МЕТОДИКА ОЦЕНКИ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫХ ПРЕПАРАТОВ Г-КСФ, ИНТЕРФЕРОНОВ α, β И СОМАТОТРОПИНА IN VITRO Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»



ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ МЕТОДИКА ОЦЕНКИ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ... 29

УДК 615.37:616-092.9:575.113

А.А. Вайнсон, В.В. Мещерикова

МЕТОДИКА ОЦЕНКИ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫХ ПРЕПАРАТОВ Г-КСФ, ИНТЕРФЕРОНОВ а, в И СОМАТОТРОПИНА IN VITRO

ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН, Москва

Контактная информация

Вайнсон Адольф Адольфович, д-р биол. наук, профессор, заведующий лабораторией лучевых методов лечения опухолей НИИ ЭДиТО

адрес: 115478, Москва, Каширское ш., 24; тел. +7(499)324-16-70 e-mail: wainson@ronc.ru

Статья поступила 19.12.2011, принята к печати 31.08.2012.

Резюме

Разработана простая и хорошо воспроизводимая методика оценки in vitro специфической активности нескольких генно-инженерных белков - филграстима (чрГ-КСФ), интерферонов а и в, и соматотропина, включающая программу автоматической статистической обработки результатов, соответствующую требованиям Европейской Фармакопеи VII. Методика основана на угнетении или стимулировании роста клеток определенных линий и используется при тестировании отечественных и импортируемых субстанций и лекарственных препаратов.

Ключевые слова: филграстим, интерфероны а и в, соматотропин, специфическая активность, тестирование на клетках in vitro.

A.A. Wainson, V.V. Mescherikova A METHOD FOR ASSESSMENT OF FILGRASTIM (RG-CSF), a, P INTERFERONS, AND SOMATROPIN SPECIFIC ACTIVITY IN VITRO

FSBI «N.N. Blokhin RCRC» RAMS, Moscow

ABSTRACT

A simple and reproducible methods of in vitro assessment of several human recombinant therapeutic proteins’ - filgrastim (rhG-CFU), interferons a and p, and somatropin - specific activity has been elaborated. The program of statistical processing of experimental data corresponds to XII issue of Russian Federation Pharmacopoeia. The methods are based on suppression or stimulation of specific cells growth and are used in testing the domestic and imported substances and final medical products.

Key words: filgrastim, interferons a and p, somatropin, specific activity, in vitro test on cell cultures.

Введение

В последние годы отечественными компаниями начат выпуск ряда генно-инженерных белков - цитокинов и гормонов, которые ранее поступали на рынок от зарубежных производителей. При этом одним из условий регистрации препарата является оценка активности белка биологическим методом, так как такой распространенный и точный метод определения количества белка в пробе, как иммуноферментный, может не заметить небольших отличий в пространственной организации молекул человеческого белка и белка, синтезированного в бактериальных клетках. Эти отличия, однако, могут уменьшать биологическую активность белка, в связи с чем производимые лекарственные препараты должны быть охарактеризованы по показателю специфической активности, которая в идеале должна быть сравнена с активностью соответствующего международного стандарта ВОЗ.

Определение активности может выполняться как in vivo, так и in vitro. При этом в первом случае специфическая активность белка тестируется на животных по выполнению белком той же функции, ради которой его, собственно говоря, и производят. В системах in vitro оценка специфической активности полученного белка может производиться по

критериям, не имеющим ничего общего с его функцией в организме, но которые, тем не менее, позволяют адекватно оценивать действие данного белка на человека (примером является оценка активности гормона соматотропина по стимулированию роста клеток Nb-2 лимфомы крыс in vitro).

Предмет данного сообщения - рассмотрение собственного опыта оценки специфической активности, включая статистическую обработку результатов тестирования, четырех генно-инженерных белков: трех цитокинов - гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) и интерфе-ронов альфа и бета, и одного гормона - соматотро-пина. Все эти белки как лекарственные препараты являются дженериками, так что тот или иной вариант определения их специфической активности уже имеется у зарубежных компаний-производителей, но особенности использования этих методов в доступных публикациях отсутствуют. Кроме того, выяснилось, что имеющиеся в открытых источниках описания методов оценки биологической активности некоторых генно-инженерных белков не удается воспроизвести при простом копировании; возможно, в статьях были опущены какие-то существенные подробности.

Методики основаны на одном принципе - на стимулировании или угнетении роста определенно-

го вида клеток в культуре. Эффект стимулирования или угнетения роста оценивается с помощью варианта хорошо известного МТТ-теста и сравнивается с эффектом действия соответствующего международного стандарта, а также, для дополнительного контроля, с препаратами ведущих мировых производителей.

Материалы и методы

Определение активности филграстимов

В литературе имеется несколько публикаций с описанием методики оценки активности ЧГ-KСФ. Исходно мы попытались использовать методики, основанные на работе с коммерческими линиями клеток. Согласно сообщению Yamaguchi T. et al, чГ-KСФ в концентрации 0,3-10 нг/мл усиливает пролиферацию про-миелоцитных клеток линии HL-60 человека, которая была предварительно подавлена введением в среду ДМСО или ретиноидной кислоты, и степень увеличения скорости роста авторы предложили использовать при оценке рч-Г-KСФ [15]. В наших экспериментах, однако, наблюдалось значительное варьирование от опыта к опыту диапазона «действующих» концентраций рч-Г-^Ф, возможно, связанное со сложностью такой методики оценки, когда необходимо применение агентов и для подавления, и для стимулирования роста клеток. Также не дала результатов попытка работать с клетками линии 32D, полученными из костного мозга мышей [13], хотя к началу наших исследований имелась информации об их использовании для оценки активности производителями рчГ^СФ (насколько нам известно, сейчас эти клетки для такой цели не используются).

Вместе с тем, в литературе имелись данные о чувствительности к чГ^СФ линии NFS-60 клеток миелоидного лейкоза мышей [5; 6; 9-11], которая, однако, до сих пор не представлена ни в одной из коммерческих коллекций. По нашему запросу клетки этой линии [14] были любезно присланы одним из ее создателей, профессором Джеймсом Иле из St Jude Children's Research Hospital в Мємфисє, США. Появившиеся в последнее время технические и методические усовершенствования позволили разработать простую в исполнении и обладающую очень высокой точностью методику определения активности рчГ-KСФ (филграстима), описываемую ниже.

Тестирование проводится в плоскодонных 96-луночных планшетах, в которых клетки NFS-60 инкубируют с филграстимом в разных концентрациях в течение 2 сут. Различие в количестве выросших клеток выявляют с помощью их дальнейшей инкубации в присутствии красителя, меняющего цвет при метабо-лизировании клетками. Изменение цвета красителя оценивают либо по поглощению, либо по флуоресценции исходного и конечного продукта.

В наших условиях клетки выращивали на среде RPMI-1640 (ПанЭко, Москва) с добавлением 10 % сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота (HyClone, США). Для роста этих клеток необходим мышиный интерлекин-3, который приобретали у фирмы BD Biosciences (США), а затем стали использовать среду, в которой выращивали клетки WEHI (линия В -клеточной лимфомы мышей), выделяющие интерлейкин-3 как продукт метаболизма. Филграстим также обладает стимулирующим действием и может быть использован для замены интерлейкина-3. Поэтому перед проведением теста клетки, которые растут в суспензионной культуре, должны быть отмыты от этих стимуляторов роста с повторным центрифугированием.

^к агент, изменение окраски которого слу-

жит индикатором количества выросших клеток, использовали АламарБлю (Invitrogen, США), меняющий при метаболизме цвет с голубого на розовый. Изменение цвета хорошо видно на глаз, а так как краситель для клеток нетоксичен, периодически осматривая планшеты можно выбрать время, когда следует произвести измерение экстинкции (это относится и к флуоресценции), а именно момент, когда лунки с нерастущими клетками остались синими, а лунки с наибольшим ростом клеток стали ярко розовыми (рис. 1; см. вклейку). Это дает возможность «прописать» полную S-образную кривую «концентрация препарата - эффект конверсии красителя» (концентрация препарата указывается на оси абсцисс в логарифмическом масштабе).

Эффект стимулирования роста клеток NFS-60 тем более заметен, чем длительнее их экспозиция с чГ-КСФ. Мы остановились на 48 ч длительности роста клеток до введения красителя: при длительности клеточного цикла около 12 ч за это время количество посеянных клеток увеличивается в 16 раз. Отметим, что при проведении как этого, так и описываемых далее тестов рационально вносить в лунку от 10 до 15 тыс. клеток, чтобы к концу роста они покрывали не более 70% площади дна. Для воспроизводимости условий постановки эксперимента от опыта к опыту целесообразно производить посев одного и того же количества клеток с точностью ± 5%, для чего, в соответствии с распределением Пуассона, в камере Горяева надо просчитывать 400 клеток, независимо от числа «квадратов», в которых они находятся.

В описываемых экспериментах при работе планшеты располагали вертикально и «на точку» использовали по шесть лунок. В одном планшете проводили оценку двух образцов, используя 8 концентраций препаратов, отличающихся друг от друга, например, в два раза. Вначале во все лунки 2-8-й колонок вертикально расположенных планшетов 12канальной электронной пипеткой (Biohit, Финляндия) вносили по 100 мкл питательной среды, затем в шесть лунок первой и второй колонок вносили по 100 мкл разведенного в среде одного из стандартов - либо «Международного стандарта» ВОЗ [7], либо отечественного «Стандартного образца», а в шесть других лунок этих колонок - испытуемого препарата. Образцы и «Стандартов», и препаратов вносили в 2-3 повторностях на параллельные планшеты. После перемешивания образцов и среды в лунках второй колонки оттуда переносили по 100 мкл разведенного препарата в лунки третьей колонки, и т.д. до восьмой колонки, из которой после перемешивания удаляли по 100 мкл. Далее во все лунки планшетов вносили по 100 мкл суспензии клеток и планшеты ставили в инкубатор на 48-55 ч. Затем в лунки вносили по 20 мкл красителя, и через 9-14 ч оценивали степень его конверсии, измеряя либо экстинкцию на аппарате имму-ноферментного анализа Униплан (ПИКОН, Москва), либо флуоресценцию на аппарате Plate Chameleon V 425-106 Multilabel Counter, Hidex Oy (Финляндия). Для красителя АламарБлю из-за значительного перекрытия спектра поглощения исходного красителя и его метаболизированного продукта экстинкцию измеряют при двух длинах волн, - в нашем случае использовали фильтры X 535 и 590 нм с дальнейшем проведении расчета согласно прилагаемой к красителю инструкции, а при измерении флуоресценции для возбуждения использовали излучение с X 544 нм, а само измерение проводили при 590 нм.

Заметим, что вместо дорогого АламарБлю возможно использование его основного компонента

- более дешевого ресазурина (Sigma, США). Вме-

сто АламарБлю и ресазурина можно использовать и более распространенный краситель МТТ, однако при метаболическом восстановлении формазан образует кристаллы, нерастворимые в водной среде.

Для их растворения прямо в питательной среде, не осаждая растущие в виде суспензии клетки, в неё добавляют на несколько часов подкисленный изопропиловый спирт с Triton X-100 или другой растворитель, например, 10%-ный додецилсульфат натрия. Степень роста числа клеток определяют спектрофотометрически по увеличению оптической плотности при X, например, 530 нм.

^ивые доза-эффект для одного из проведенных тестов, в котором сравнивали активность выпускаемого компанией Фармстандарт-УфаВита филграстима «Ней-помакс», Международного стандарта филграстима ВОЗ [Granulocyte colony stimulating factor (human, rDNA-derived, First international standard, выпускается NIBS (Великобритания) Code 88/502. Version 4, January 2006] и отечественного «Стандартного образца» филграстима приведены на рис. 2. ^нечная концентрация филгра-стима в лунках первой колонки планшетов, с учетом разведения после добавления суспензии клеток, равна

0,05 нг/мл (5 МБ, активность 1 нг филграстима соответствует 100 ME), а в лунках последней, 8-й колонки - 0,39 пг/мл (0,039 ME); концентрация чГ^СФ, обеспечивающая максимальную скорость роста, в разных опытах составила 1-3 ME/мл среды. ^н^трация, при которой происходит 50-%ное усиление роста клеток, составляет ~0,5 MБ/мл, т.е. 0,005 нг/мл.

Заметим, что, согласно данным литературы, у других авторов, проводивших тестирование филграсти-ма, даже на клетках NFS-60, эта величина лежала в диапазоне существенно больших концентраций препарата: от 0,1-0,15 нг/мл [5; 9; 10] и до 2 нг/мл [15]. Гораздо более высокая чувствительность используемой нами методики оказалась очень полезной и при определении активности чГ ^СФ в биологических жидкостях.

Полученные данные анализируют методом определения эквивалентных доз (Государственная фармакопея РФ XII, часть 2) [2]. На всех кривых «доза-эффект» можно выделить относительно линейные участки, на которых располагаются «точки» - данные о конверсии красителя - для трех концентраций «Международного стандарта» и препаратов. Анализ результатов с целью определения специфической активности изучаемого препарата относительно «Стандарта» проводили по программе, разработанной в редакторе Excel (рис. 3). Описанный метод использован при подготовке к выпуску отечественного филграстима «Нейпомакс» [3], хорошо зарекомендовавшего себя при лечении онкологических больных [1], а также при проверке ряда других субстанций и лекарственных препаратов - филграстимов отечественного производства.

Определение активности интерферонов а и р

Специфическую активность генно-инженерных интерферонов а и р,используемых при лечении онкологических заболеваний и помощи больным рассеянным склерозом, проверяли по угнетению роста клеток линии Daudi лимфомы Беркита человека. ^етки были приобретены в ^ллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН. Сравнение проводили со стандартами ВОЗ (WHO International Standard INTERFERON ALPHA 2b, (Human rDNA derived) NIBSC code: 95/566, Potency is 70000 IU/ 500ng и Interferon beta SER17 Mutein, Human, rDNA derived, NIBSC code 00/574, Potency is 64,000 IU/1125 ng). Период удвоения клеток Daudi состав-

ляет сутки, так что инкубацию клеток с препаратом приходится проводить в течение более длительного времени, чем при работе с мышиными клетками, а именно в течение 72-120 ч.

Методика тестирования и статистическая обработка данных аналогичны описанной для фил-грастима. Принципиальной разницы в проведении тестирований интерферона а и в не было. На рис. 4 и 5 приводятся результаты экспериментов по сравнению активности опытных образцов этих интер-феронов с активностью стандартов ВОЗ.

Определение активности соматотропина

Специфическую активность генно-инженерных препаратов гормона роста человека оценивали по ускорению роста клеток линии Nb-2 лимфомы крыс. Клетки получены в дар от проф. А^. Buckley, University of Cincinnati Medical Center, США. Исходно культуру клеток из узла лимфомы крыс линии Nb получил проф. P. Gout [4; 8], ныне работающий в Department of Cancer Endocrinology, BC Cancer Agency, Канада, который и организовал передачу клеток Nb-2 для выполнения данной работы как одного из наиболее подходящего для этой цели объекта [12].

Клетки выращивали на среде RPMI-1640 с 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота и 10% лошадиной сыворотки, а также 60-100 мкМ 2-меркаптоэтанола. В самом тесте активности со-матотропина используется среда, не содержащая ни фетальной, ни лошадиной сыворотки. Вместо них используется 10% сыворотки мерина, которая не содержит лактогенных гормонов, также стимулирующих рост клеток Nb-2. Поэтому перед постановкой теста клетки отмывают от «ростовой» среды центрифугированием.

Сравнение проводили со стандартами ВОЗ (WHO International Standard Somatropin - Recombinant DNA-Derived Human Growth Hormone; 3.0 IU/mg somatropin; NIBSC code: в начале нашей работы - стандарт 88/624, затем - стандарт 98/574).

Методика постановки тестов была такой же, как и в экспериментах с филграстимом. Кривые зависимости усиления конверсии АламарБлю от дозы препаратов, построенные по данным, полученным при измерении экстинкции, представлены на рис. 6, а полученные при измерении флуоресценции - на рис. 7.

Видно, что 50%-ное ускорение роста достигается в первом случае при концентрации сомато-тропина в 0,04 нг/мл среды, а при использовании более чувствительного метода оценки - по флуоресценции - при 0,02 нг/мл. Разработанная методика используется для проверки специфической активности различных препаратов соматотропина, в первую очередь отечественного генно-инженерного соматотропина человека «РАСТАН».

Заключение

Разработаны методики оценки специфической активности нескольких генно-инженерных рекомбинантных белков медицинского назначения и программа статистической обработки экспериментальных данных, соответствующая требованиям Государственной фармакопеи РФ XII.

Эти методики постоянно используются при оценке дженериков, выпускаемых отечественными фармацевтическими компаниями, а также субстанций и лекарственных препаратов, ввозимых из-за рубежа.

Литература

1. Абрамов М.Е., Жукова Л. Г., Личиницер М.Р. Клиническая эффективность и безопасность применения отечественного рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора Нейпо-макс у больных раком молочной железы, получающих химиотерапию Доксорубицином и Доцетак-селем // Современная онкология. - 2009. - 11(3) - С. 46-50.

2. Государственная Фармакопея РФXII, часть 2. М. Научный центр экспертизы средств медицинского применения, - 2012.

3. Кононова Н.В., Бобрускин А.И., Костромина Т.И., Мелихова Т. Д. и др. Разработка и оптимизация

технологического процесса получения субстанции филграстима // Биотехнология.- 2009. - № 5. - С. 24-32.

4. Gout P.W, Beer C.T., Noble R.L. Prolactin-stimulated growth of cell cultures established from malignant

Nb rat lymphomas // Cancer Res. - 1980. - 40(7). - Р. 2433-6.

5. Hammerling U., Kroon R. Sjodin L. In vitro bioassay with enhanced sensitivity for human granulocyte col-

ony-stimulating factor // J Pharm Biomed Anal. -1995. - 13(1).- Р. 9-20.

6. Matsuda S., Shirafuji N., Asano S. Human granulocyte colony-stimulating factor specifically binds to murine myeloblastic NFS-60 cells and activates their guanosine triphosphate binding proteins/adenylate cyclase system // Blood. - 1989. - 74(7). - Р. 2343-8.

7. Mire-Slius A.R., Das R.G., Thorpe R. The international standard for granulocyte colony stimulating factor (G-CSF). Evaluation in the international collaborative study // J Immunol Methods. - 1995. - 179(1) - P. 117-126.

8. Noble R.L, Beer C.T, Gout P.W. Evidence in vivo and in vitro of a role for the pituitary in the growth of malignant lymphomas in Nb rats // Cancer Res. - 1980. - 40(7). - Р. 2437-40.

9. Saito K., Yamamoto K., Atsumi M. et al. Bioassay of recombinant human granulocyte colony stimulating factor. Evaluation of the measurements of biological activity and correlations among in vitro colony-forming, NFS-60, AML-193, and in vivo CPA-mouse methods// Basic Pharmacology Therapeutics. - 1990.

- 18(Suppl. 9) - P.S2201-S2211 (на японском).

10. Shimane M., Shimada H., Motpjima H. et al. Sensitive assay in vitro of biological activity for recombinant human G-CSF (r G-CSF) using NFS-60 cells// Basic Pharmacology Therapeutics. - 1990. - 18(Suppl. 9) -P.S-2193-S-2199 (на японском).

11. Shirafuji N., Asano S., Matsuda S. et al A new bioassay for human granulocyte colony-stimulating factor (hG-CSF) using murine myeloblastic NFS-60 cells as targets and estimation of its levels in sera from normal healthy persons and patients with infectious and hematological disorders // Exp Hematol. - 1989. - 17(2). -Р. 116-9.

12. Tanaka T., Shiu R.P., Gout P. W. et al. A new sensitive and specific bioassay for lactogenic hormones: measurement of prolactin and growth hormone in human serum // Clin Endocrinol Metab. -1980. - 51(5). -Р.1058-63.

13. Valtieri M., Tweardy D.J., Caracciolo D. et al. Cytokine-dependent granulocytic differentiation. Regulation of proliferative and differentiative responses in a murine progenitor cell line // J Immunol. - 1987. -138(11). - P. 3829-35.

14. Weinstein Y., Ihle J.N., Lavu S., Reddy E.P. Truncation of the c-myb gene by a retroviral integration in an interleukin 3-dependent myeloid leukemia cell line // Proc Natl Acad Sci U S A. - 1986. - 83(14). - P. 5010-4.

15. Yamaguchi T., Yamaguchi T., Kogi M. et al. Bioassay of human granulocyte colony-stimulating factor using human promyelocytic HL-60 cells // Biol Pharm Bull. - 1997. - 20(9). - P. 943-7.