук, Н.П. 'Щербаков, кандидат биологических
наук, 2 Р.Н. Низамов - доктор ветеринарных наук, профессор
ФГКВОУ ВО «Военная академия радиационной, химической и биологической защиты им. Маршала Советского Союза С.К. Тимошенко» 156016, Россия, г. Кострома, ул. Горького, д. 16,
e-mail: varbz@mil.ru
2ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», 420075, г. Казань, Научный городок-2, e-mail: vnivi@mail.ru
Проведены исследования по изучению свойств и способов получения нанокапсулированных форм лекарственных веществ, на основе которых обоснован выбор липосом в качестве средств доставки биологически активных веществ. Для инкапсулирования в липосомы использовано биологически активное вещество 3,5-диметил-1-фенил-1Н-пиразол-4-сульфонил хлорид. Для получения липосом из доступного природного сырья (свежего головного крупного рогатого скота) получена смесь фосфолипидов. Инкапсулирование проведено методом коацервации. В результате исследования получены липосомы с размерами (1304±318) нм (68 %) и (214±39) нм (32 %). Дзета-потенциал полученной коллоидной системы составил минус 36,1±4,3, что свидетельствует о хорошей агрегативной устойчивости системы. Таким образом, на примере пиразолсульфохлорида предложена методика получения его липосомальной формы, которую возможно использовать для доставки гидрофобных лекарственных веществ в организм животных. Методика обладает такими преимуществами как простота, доступность исходных материалов и отсутствие необходимости использования дорогостоящего оборудования.
Ключевые слова: липосомы, капсулирование, биологически активное вещество.
Введение. В настоящее время нано-технологиям принадлежит большое значение в современной науке и практике, они успешно применяются в различных областях (медицине, биотехнологии, химии и химиической промышленности, машиностроении, сельском хозяйстве, пищевой промышленности, косметике и др.). Особого внимания заслуживает нанокап-сулирование, которое является весьма перспективным направлением в медицине, в частности, в фармакологии. Немаловажной проблемой в области разработки и применения лекарственных веществ (ЛВ) является обеспечение избирательного, локального воздействия ЛВ непосредственно на патологический очаг в целях снижения негативного влияния на организм в целом.
Одним из многообещающих направлений исследований в медицине (в том числе и ветеринарии) является разработка идеальных способов направленного транспорта лекарств в
искусственных контейнерах, которые позволят повысить эффективность и безопасность препаратов. Сама идея неинвазивной доставки ЛВ является востребованной и прогрессирующей технологией, применяемой для лечения различных заболеваний. В основе такой доставки находится пространственная изоляция ЛВ от внешней среды, благодаря внедрению их в искусственно получаемые наноразмерные оболочки [3, 9]. В качестве оболочек, возможно, использовать липосомы, фуллерены, углеродные нанотрубки, полимерные капсулы и другие [5].
На современном этапе липосомы наиболее эффективно используются в медицине в качестве носителей биологически активных веществ. Липосомы состоят из амфифильных фосфолипидов (ФЛ), которые образуют от одного до нескольких бимолекулярных слоев, и представляют собой сферические оболочки
размером от 20 нм до 50 мкм, содержащие внутри воду или раствор [2, 14].
Наиболее доступным исходным материалом для создания липосом являются ФЛ, изолированные из материалов природного происхождения. Так, исходным сырьём для получения ФЛ в медицинских целях чаще всего служат желтки куриных яиц или соевые бобы, однако возможно использование и других видов растительного сырья и тканей животных. Например, для получения липосом использовались яичный, соевый [4] и арахисовый [11] лецитин и др. Интересен также тот факт, что компле-ментарность липосом к определённым орга-нам и тканям повышается при получении их из ФЛ и гликолипидов, содержащихся и выделенных из тканей этих органов. В исследовании [6] представлены данные наиболее эффективного состава ФЛ для сборки липо-сом, используемых для транспорта веществ в различные органы. Так, для транспорта в ткани головного мозга и печени наиболее эффективен сульфатид, в ткани селезенки — ганглииозиды, в ткани легких — сфингомиелин. Липосомаль-ные формы различных лекарственных препаратов получили широкое применение в диагностике и лечении онкологических патологий, иммунологии, офтальмологии, дерматологии, неврологии и в других областях медицины. Липосомальные капсулы обеспечивают поддержание высокой концентрации ЛВ в крови и клетках организма на протяжении длительного времени, а также способствуют преодолению клеточных барьеров и доставке веществ к клет-камбиомишеням, к которым иногда невозможно доставить лекарственные средства в некапсулированных формах. Именно с этими свойствами и связано быстрое расширение области практического применения липосо-мальных форм веществ. Так, в обзоре международной группы под руководством Pattni B.S. [12, 13] исследователи систематизировали основные достижения в области липосомальных лекарственных форм и выделили наиболее перспективные направления для ее дальнейшего развития. В частности, в обзоре:
- показано, что исследования свойств, способов получения и применения липосом проводятся научными организациями по всему миру, о чем свидетельствует значительное количество публикаций;
- представлены актуальные методы синтеза липосомальных частиц, перечислены преимущества и недостатки большинства технологий;
- рассмотрены основные виды липо-сомальных частиц, отличающиеся различным строением оболочки, наличием адресных
фрагментов для селективного взаимодействия с клетками и направленного транспорта;
- рассмотрены возможные варианты доставки ЛВ при помощи липосом.
Особого внимания заслуживает способность липосом доставлять биологически активные вещества непосредственно в клетку, с чем связано достижение наилучшего терапевтического результата по сравнению с использованием свободной формы лекарствен-ного препарата, в отличие от других СД (система доставки), высвобождающих активные вещества в плазме или непосредственно в месте введения.
Цель исследования - изучение возможности получения липосомальной средств доставки ЛВ в организм животных.
Материалы и методы. Для проведения работы использованы: природное сырье (свежий головной мозг крупного рогатого скота), 1,5-диметил-1-фенил-1Н-пиразол (Merk, Германия), хлорсульфоновая кислота (хч, Merk, Германия), пятиокись фосфора (СТП ТУ КОМП 1-250-10), ацетон (ГОСТ 2603-79), хлороформ (ГОСТ 20015-88), метанол (ГОСТ 2222-95).
Синтез 3,5-диметил-1-фенил-1Н-пи-разол-4-сульфонил хлорида осуществляли прибавлением по каплям 3,5-диметил-1-фенил-1Н-пиразола к 10-ти кратному избытку хлорсульфоновой кислоты при комнатной темпе-ратуре с последующим нагреванием реакциионной массы до 140-160 оС в течение 12 часов.
ФЛ получали трехэтапным способом. В ходе первого этапа производили гомогенизацию мозга крупного рогатого скота в пятикратном избытке ацетона, чем обеспечивается обезвоживание исходного сырья и частичная экстракция нелипидных водорастворимых примесей и липидных соединений, не относящихся к группе ФЛ. На втором этапе проводили экстракцию ФЛ из полученного осадка смесью растворителей хлороформа и метанола, а на третьем этапе -очистку ФЛ от оставшихся примесей путем их осаждения при добавлении охлажденного абсолютного ацетона в соотношении 5:3 относительно полученного экстракта.
Инкапсулирование пирразолсульфо-хлорида (ПС) в липосомы осуществляли методом коацервации. Полученную смесь фос-фолипидов растворяли в воде до образования коллоидного раствора, а ПС растворяли в избытке ацетона. Полученный раствор ПС добавляли к коллоидному раствору фосфо-липидов, смесь выдерживали 1 час при 4050 оС, после чего проводили десольватацию ПС упариванием ацетона до начала интенсивного испарения воды.
Результаты исследований. Существующие системы доставки ЛВ можно условно классифицировать на биологические (биогенные), органические и неорганические полимеры (таблица) [10].
На основе проведенного анализа представленных видов наноносителей по методам получения, свойствам и области приме-нения удалось выделить основные преимущества липосом перед другими средствами транспорта. Молекулы ФЛ являяются сложными эфирами глицерина и жирных кислот и поэтому обладают таким уникальным свойством как амфифильность. Благодаря наличию в молекуле ФЛ гидрофобной и гидрофильной частей, при помещении в воду происходит самопроизвольная организация молекул, то есть гидрофильная «головка» ФЛ направлена наружу, в то время как гидрофобный «хвост» обращен внутрь. Таким образом, с минимальными энергетическими затратами возможно получить различные частицы (например: липосомы, мицеллы, везикулы) с раз-
мерами от нескольких нанометров. Как известно, в ходе самосборки подобных частиц происходит и захват молекул веществ, находящихся в растворе. Встроенные в липосомы вещества довольно просто проникают внутрь клетки, в том числе и к различным клеточным органеллам.
Легкость преодоления липосомами клеточных мембран в данном случае обусловлена высокой комплементарностью частиц и мембран. Липосомы обладают такими преимуществами как совместимость с биологическими организмами, защита икапсулированных соединений от захвата клетками-макрофагами и метаболических превращений, способность преодолевать клеточную мембрану, транспортировать соединения непосредственно в цитоплазму клеткимишени и повышать растворимость включенных гидрофобных веществ, возможность включения адресного фрагмента и управляемого высвобождения инкапсулированного вещества, а также доступность получения липидных соединений [1].
Таблица 1 - Классификация нанотранспорных систем доставки
Классификация нанотранспорных средств доставки Используемые материалы Наноструктурированные формы
Биологические и биогенные полимеры Вирусы Липиды Пептиды Нуклеиновые кислоты Полисахариды Наночастицы Нанотрубки Нанокольца Липосомы
Органические полимеры Полимолочная кислота Полигликолевая кислота Полиалкилцианоакрилат Поли-3-гидроксибутановая кислота Полиэтиленгликоль (ПЭГ) Поликапролактон Полиэтиленоксид Полиамидоамин Полиэтиленимин Полипропиленимин Наночастицы Наносферы, Мицеллы Дендримеры
Неорганические соединения Углерод Кремний Металлы Оксиды металлов Соли металлов Пористые материалы Наночастицы Наностержни Нанотрубки Фуллерены Наносферы, Нанооболочки
Учитывая указанные преимущества, сделан вывод о перспективности использования липосом для доставки ЛВ в организм животных.
Для инкапсулирования выбран 3,5-диметил-1 -фенил- 1Н-пиразол-4-сульфонил хлорид, так как производные пиразола, согласно литературному анализу, обладают широким спектром биологической активности: бакте-
риостатическими, противосудорожными, ана-льгетическими, противорвотными и многими другими свойствами [7, 8]. А наибольший интерес представляют собой сульфохлориды гетероциклического ряда, как правило, уже имеющие в своей структуре фармакофорную группу, в частности, пиразолсульфохлориды (ПС).
Получение целевого ПС осуществили по методике в соответствии со схемой (рису-нок 1).
СН,
<
.N
hoso2ci
н3с \n/ 140 - 160°с, 12 ч. НчС
CI. JO
сн3
нД/
I
Рисунок 1 - Получение целевого ПС
В масляную баню помещали кругло-донную колбу объемом 250 мл, оборудовали ее механической мешалкой, обратным холодильником и капельной воронкой (с заменой на термометр после прибавления пиразолсуль-фохлорида). В колбу добавляли 58,3 г (0,5 моль) хлорсульфоновой кислоты и при интенсивном перемешивании при комнатной температуре по каплям прибавляли 8,0 г (0,05 моль) 3,5-диметил-1-фенил-1Н-пиразола с последующим нагреванием реакционной массы до 140-160 °С в течение 12 часов. Выделение целевых продуктов реакции осуществляли охлаждением реакционной массы, прибавлением её по каплям к мелко измельченному льду, фильтрацией при 0 °С. Полученный осадок в чашке Петри помещали в вакуумный эксикатор и сушили над P2O5. Выход составил 86 % от теоретического.
Получение ФЛ осуществляли из голов -ного мозга крупного рогатого скота, который измельчали блендером до образования однородной массы. Измельченное сырье в количестве 50 г помещали в двугорлую кругло-донную колбу объемом 1 л, добавляли 250 г абсолютного ацетона, снабжали механической мешалкой и термометром. Перемешивали при 30 °С в течение часа. Отфильтровывали осадок на бумажном фильтре в воронке Бюхнера и растворяли его в 100 г смеси хлороформ -метанол (3:1) при 30 °С. Перемешивали при 30 °С в течение 10 мин. Удаляли осадок от фильтрата к фильтрату, добавляли охлажденный до минус 20 °С абсолютный ацетон в количестве 200 г. Выпавший осадок отфильтровывали, сушили в вакуумном эксикаторе над КОН. Выход целевых фосфолипидов 2,71 г (более 5 % от массы исходного сырья, что составляет около 90 % от теоретического).
В целях поиска оптимального метода получения липосомальных форм ЛВ проведен анализа литературы, исходя из которого сфор-
мулированы критерии, предъявляемые к методам получения липосомальных форм ЛВ в зависимости от имеющегося оборудования и требуемых характеристик получаемых липо-сом:
1) растворимость ФАВ в воде;
2) высокая скорость получения;
3) высокий выход продукта;
4) однородность липосом по размерам;
5) отсутствие сложных дорогостоящих приборов;
6) стабильность липосом;
7) сохранность ФАВ;
8) легкость выделения продукта;
9) лабильность связи;
10) отсутствие самопроизвольного
выхода вещества.
Основываясь на сформулированных критериях, для получения СД липосома - ПС выбран наиболее доступный метод — метод коацервации, что обусловлено нерастворимостью полученного ПС в воде и отсутст-вием необходимости использования дорого-стоящего оборудования.
Смесь фосфолипидов в количестве 100 мг растворяли в 20 мл дистиллированной воды до получения коллоидного раствора, а пира-золсульфохлорид (в количестве 20 мг) растворяли в 60 мл ацетона. Полученные растворы смешивали в одногорлой круглодонной колбе емкостью 100 мл и выдерживали в течение 1 ч при температуре 50 °С. Затем ацетон упари-вали до начала испарения воды. Выпавшие в осадок вещества отделяли с помощью фильтрования на фильтре Шотта. Полученный осадок в чашке Петри помещали в вакуумный эксикатор и сушили над P2O5. После сушки определяли массу осадка. Полноту включения веществ определяли с помощью гравиметрического метода: сравнивали массу полученного осадка с изначально взятой массой ПС. Полнота
журнал для профессионалов от профессионалов
включения составила 78 %. В результате исследования получены липосомы, которые по размерам можно выделить в две основные фракции: первая - с размерами частиц (1304 ±318) нм составляет 68 %, вторая - с размерами частиц (214±39) нм составляет 32 %. Дзета-потенциал полученной коллоидной системы составил (-36,1 ± 4,3), что свидетельствует о хорошей агрегативной устойчивости.
Заключение. Таким образом, на примере пиразолсульфохлорида предложена методика получения его липосомальной формы, которую возможно использовать для доставки гидрофобных ЛВ в организм животных. Методика обладает такими преимуществами как простота, доступность исходных материалов и отсутствие необходимости использования дорогостоящего оборудования.
Литература
1. Бадер, Х. Способы самоорганизации липидных соединений / Х. Бадер // Успехи химии, 1987. - Т.56. - №12. - С. 2028.
2. Барсуков, Л.И. Липосомы / Л. И. Барсуков // Соросовский образовательный журнал, 1998. -№ 10. - С. 2.
3. Бегдуллаев, А.К. Проблема направленного транспорта лекарственных веществ в клинической практике / А.К. Бегдуллаев, А.Т. Маншарипова, А.К. Джусипов, Ж.А Абылайулы // Терапевтический вестник, 2008. - Т. 17. - №1. - С. 32.
4. Забодалова, Л.А. Получение липосом из соевого лецитина / Л.А. Забодалова, В.А. Чернявский, Т.Н. Ищенко, Н.Н. Скворцова // Процессы и аппараты пищевых производств, 2011. -№ 2. - С. 75.
5. Ивонин, А.Г. Направленный транспорт лекарственных препаратов: современное состояние вопроса и перспективы / А.Г. Ивонин, Е.В. Пименов, В.А. Оборин, Д.А.Девришов, С.Н.Копылов // Известия Коми Научного центра УрО РАН, 2012. - № 9. - С. 46.
6. Кузякова, Л.М. Медикаментозное преодоление анатомических и клеточных барьеров с помощью липосом: монография / Л.М. Кузякова, В.И. Ефременко // Ставрополь: Б.и., 2000. - 169 с. -ISBN 5-89571-011-5.
7. Машковский, М.Д. Лекарственные средства: учебник / М.Д. Машковский. - М.: Медицина, 1998. - 736 с.
8. Рославцева, С.А. Инсектицидная активность фенилпиразолов / С.А. Рославцева // Агрохимия, 2000. - № 3. - С. 92.
9. Arpicco, S. Recent studies on the delivery of hydrophilic drugs in nanoparticulate systems / S. Arpicco, L. Battaglia, P. Brusa [et al.] // Journal of Drug Delivery Science and Technology. - 2016. Vol. 32(2). - P. 298.
10. Hughes, G.A. Nanostructure-mediated drug delivery / G.A. Hughes // Nanomedicine. - 2005. -Vol. 1(1). - P. 22.
11. Li, X.T. The antitumor activity of PNA modified vinblastine cationic liposomes on Lewis lung tumor cells: In vitro and in vivo evaluation / X.T. Li, M.L. He, Z.Y. Zhou [et al.] // Int J Pharm. - 2015 Vol. 20(2). - P. 223.
12. Golovanova A.M. A composite therapeutic preparation for radioisotope elimination: theoretical presuppositions / Golovanova A.M., Mukminov M.N., Nizamov R.N., Sychev K.V., Vagin K.N. // International Journal of Pharmacy and Technology, 2016. - Т. 8. - № 4. - Р. 24558.
13. Pattni, B.S. New developments in liposomal drug delivery / B.S. Pattni, V.V. Chupin, V.P. Torchilin // Chem Rev. - 2015. - Vol. 115(19). - P. 10938.
14. Nikitin, A.I. Tudy of radioprotective properties of e.coli metabolites / Nikitin A.I., Gaizatullin R.R., Koniukhov G.V., Nizamov R.N., Tarasova N.B., Vagin K.N. // International Journal of Pharmacy and Technology, 2016. - Т. 8. - № 2. - Р. 14328
METHOD OF OBTAINING LIPOSOMAL SYSTEMS OF DELIVERY OF MEDICINES TO ANIMALS
:A.V. Pozdeyev - Doctor of Biological Sciences, :Scherbakov N.P., 2K. N. Vagin - Candidate of Biological Sciences, 2Nizamov R.N. - Doctor of Veterinary Sciences, Professor
:FGCVOU "Military Academy of Radiation, chemical and biological protection Marshal of the Soviet Union S.K. Tymoshenko",
156016, Russia, Kostroma, Gorky Street, 16, e-mail: varbz@thousand. Ru
2 Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety, Kazan 420075; Kazan city, Scientific Town-2, e-mail: vnivi@mail.ru
Studies have been carried out to study the properties and ways of obtaining nanocapsulated forms of drugs, on the basis of which the choice of liposome as a means of delivery of biologically active substances is justified. For encapsulation in liposomes used biologically active substance 3.5-dimethyl-1-phenyl-1N-pirazole-4-sulfonil chloride. To obtain liposomes from available natural raw materials (fresh head cattle) a mixture of phospholipids was obtained. Encapsulation is carried out by the method of coacervation. The study resulted in liposomes with sizes (1304±318) nm (68%) and (214±39) nm (32±%). Thus, the example of pirazozolorulfochloride suggests a method of obtaining its liposomal form, which can be used to deliver hydrophobic drugs to animals.
Keywords: liposomes, capsing, biologically active substance.
References
1. Bader, X. Methods of Self-Organization of Lipid Compounds/X. Bader//Successes of Chemistry., 1987. - T.56. - №12. - P. 2028.
2. Barsukov, L.I. Liposomes/L.I. Barsukov//Sorosovsky Educational Journal, 1998. - № 10. - P. 2.
3. Begdullaev, A.K. The problem of directed transport of medicinal substances in clinical practice/A.K. Begdullaev, A.T. Mansharipova, A.K. Dzhusipov, J.A. Abylayuly // Therapeutic Bulletin, 2008. - T. 17. - №1. -P. 32.
4. Zabodalova, L.A. Obtaining liposomes from soybean lecithin / L.A. Zabodalova, V.A. Chernyavsky, T.N. Ishchenko, N.N. Skvortsova//Processes and apparatus of food production, 2011. -№ 2. - P. 75.
5. Ivonin, A.G. Directed transport of medicines: the current state of the question and prospects/ A.G. Ivonin, E.V. Pimenov, V.A. Oborin, D.A. Devrishov, S.N. Kopylov//News of the Komi Scientific Center of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences, 2012. - № 9. - P. 46.
6. Kuzyakova, L.M. Drug overcoming anatomical and cellular barriers with the help of liposomes: monograph/L.M. Kuzyakova, V.I. Efremenko//Stavropol: B. I., 2000. - 169 sec. - ISBN 5-89571-011-5.
7. Mashkovsky, M.D. Medicines: textbook/M.D. Mashkovsky. - M.: Medicine, 1998. - 736 pages.
8. Roslavtseva, S.A. Insecticide Activity phenylpirazole / S.A. Roslavtseva // Agrochemistry. - 2000. -№ 3. - P. 92.
9. Arpicco, S. Recent studies on the delivery of hydrophilic drugs in nanoparticulate systems / S. Arpicco, L. Battaglia, P. Brusa [et al.] // Journal of Drug Delivery Science and Technology. - 2016. Vol. 32(2). - P. 298.
10. Hughes, G.A. Nanostructure-mediated drug delivery / G.A. Hughes // Nanomedicine. - 2005. - Vol. 1(1). - P. 22.
11. Li, X.T. The antitumor activity of PNA modified vinblastine cationic liposomes on Lewis lung tumor cells: In vitro and in vivo evaluation / X.T. Li, M.L. He, Z.Y. Zhou [et al.] // Int J Pharm. - 2015 Vol. 20(2). - P. 223.
12. Golovanova A.M. A composite therapeutic preparation for radioisotope elimination: theoretical presuppositions / Golovanova A.M., Mukminov M.N., Nizamov R.N., Sychev K.V., Vagin K.N. // International Journal of Pharmacy and Technology. 2016. - T. 8. - № 4. - P. 24558.
13. Pattni, B.S. New developments in liposomal drug delivery / B.S. Pattni, V.V. Chupin, V.P. Torchilin // Chem Rev, 2015. - Vol. 115(19). - P. 10938.
14. Nikitin, A.I. Tudy of radioprotective properties of e.coli metabolites / Nikitin A.I., Gaizatullin R.R., Koniukhov G.V., Nizamov R.N., Tarasova N.B., Vagin K.N. // International Journal of Pharmacy and Technology, 2016. -T. 8. № 2. -P. 14328
