CC BY
0
DOI: 10.48612/sbornik-2024-1-76 УДК 543.068.8:637.5.07
МЕТОДИКА ЭКСПРЕСС-ОПРЕДЕЛЕНИЯ АПРАМИЦИНА В МЯСЕ НА ОСНОВЕ МЕТОДА ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА
Бакай Кристина Александровна Сафронова Валентина Андреевна, канд. хим. наук Прийма Анастасия Дмитриевна Нестеренко Ирина Сергеевна, канд. хим. наук
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов», г. Москва, Российская Федерация
Разработана методика экспресс-определения остаточного содержания апрамицина в мясе на основе прямого твердофазного конкурентного иммуноанализа. Получены конъюгаты апрамицина с белками-носителями, специфичные сыворотки антител к апрамицину, подобраны оптимальные условия проведения иммуноферментного анализа, а также буфер для экстракции апрамицина из образцов мяса. Было показано отсутствие перекрёстной реакции с другими антибиотиками аминогликозидной группы. Предел обнаружения методики составил 0,1 нг/мл, диапазон определяемых концентраций апрамицина - 0,1-30 нг/мл, а время анализа с учетом пробоподготовки - 45 мин.
Ключевые слова: апрамицин; иммуноферментный анализ; пероксидаза хрена; ами-ногликозиды
THE METHOD OF RAPID DETERMINATION APRAMYCIN RESIDUES IN MEAT
BY ENZYME IMMUNOASSAY
Bakai Kristina Aleksandrovna Safronova Valentina Andreevna, PhD Chem. Sci. Priima Anastasiya Dmitrievna Nesterenko Irina Sergeevna, PhD Chem. Sci.
Federal state budgetary institution «The russian state Center for animal feed and drug standardization and quality», Moscow, Russian Federation
The express-method of determination apramycin residues in meat by enzyme solid-phase competitive immunoassay was developed. The conjugates of apramycin with carrier protein, specific antisera to apramycin was obtained, appropriate conditions for immunoassay were selected and buffer for extraction apramycin from meat samples. It has been shown that there is no cross-reaction with other antibiotics of the aminoglycoside group. The detection limit of the method was 0.1 ng/ml, the linear range of apramycin concentrations was 0.1-30 ng/ml, and the analysis time, taking into account sample preparation, was 45 minutes.
Key words: apramycin; enzyme immunoassay; horseradish peroxidase; aminoglycosides
Аминогликозиды - это широко используемая в ветеринарии группа антибиотиков. Они применяются как в терапевтических целях, в основном для лечения инфекций, вызываемых грамотрицательными бактериями, так и в качестве стимуляторов роста [1]. Однако неправильное использование и злоупотребление этими препаратами может привести к аккумулированию их в тканях живот-
ных и дальнейшему переходу остатков антибиотиков в продукцию животноводства. Таким образом, повышается риск возникновения антибиотикорезистентности у патогенной микрофлоры конечного потребителя [4]. Также аминогликозиды обладают ототоксич-ностью и могут вызывать потерю слуха и нарушение равновесия у человека. Поэтому важной задачей является контроль уровня
остаточного содержания данных антибиотиков в продукции питания.
Апрамицин - аминогликозид, вырабатываемый Streptomyces tenebrarius (рис. 1), который активен в отношении кишечной палочки, сальмонеллы, микоплазм, применяется для лечения энтеритов и респираторных заболеваний у крупного рогатого скота, свиней и домашней птицы [7]. В настоящий момент
согласно ТР ЕАЭС 051/2021 «О безопасности мяса птицы и продукции его переработки» и ТР ТС 034/2013 «О безопасности мяса и мясной продукции» установлены следующие предельно допустимые нормы содержания апрамицина в мясной продукции: не более 1 мг/кг в мясе всех продуктивных животных и птицы.
Рисунок 1 - Структурная формула апрамицина
Одним из основных методов контроля остаточных количеств терапевтических препаратов на данный момент является метод высокоэффективной жидкостной хроматографии [5, 8]. Данный метод требует наличие в лаборатории дорогостоящего оборудования, а время проведения анализа может составлять до двух суток. Альтернативой для быстрого количественного определения остаточных количеств апрамицина является метод иммуноферментного анализа (ИФА) [3, 2, 6]. Он позволяет за короткое время количественно оценить содержание аналита в большом количестве проб.
Методика исследований. В основе разработанной методики лежит метод твердофазного конкурентного иммуноанализа. В работе были рассмотрены прямой и непрямой форматы конкурентного анализа. В первом случае на поверхности полистиролового планшета иммобилизованы специфические антитела к апрамицину, к которым в процессе анализа добавляют смесь анализируемого образца и коньюгата апрамицина с пероксида-зой хрена. Во втором случае анализ проводят в две стадии: на первом этапе к коньюгату апрамицина с бычьим сывороточным альбумином, иммобилизованного на поверхности лунок планшета, добавляют смесь специфических антител и анализируемого образца, и на следующей стадии - коньюгат вторичных ан-
тител, меченных ферментом. После проведения реакции окрашивания субстратом регистрируют аналитический сигнал с помощью спектрофотометра.
Для разработки методики был синтезирован иммуноген, а также поверхностные ко-ньюгаты апрамицина с бычьим сывороточным альбумином и гемоцианином лимфы улитки методом активированных эфиров. Ко-ньюгат апрамицина с пероксидазой хрена получали перйодатным методом.
Специфические сыворотки антител получали двумя способами. В первом случае иммунизацию проводили малыми дозами: иммуноген вводили подкожно в 20 точек спины один раз в месяц в дозах 0,02-0,1 мг в физрастворе в смеси с неполным адъювантом Фрейнда (НАФ). Во втором случае кроликов иммунизировали 1 мг иммуногена внутривенно в ушную вену 3 раза в месяц через день. Отбор крови проводили через неделю после последней иммунизации. Повторную иммунизацию в обоих случаях проводили через месяц.
Результаты исследований и их обсуждение. Так как апрамицин является низкомолекулярным веществом, то для получения специфических антител необходимо было получить иммуноген - коньюгат апра-мицина с гемоцианином лимфы улитки. Иммунизацию проводили двумя способами. По-
сле иммунизации были отобраны наиболее специфичные сыворотки. При работе с сыворотками, полученными при иммунизации 1 мг иммуногена предел обнаружения апрами-цина снизился на порядок (рис. 2).
В процессе работы были подобраны оптимальные концентрации иммунореагентов, буферные растворы и условия сорбции антител на планшете. Было показано, что при сравнении прямого и непрямого формата конкурентного ИФА для определения апра-мицина в непрямом формате не наблюдается конкурентного взаимодействия свободного антигена и антигена, иммобилизованного на
поверхности планшета.
Для создания экспресс-методики было оптимизировано время проведения анализа. Было установлено, что сокращение времени иммунохимической реакции до 15 мин не оказывает существенного влияния на аналитические характеристики методики. Также была проведена оценка перекрестного реагирования полученных сывороток с другими антибиотиками аминогликозидного ряда и антибиотиков схожих по химическому строению. Была показана специфичность разработанной методики по отношению к апрамици-ну.
[АПР] , нг/мл
Рисунок 2 - Сравнение специфичности поликлональных сывороток, полученных разными способами иммунизации
Таблица - Значения перекрестной активности для различных антибиотиков
Антибиотик Перекрестное связывание, %
апрамицин 100
гентамицин <0,1
канамицин <0,1
стрептомицин <0,1
неомицин <0,1
линкомицин <0,1
тетрациклин <0,1
хлорамфеникол <0,1
спирамицин <0,1
тилозин <0,1
Апробацию разработанной тест-системы проводили на образцах мяса. Апра-мицин - антибиотик, который практически не
растворяется в органических растворителях, зато хорошо растворим в воде. Поэтому при выборе экстрагента были рассмотрены вод-
но-солевые буферные растворы с разным рН, а также химические реагенты, которые приводят к денатурации белков.
Выводы. Таким образом, была разработана высокочувствительная методика для быстрого определения апрамицина в мясе. Предел обнаружения методики составил 0,1 нг/мл. Время пробоподготовки составило около 20 минут, а время постановки иммуно-химической реакции 25 минут. Было показано отсутствие перекрёстного реагирования с другими антибиотиками аминогликозидной группы. Проведено определение содержания апрамицина в образцах мяса. В качестве экс-трагента использовали фосфатно-солевой буфер. Степень извлечения апрамицина составила от 80 до 110 %.
Список литературы
1. Determination of aminoglycoside antibiotics: Current status and future trends / M. Glinka, W. Wojnowski, A. Wasik // Trends in Analytical Chemistry. - 2020. - V. 131.
2. Development of a specific monoclonal antibody assay and a rapid testing strip for the detection of apramycin residues in food samples / J. Isanga, B. N. Tochi [et al.] // Food and agricultural immunology. - 2016. - V. 27. - P. 49-66.
3. Immunochemical detection of apramycin as a contaminant in tissues of edible animals / M.
Burkin, I. Galvidis // Food Control. - 2013. - V. 34. - P. 408-413.
4. Mechanism and prevention of ototoxicity induced by aminoglycosides / F. Xiaolong Wan Peifeng Li Peipei et al. // Front. Cell. - Neurosci. 2021. - V. 15.
5. Multi-residue quantitation of aminoglycoside antibiotics in kidney and meat by liquid chromatography with tandem mass spectrometry / R. Ishii, M. Horie, W. Chan, J. MacNeil // Food Addit Contam. - 2008. - V. 25. - P. 1509-1519.
6. Production of monoclonal antibody and development of a new immunoassay for apramycin in food / F. Xu, W. Jiang, J. Zhou [et al.] // Journal of Agricultural and Food Chemistry. - 2014. - V. 62 (14). - P. 3108-3113.
7. Simple spectrofluorimetric methods for determination of veterinary antibiotic drug (apra-mycin sulfate) in pharmaceutical preparations and milk samples / M. M. Mabrouk, A.M. Noureld-in Hind et al. // Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. - 2020. -V. 224.
8. Simultaneous determination of 13 amino-glycoside residues in foods of animal origin by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry with two consecutive solid-phase extraction steps / W. Zhu, J. Yang, W. Wei et al. // J. Chromatogr. A. - 2008. - V. 1207. -P. 29-37.
БОГ: 10.48612^Ьогтк-2024-1-77 УДК 636.4.082.2
СВЯЗЬ ГЕНОВ APOBEC4 И SLC25A26 С СЕЛЕКЦИОННО-ЗНАЧИМЫМИ ПРИЗНАКАМИ СВИНЕЙ
Бакоева Илона Сирождиновна1 Романец Елена Андреевна2, аспирант Гетманцева Любовь Владимировна3, д-р биол. наук
1ФГБОУ ВО «Российский химико-технологический университет имени Д.И. Менделеева», г. Москва, Российская Федерация
2ФГБОУВО «Донской ГАУ», п. Персиановский, Ростовская обл., Российская Федерация 3ФГБНУ ЦСП ФМБА России, г. Москва, Российская Федерация
Целью данной работы было изучить эффект SNP в генах АР0ВЕС4 и SLC25A26 на продуктивные признаки свиней. Исследование проводили на свиньях крупной белой породы селекционно-генетического центра РФ. В качестве тестируемых SNP были выбраны ^81234791 (9:124913515), локализованный в гене АР0ВЕС4 и ^81445390 (13:47743525) в гене SLC25A26. По результатам анализа определено, что гены АР0ВЕС4 и SLC25A26 связаны со скоростью роста, толщиной шпика и процентом постного мяса.
Ключевые слова: свиньи; SNP; признаки продуктивности; АР0ВЕС4; SLC25A26
