CC BY
24
Оригинальная статья / Original article УДК 58.03:631.527.2
DOI: http://dx.doi.org/10.21285/2227-2925-2019-9-2-277-287
Методические рекомендации в использовании антител против дегидринов в агробиотехнологиях
© Г.Б. Боровский, М.В. Иванова, М.А. Кондакова, Н.Е. Коротаева, Г.Г. Суворова, И.В. Уколова, А.В. Федяева
Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, г. Иркутск, Российская Федерация
Резюме: Детекция уровня экспрессии дегидринов в растениях становится распространенным приемом в тестировании устойчивости растений к холоду, засухе, засоленности почвы или высокому содержанию в ней ионов тяжелых металлов. Наиболее простым способом оценки содержания дегидринов является использование специфических антител, при этом специфичность антител является критическим моментом. На основании опыта определения дегидринов у различных растительных объектов авторами данной статьи была поставлена задача - сравнить реакции с антителами реакционноспособных белков, полученных из трех наиболее доступных источников, оценить их специфичность. Сопоставимость детектируемых антителами белков по количеству и молекулярной массе была исследована на нескольких растительных объектах: 1) суммарный и термостабильный белок хвои сосны обыкновенной, 2) белок митохондрий гороха; 3) суммарный и термостабильный белок озимой пшеницы; 4) суммарный и термостабильный белок арабидопсиса. Во всех случаях использования антител наблюдали либо слабые, либо существенные различия в количестве и молекулярной массе детектируемых групп белков. Эти различия можно объяснить тремя возможными причинами: вариабельность К-сегмента, разные белки-носители, используемые производителями, и наличие общих реакционноспособных эпитопов у некоторых групп белков, не являющихся дегидринами. При анализе различий в количестве детектируемых групп при использовании антител от разных производителей установлено, что они минимальны у злаковых растений и становятся больше у двудольных и хвойных, причем наибольшее количество детектируемых групп отмечено у митохондрий гороха. Часть связывающихся с антителами групп белков определенно не является дегидринами. Упомянутые различия меньше у термостабильных белков. Таким образом, получение термостабильной фракции белков можно рекомендовать в качестве простой процедуры, повышающей уверенность в детекции дегидринов. Использование сравнения количества дегидринов в качестве меры относительной устойчивости различных растений не следует применять при сравнении эволюционно далеких друг от друга видов, поскольку реакционноспособность антител к дегидринам далеких друг от друга видов может существенно отличаться. В то же время этот метод может быть рекомендован в агробиологии для оценки на молекулярном уровне исходной или индуцированной устойчивости сортов растений одного и того же вида, либо родственных видов к замерзанию, засухе и другим неблагоприятным условиям, связанным с дефицитом воды.
Ключевые слова: дегидрины, устойчивость растений, вестерн-блоттинг, антитела
Благодарности: Работа выполнена при частичной финансовой поддержке РФФИ (проект N 18-54-00026).
Информация о статье: Дата поступления 10 октября 2018 г.; дата принятия к печати 7 июня 2019 г.; дата онлайн-размещения 28 июня 2019 г.
Для цитирования: Боровский Г.Б., Иванова М.В., Кондакова М.А., Коротаева Н.Е., Суворова Г.Г., Уколова И.В., Федяева A.B. Методические рекомендации в использовании антител против дегидринов в агробиотехнологиях // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2019. Т. 9, N 2. С. 277-287. DOI: 10.21285/2227-2925-2019-9-2-277-287
Guidelines for using antibodies against dehydrins in agrobiotechnology
© Gennadii B. Borovskii, Maria V. Ivanova, Marina A. Kondakova,
Natalia E. Korotaeva, Galina G. Suvorova, Irina V. Ukolova, Anna V. Fedyaeva
Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry SB RAS, Irkutsk, Russian Federation
Abstract: Detection of the expression levels of the dehydrin gene in plants is increasingly becoming a widespread technique for testing plant resistance to cold, drought, salinity or high heavy metal concentrations in soils. The simplest way to determine the content of dehydrins consists in using specific antibodies (antibody specificity is critical). The experience of dehydrin detection in various plants provided a basis for this work. In this study, we set out to compare the reactions of antibodies with reactive proteins derived from three most accessible sources, as well as to assess their specificity. The comparability of detected proteins in terms of their quantity and molecular weight was studied for several plants: 1) total and thermostable protein in scots pine needles; 2) mitochondrial protein in peas; 3) total and thermostable protein in winter wheat; 4) total and thermostable protein in arabidopsis. In all the cases, either slight or significant differences in the quantity and molecular weight of the detected protein groups were observed. These differences can be attributed to the three possible reasons: K-segment variability; different carrier proteins used by manufacturers; as well as the presence of shared reactive epitopes in some groups of proteins that are not dehydrins. The analysis of differences in the number of the groups detected using antibodies from different manufacturers reveals their amount to be minimal for cereal plants and becoming larger for dicotyledons and conifers. The largest number of the groups was detected in pea mitochondria. Some of the antibody-binding protein groups are definitely not dehydrins. The abovementioned differences are smaller for thermostable proteins. Thus, obtaining a thermostable protein fraction can be recommended as a simple procedure increasing the dehydrins detection level. The comparison of the dehydrin amounts should not be used as a measure of the relative plant resistance when comparing evolutionarily distant species, since the antibody reactivity to the dehydrins of distant species may differ significantly. At the same time, this method can be used in agrobiology for the molecular-level assessment of the initial or induced resistance of plant varieties (same or related species) to cold, drought, as well as other adverse conditions associated with water deficiency.
Keywords: dehydrins, plant resistance, western blot, antibodies
Acknowledgements: The study partly was supported by RFBR project no. 18-54-00026.
Information about the article: Received October 10, 2018; accepted for publication June 7, 2019; available online June 28, 2019.
For citation: Borovskii G.B., Ivanova M.V., Kondakova M.A., Korotaeva N.E., Suvorova G.G., Ukolova I.V., Fedyaeva A.V. Guidelines for using antibodies against dehydrins in agrobiotechnology. Izvestiya Vuzov. Pri-kladnaya Khimiya i Biotekhnologiya [Proceedings of Universities. Applied Chemistry and Biotechnology]. 2019, vol. 9, no. 2, pp. 277-287. (In Russian). DOI: 10.21285/2227-2925-2019-9-2-277-287
ВВЕДЕНИЕ
Детекция уровня экспрессии дегидринов в растениях становится распространенным приемом в тестировании устойчивости растений к холоду, засухе, засоленности почвы или высокому содержанию в ней ионов тяжелых металлов. Это удобный, быстрый и недорогой прием, позволяющий достаточно надежно установить уровень развития одного из самых распространенных механизмов молекулярной защиты растительной клетки. Характерным защитным приспособлением растений является накопление белков позднего эмбриогенеза или LEA (Late Embryogenesis-Abundant) белков [1, 2]. Из нескольких классов обнаруженных LEA белков в связи с адаптациями к разнообразным повреждающим факторам огромный интерес вызвала II группа белков, которые называют также де-гидринами (dehydrins) [3-7]. Дегидрины - это группа белков с молекулярной массой от 9 до 200 кД, по данным денатурирующего электрофореза. Однако, поскольку дегидрины движутся аномально из-за своего аминокислотного состава, действительный размер этих белков не превышает 70 кД. После того, как стали доступны данные первичных последовательно-
стей дегидринов, обнаружили несколько консервативных мотивов, присутствующих в них. Наличие одного из них, а именно обогащенного лизином К-сегмента (EKKGIMDKIKEKLPG), в настоящее время является определяющим признаком при отнесении белка к группе де-гидринов. Дегидрины присутствуют у всех растений, их также обнаружили у мхов, лишайников, водорослей и цианобактерий [4]. В последние годы активно исследовалась физиологическая роль дегидринов, связанная с адаптацией. Так, например, авторами работ [8-10] было показано, что дегидрины активно накапливались в проростках и узлах кущения злаковых при адаптации к низкой температуре и осенней адаптации в полевых условиях. Количество де-гидринов было прямо пропорционально устойчивости растений к отрицательным температурам. При потере устойчивости весной или в контролируемых условиях снижение морозоустойчивости коррелировало со снижением содержания дегидринов в тканях растений [8, 9]. Сходные данные в мире были получены на огромном списке видов растений, что привело к использованию дегидринов в качестве молекулярных маркеров устойчивости растений к этим
факторам [4]. Однако не только низкие температуры и засуха вызывают накопление дегидринов. Показано, что накопление дегидринов также происходит при осмотическом стрессе, солевом и окислительном стрессах, а также при гипертермии и воздействии высоких концентраций ионов тяжелых металлов [4, 11]. Таким образом, детекция индуцибельных уровней дегидринов после воздействия стрессового фактора может служить определенным показателем уровня устойчивости растения к нему.
Преимущество такой сравнительной оценки устойчивости родственных сельскохозяйственных растений очень велико: селекционеры могут быстро оценить как первоначальную, так и индуцируемую толерантность сельскохозяйственных культур в лабораторных условиях (на стадии проростков), либо, взяв для анализа небольшие части растения и не подвергая их целиком уничтожению. Сравнительная дешевизна оценки дает возможность проводить массовые анализы, ускорить их и снизить затраты на процесс отбора и селекции, особенно на начальных стадиях после неспецифического мутагенеза с целью создания разнообразия для последующего отбора.
Наиболее простым способом оценки содержания дегидринов являются рутинные методы оценки содержания интересующих белков - вестерн-блоттинг с последующим использованием специфических антител [12], либо ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) [13] или другие методы иммунохимии. Во всех случаях применения иммунохимии содержание дегидринов будет оценено по реакции с антителами, распознающими эти белки, и, следовательно, критическим моментом является специфичность использованных антител в определении количества дегидри-нов. Широко распространены результаты, где использовались антитела против К-сегмента дегидринов, полученные группой под руководством Dr. T.J. Close. При этом использованный ими пептид, содержащий К-сегмент (TGEKKGIMDKIKEKLPGQH), был абсолютно консервативен у риса, кукурузы и ячменя [14]. Также коммерчески доступны разработанные позднее поликлональные антитела на этот же К-сегмент, которые повсеместно используют для детекции дегидринов. Это продукты фирм «Agrisera» и «StressGen» («Enzo LifeSci-ences»). Гаптеном, определяющим специфичность реакции с дегидринами, во всех случаях служил описанный выше синтетический пептид. Белком-носителем у фирмы «Agrisera» служил гемоцианин лимфы улитки (Keyhole Limpet He-mocyanin - KLH), тогда как фирма «StressGen», так же, как и группа T.J. Close ранее, использовала бычий сывороточный альбумин (BSA).
Настоящая публикация обобщает опыт работы авторов с антителами всех трех произво-
дителей на нескольких растительных объектах, которые оказались в поле зрения в ходе выполнения различных научных задач. Целью данной работы являлось сравнение специфичности реакции с антителами из трех наиболее доступных источников реакционноспособных белков. Ранее подобная работа не проводилась у нас в стране или за рубежом. Наиболее важно определять дегидрины у сельскохозяйственных растений (в данном случае горох и пшеница), однако, периодически возникает необходимость в детекции этих белков у модельного растительного объекта (арабидопсис) и важного для Сибири древесного растения -сосны. Сопоставимость в количестве и молекулярной массе детектируемых антителами белков была исследована на нескольких растительных объектах, хотя и не во всех случаях удавалось использовать все три типа антител: 1) суммарный и термостабильный белок хвои сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.),
2) белок митохондрий гороха (Pisum sativum L.);
3) суммарный и термостабильный белок озимой пшеницы (Triticum aestivum L.); 4) суммарный и термостабильный белок резуховидки Та-ля (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.).
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Общий водорастворимый белок хвои сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) выделяли по ранее опубликованной методике [15]. Хвою, фиксированную в жидком азоте, растирали в буфере (0,1 M трис-HCl, pH 7,5), содержавшем 1% ДДС-Na, 12 мМ меркаптоэтанол, 10 мМ ЭДТА и 4% нерастворимого поливинилпирро-лидон (PVP) («Serva», Германия). После центрифугирования (50000g, 20 мин) к суперна-танту вновь добавляли нерастворимый PVP (4% от массы супернатанта), центрифугировали (50000g, 20 мин), затем осаждали белки четырьмя объемами охлажденного ацетона, осажденные белки отделяли центрифугированием (5000g, 10 мин) и растворяли их 3 мин на водяной бане в буфере для образца (0,5 М трис-HCl, pH 6,8), содержавшего 1 мМ ЭДТА, 10%-ный ДДС-Na, 20%-ный глицерин. Термостабильную фракцию общего белка отделяли после 10-минутной инкубации общего белка на кипящей водяной бане и последующего удаления денатурированного белка центрифугированием (5000g, 10 мин). Дальнейшая подготовка образцов для электрофореза термостабильного белка та же, что описана выше.
Митохондрии проростков гороха (Pisum sativum L., сорт Аксайский усатый 55) выделяли из этиолированных шестисуточных проростков, выращенных при 20 °С на фильтровальной бумаге. Митохондрии гороха выделяли, как описано ранее в работе [16], но с небольшими изменениями. Клетки мягко разрушали путем продав-ливания проростков через пресс с множеством
отверстий в буфере для гомогенизации (300 мМ сахарозы, 40 мМ MOPS-KOH (pH 7,5), 2 мМ ЭДТА, 1 мМ MgCl2, 10 мM KCl, 0,5% PVP, 0,05% цистеина и 0,4% BSA) в соотношении массы проростков к массе буфера 1:3 Профильтрованный через капроновую ткань гомогенат центрифугировали (2000g 10 мин), осадок отбрасывали, а митохондриальную фракцию осаждали (20000g 10 мин), промывали промывочным буфером (300 мМ сахарозы, 20 мМ MOPS-KOH (pH 7.5), 2 мМ ЭДТА, 1 мМ MgCfe, 10 мМ KCl и 0.2% BSA) и центрифугировали второй раз (20000g 10 мин). Митохондрии были очищены в градиенте перколла (23% и 40% Percoll) в среде для градиента (300 мМ сахарозы, 10 мМ MOPS-KOH (pH 7.5), 5 мМ MgCl2, 10 мМ KCl, 0,2% BSA). После центрифугирования (24500g 35 мин) митохондрии собирали на границе 23-40% и дважды промывали промывочным буфером. Осадок митохондрий гомогенизировали в буфере для выделения белка (0,1 M трис-HCl, pH 7,5), содержавшего 1% дДс-Na, 12 мМ меркаптоэтанол, 10 мМ ЭДТА). Дальнейшая подготовка образцов для электрофореза белка та же, что описана выше.
Этиолированные проростки пшеницы сорта «Иркутская» выращивали при 25 °С до возраста 3 суток. Закаливание 2-х суточных проростков пшеницы проводили в темноте 7 сут. при 4 °С. По стадии развития и размеру эти проростки соответствовали 3-х суточным проросткам, выращенным в контрольных условиях. Белок выделяли растиранием проростков в буфере для выделения белка (0,1 M трис-HCl, pH 7,5), содержащего 0,1% ДдС-Na, 12 мМ меркаптоэтанол, 10 мМ ЭДТА). После центрифугирования (50000g, 20 мин) из супернатанта осаждали белки четырьмя объемами охлажденного ацетона. Дальнейшая подготовка образцов для электрофореза белка та же, что описана выше.
Суммарный белок резуховидки Таля (Arabi-dopsis thaliana (L.) Heynh.) выделяли из 14-суточ-ных растений (с момента прорастания) на твердой агаризованной среде и 21 -суточных, выращенных в почве. Растения выращивали при температуре 22 °С в суточном цикле день/ночь (16/8 ч). Низкотемпературное закаливание проводили при 4 °С при таком же цикле освещения. Процедура выделения суммарного водорастворимого белка и его термостабильной фракции приведена выше (выделение белка из хвои сосны) за исключением того, что осаждение белка холодным ацетоном проводили сразу после первого центрифугирования.
Концентрацию белка во всех случаях определяли с помощью реактива Брэдфорда («Bio-Rad», США) [17]. Перед электрофорезом количество наносимого белка было выровнено, на гель наносили по 10 мкг белка каждой пробы. После разделения белков с помощью
Na-ДДС-электрофореза и WesternBlot с системой mini-Protean III («BioRad», США), как описано в [12], проводили инкубирование полученных нитроцеллюлозных мембран в растворе первичных антител против дегидринов (AS07 206, «Agrisera», Швеция, ADI-PLA-100 «StressGen» («Enzo LifeSciences», США) или полученных непосредственно от Dr. T.J. Close). Антитела визуализировали с помощью вторичных антител, конъюгированных со щелочной фосфатазой (111-055-144, «Jackson Immu-noResearch», США), в присутствии BCIP и NBT («Thermo Scientific», США).
Эксперименты были проведены в трех-четырех биологических повторностях. Выделенный в каждой повторности белок анализировался электрофорезом с последующим вестерн-блоттингом. На рисунках представлена репрезентативная мембрана, которая отражает стабильно воспроизводимые результаты (стрелками указаны молекулярные массы, кД, детектируемых групп белков).
1. Суммарный и термостабильный белок хвои сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.). Результаты исследований показали, что антитела, полученные из разных источников, при анализе белков хвои сосны распознают только группы белков, частично совпадающие по молекулярным массам (рис. 1). Визуализация групп белков, реагирующих с антителами, произведена, как описано выше. Большее сходство наблюдали при сравнении действия антител от T.J. Close и «StressGen», что можно объяснить схожестью белка-носителя, использованного при производстве антител.
Группы белков хвои сосны, детектируемые антителами производства «Agrisera», отличаются по молекулярной массе в большей степени от набора белков, окрашенных с помощью антител из двух других источников. При использовании для электрофореза термостабильной фракции белков различия уменьшаются, как уменьшается и количество детектируемых групп полипептидов, однако даже в уменьшенном варианте различия остаются (см. рис. 1). В данном случае к дегидринам можно с уверенностью отнести группу с массой 70 кД, а остальные, возможно, не являются дегидрина-ми, хотя это требует дополнительной проверки.
2. Белок митохондрий проростков гороха (Pisum sativum L.). При анализе белка, выделенного из митохондрий проростков гороха, также были обнаружены различные по относительной молекулярной массе дегидрины при окраске антителами от разных производителей. Антитела фирмы «Agrisera» реагируют с полипептидами 70, 52, 44, 39 и 35 кДа, тогда как антитела, предоставленные Dr. T.J. Close, детектируют белки 85, 67, 61, 47 и 42 кДа (рис. 2). В данном эксперименте не удалось использовать антитела «StressGen», поскольку группы белков
очень сильно отличаются. Для уверенного отнесения детектируемых групп к дегидринам необ-
кД
Суммарный блок Close StressGen Agrisera
73 72 70
40
30 26
120
44
ходимо сверить данные с антителами против белков-носителей (BSA и KLH).
КД
73 70
Термостабильный белок Close StressGen Agrisera
120
14,5 —
Рис. 1. Выявление дегидринов хвои сосны обыкновенной с помощью антител разных производителей: слева представлен блоттинг суммарного водорастворимого белка, справа - его термостабильной фракции
Fig. 1. Detection of pine needles dehydrins with the antibodies from different manufacturers (indicated in the figure). On the left is a blot of total water-soluble protein, on the right is a blot of its thermostable fraction
Рис. 2. Выявление групп белков, взаимодействующих с антителами на дегидрины, в изолированных митохондриях гороха с помощью антител разных производителей
Fig. 2. Identification of protein groups that interact with antibodies to dehydrins in isolated pea mitochondria using antibodies from different manufacturers
3. Суммарный белок озимой пшеницы (Trit-icum aestivum L.) сорта «Иркутская» в контроле и при закаливающей температуре. При анализе дегидринов озимой пшеницы были обнаружены незначительные различия в количестве групп полипептидов, детектируемых антителами производства «Agrisera» и присланными Dr. T.J. Close, несмотря на то, что в этом случае производители использовали разные белки-носители с пептидом, содержащим К-сегмент (рис. 3). При этом также отчетливо видна сильная экспрессия дегидри-нов при закаливании. В данном случае к де-гидринам можно с уверенностью отнести группы массой 209, 196, 80, 66 и 51 кД, поскольку они выявляются обоими антителами. А груп -па массой 40 кД, возможно, не является де-гидринами, но это требует дополнительной проверки.
4. Суммарный и термостабильный белок из листьев резуховидки Таля (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh) в контроле и при закаливающей температуре. Белки выделены из листьев растений резуховидки Таля, выращенных на твердой агаризированной среде или в почве. В этом случае различия в количестве детектируемых групп при использовании антител от раз-
ных производителей оказались довольно большими (рис. 4), причем предположительно часть окрашенных белков не является де-гидринами. Некоторые группы полипептидов не увеличиваются после инкубации при низкой температуре, а напротив, уменьшаются, что не характерно для этих белков. Кроме того, на иммуноблоттинге с антителами от «Agrisera» видна диффузная группа в районе 55 кД, которая, вероятно, является большой субъединицей РБФК (рибулозобисфосфаткарбоксилаза) и хорошо видна при окраске на белок. Интересно, что антитела производства «Agrisera» реагируют с ней, а антитела от Dr. T.J. Close нет. Наверное, проявляет себя использование при производстве антител разного белка-носителя.
Для большей уверенности в детекции де-гидринов проведен анализ термостабильных белков из листьев растений резуховидки Таля, выращенных в почве, что, однако, удалось сделать только с антителами от Dr. T.J. Close. Данные показали, что термостабильными и одновременно увеличивающимися при низкой температуре являются белки массой 70, 50, 40 и 25 кД именно их можно считать дегидринами этого растения (рис. 5).
Рис. 3. Выявление групп белков, взаимодействующих с антителами на дегидрины в проростках озимой пшеницы сорта «Иркутская», с помощью антител разных производителей (к. - контроль; зак. - закаливание к низкой температуре)
Fig. 3. Identification of protein groups that interact with antibodies to dehydrins in seedlings of «Irkutskaya» winter wheat with the help of antibodies from various manufacturers (К. - control; ЗАК. - hardening to a low temperature)
Close
ЗАК. К. ЗАК. К.
Agrisera Почва тв. среда ЗАК. К. ЗАК.
кД
70 58
50 40
34 25
Рис. 4. Выявление белков, взаимодействующих с антителами против К-сегмента дегидринов, с помощью антител разных производителей. Белки выделены из листьев резуховидки Таля, выращенной на твердой агаризированной среде или в почве (к. - контроль; зак. - закаливание к низкой температуре)
Fig. 4. Detection of proteins interacting with antibodies against K-segment dehydrins using antibodies from different manufacturers (indicated in the figure). Proteins are isolated from the leaves of Thale cress plants grown on solid agarized medium or in soil (K. - control; 3AK. - hardening to a low temperature)
Рис. 5. Выявление термостабильных белков, взаимодействующих с антителами против К-сегмента дегидринов (от T.J. Close). Белки выделены из листьев резуховидки Таля, выращенной в почве (К. - контроль; ЗАК. - закаливание к низкой температуре)
Fig. 5. Detection of thermostable proteins interacting with antibodies against the K-segment of dehydrins (from T.J. Close). Proteins are isolated from Thale cress leaves grown in soil (K. - control; 3AK. - hardening to a low temperature)
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Во всех случаях использования антител из различных источников наблюдались существенные или слабые различия в количестве и интенсивности окрашивания детектируемых групп белков. Возможны три причины, объясняющие полученные результаты:
1) известно, что К-сегмент не является абсолютно одинаковым, и ни одна аминокислота в нем не является абсолютно консервативной [4, 5]. При этом вариабельность в строении К-сегмента у голосеменных (в нашем случае сосна) гораздо больше, чем у покрытосеменных [18]. Если бы мы сравнивали разные виды
или ткани растений, то различия в детекции между антителами могли бы быть связаны с вариабельностью К-сегмента, использованного для синтеза антител. Однако мы сравнивали одни и те же образцы, а по данным производителей они использовали один и тот же пептид в качестве гаптена;
2) разница в количестве детектируемых групп также может объясняться разными белками-носителями, использованными производителями. В этом случае группы белков, которые детектируются антителами одних производителей и не детектируются антителами других, не являются дегидринами, что может быть проверено антителами против белков-носителей (BSA или KLH). Однако по нашим данным, в случае, например, пшеницы, вклад белков-носителей в реакцию на дегидрины минимален (см. рис. 3);
3) существуют общие реакционноспособ-ные эпитопы у некоторых групп белков, не являющихся дегидринами, в растениях разных видов, которые способны взаимодейст-вовать с антителами. В данном случае эти белки отселектировать иммунохимически сложно. Для первоначальной детекции групп де-гидринов по относительной молекулярной массе можно рекомендовать использовать термостабильную фракцию белков и индукцию экспрессии известными стимулами индукции дегидринов - холод, дегидратация. Если планируется сравнение ранее не известных видов, то стоит приобрести антитела, выработанные производителями против белков-носителей, чтобы отделить возможное срабатывание антител на них. Конечно, случаи ложной детекции антителами - не редкость. Однако в этом случае интересно то, что антитела должны были бы быть идентичны по реакции, поскольку выработаны с использованием одного и того же гаптена и одинакового белка-носителя (антитела «Agrisera» и от Prof. Close).
1. Galau G.A., Hughes D.W., Dure L. Abscisic acid induction of cloned cotton late embryogenesis-abundant (Lea) mRNAs // Plant Molecular Biology. 1986. Vol. 7. Issue 3. P. 155-170. DOI: https://doi.org/ 10.1007/BF00021327
2. Thomashow M.F. Plant cold acclimation: Freezing Tolerance Genes and Regulatory Mechanisms // Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 1999. Vol. 50. P. 571-599. DOI: https://doi.org/10.1146/annurev.arplant.50.1.571.
3. Close T.J. Dehydrins: A commonalty in the response of plants to dehydration and low temperature // Physiologia Plantarum. 1997. Vol. 100. P. 291-296. DOI: https://doi.org/10.1111yj.1399-3054.1997.tb04785.x
4. Hanin M., Brini F.E., Ebel C., Toda Y., Take-
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Антитела разных производителей детектируют не полностью одинаковые по относительной молекулярной массе группы белков при анализе дегидринов из различных растений. Различия в количестве детектируемых групп при использовании антител от разных производителей минимальны при анализе злаковых растений и становятся больше при анализе двудольных и хвойных. Часть реагирующих с антителами групп, вероятно, не является дегидринами. Упомянутые различия между наборами окрашенных на мембране групп белков становятся меньше у термостабильных белков. Температурную обработку белкового раствора можно рекомендовать в качестве простой процедуры, увеличивающей уверенность в специфичности детекции дегидринов. Использование сравнения количества дегидри-нов в качестве меры относительной устойчивости различных растений не следует применять при сравнении эволюционно далеких друг от друга видов, поскольку реакционноспособность антител к дегидринам далеких друг от друга видов может существенно различаться. Наиболее уверенно, как показали проведенные исследования, его можно использовать для злаковых культур. В научной литературе также можно найти примеры успешного применения этого приема для многих других сельскохозяйственных растений. Этот метод может быть рекомендован для использования в агротехнологических и селекционных работах для оценки исходной или индуцированной устойчивости сортов растений одного и того же вида, либо родственных видов к замерзанию, засухе и другим неблагоприятным условиям, связанным с дефицитом воды на молекулярном уровне. Однако следует относиться к результатам детекции антителами против дегидринов с разумной критичностью. Наш опыт их применения показывает, что на некоторых видах растений антитела могут реагировать с другими белками даже при соблюдении всех правил имму-ноблоттинга.
КИЙ СПИСОК
da S., Masmoudi K. Plant dehydrins and stress tolerance: Versatile proteins for complex mechanisms // Plant Signaling & Behavior. 2011. Vol. 6. P. 1503-1509. DOI: https://doi.org/10.4161/psb.6. 10.17088
5. Graether S.P., Boddington K.F. Disorder and function: a review of the dehydrin protein family // Front Plant Sci. 2014. Vol. 5. P. 1-12. DOI: https://doi.org/10.3389/fpls.2014.00576
6. Banerjee A., Roychoudhury A. Group II late embryogenesis abundant (LEA) proteins: structural and functional aspects in plant abiotic stress // Plant Growth Regulation. 2016. Vol. 79. Issue 1. P. 1-17. DOI: https://doi.org/10.1007/s10725-015-0113-3
7. Vitâmvâs P., Kosovâ K., Musilovâ J., Holko-vâ L., Marik P., Smutnâ P., Klima M., Prasil I.T. Relation-
ship Between Dehydrin Accumulation and Winter Survival in Winter Wheat and Barley Grown in the Field // Frontiers in Plant Science. 2019. Vol.10. A. 7 DOI: 10.3389/fpls.2019.00007
8. Боровский Г.Б., Ступникова И.В., Пешкова А.А., Дорофеев Н.В., Войников В.К. Термостабильные белки проростков и узлов кущения растений озимой пшеницы // Физиология растений. 1999. Т. 46. С. 777-783.
9. Stupnikova I.V., Borovskii G.B., Dorofeev N.V., Peshkova A.A., Voinikov V.K. Accumulation and disappearance of dehydrins and sugars depending on freezing tolerance of winter wheat plants at different developmental phases // Journal of Thermal Biology. 2002. Vol. 27. P. 55-60. DOI: https://doi.org/10.1016/S0306-4565(01)00015-8
10. Pomortsev A.V., Dorofeev N.V., Katyshe-va N.B., Peshkova А.А. Changes in dehydrin composition in winter cereal crowns during winter survival // Biologia Plantarum. 2017. Vol. 61. P. 394-398. DOI: 10.1007/s10535-016-0673-8
11. Yu Zhengyang, Wang Xin, Zhang Linsheng Structural and Functional Dynamics of Dehydrins: A Plant Protector Protein under Abiotic Stress // Int. J. Mol. Sci. 2018. Vol. 19. No. 11. P. 3420. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms19113420
12. Timmons T.M., Dunbar B.S. Protein blotting and immunodetection // Methods in Enzymology. 1990. Vol. 182. P. 679-688. DOI: https://doi.org/10. 1016/0076-6879(90)82053-5
13. Weiland G. The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)--a new serodiagnostic method for the detection of parasitic infections // Munchener medizinische Wochenschrift. 1978.
Vol. 120. P. 1457-1460.
14. Close T.J., Fenton R.D., Moonan F. A view of plant dehydrins using antibodies specific to the carboxyterminal peptide // Plant Molecular Biology. 1993. Vol. 23. P. 279-286. DOI: https://doi.org/10. 1007/BF00029004.
15. Korotaeva N.E., Oskorbina M.V., Kopyto-va L.D., Suvorova G.G., Borovskii G.B., Voinikov V.K. Variations in the content of stress proteins in the needles of common pine (Pinus sylvestris L.) within an annual cycle // Journal of Forest Research. 2012. Vol. 17. P. 89-7. DOI: https://doi.org/10.1007/ s10310-011-0260-y
16. Grabel'nykh O.I., Pobezhimova T.P., Pavlov-skaya N.S., Koroleva N.A., Borovik O.A., Lyubush-kina I.V., Voinikov V.K. Antioxidant function of alternative oxidase in mitochondria of winter wheat during cold hardening // Biochemistry (Moscow) Supplement Series A: Membrane and Cell Biology. 2011. Vol. 5. No. 3. P. 249-257. DOI: 10.1134/S 1990747811040040
17. Bradford M.M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding // Analytical biochemistry. 1976. Vol. 72. P. 248-254. DOI: https://doi.org/10.1016/0003-2697 (76)90527-3
18. Jarvis S.B., Taylor M.A., Macleod M.R., Davies H.V. Cloning and Characterisation of the cDNA Clones of three Genes that are differentially Expressed during Dormancy-Breakage in the Seeds of Douglas Fir (Pseudotsuga menziesii) // Journal of Plant Physiology. 1996. Vol. 147. P. 559-566. DOI: https://doi.org/10.1016/S0176-1617(96)80046-0
1. Galau G.A., Hughes D.W., Dure L. Abscisic acid induction of cloned cotton late embryogenesis-abundant (Lea) mRNAs. Plant Molecular Biology. 1986, vol. 7, issue 3, pp. 155-170. DOI: https://doi. org/10.1007/BF00021327
2. Thomashow M.F. Plant cold acclimation: Freezing Tolerance Genes and Regulatory Mechanisms. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 1999, vol. 50, pp. 571-599. DOI: https://doi.org/10.1146/annurev.arplant.50.1.571
3. Close T.J. Dehydrins: A commonalty in the response of plants to dehydration and low temperature. Physiologia Plantarum. 1997, vol. 100, pp. 291-296. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1399-3054. 1997.tb04785.x
4. Hanin M., Brini F.E., Ebel C., Toda Y., Ta-keda S., Masmoudi K. Plant dehydrins and stress tolerance: Versatile proteins for complex mechanisms. Plant Signaling & Behavior. 2011, vol. 6, pp. 1503-1509. DOI: https://doi.org/10.4161/psb. 6.10.17088
5. Graether S.P., Boddington K.F. Disorder and function: a review of the dehydrin protein family. Front Plant Sci. 2014, vol. 5, pp. 1-12. DOI: https://doi.org/10.3389/fpls.2014.00576
6. Banerjee A., Roychoudhury A. Group II late embryogenesis abundant (LEA) proteins: structural and functional aspects in plant abiotic stress. Plant Growth Regulation. 2016, vol. 79, issue 1, pp. 1-17. DOI: https://doi.org/10.1007/s10725-015-0113-3
7. Vitamvas P., Kosova K., Musilova J., Holko-va L., Marik P., Smutna P., Klima M., Prasil I.T. Relationship Between Dehydrin Accumulation and Winter Survival in Winter Wheat and Barley Grown in the Field. Frontiers in Plant Science. 2019, vol. 10, A. 7. DOI: 10.3389/fpls.2019.00007
8. Borovskii G.B., Stupnikova I.V., Peshkova A.A., Dorofeev N.V., Voinikov V.K. Thermostable proteins of seedlings and tillering nodes of winter wheat plants. Fiziologiya rastenii. 1999, vol. 46, pp. 777-783. (In Russian)
9. Stupnikova I.V., Borovskii G.B., Dorofeev N.V., Peshkova A.A., Voinikov V.K. Accumulation and disappearance of dehydrins and sugars depending on freezing tolerance of winter wheat plants at different developmental phases. Journal of Thermal Biology. 2002, vol. 27, pp. 55-60. DOI: https://doi. org/10.1016/S0306-4565(01)00015-8
10. Pomortsev A.V., Dorofeev N.V., Katyshe-va N.B., Peshkova АА Changes in dehydrin composi-
tion in winter cereal crowns during winter survival. Biologia Plantarum. 2017, vol. 61, pp. 394-398. DOI: 10.1007/s10535-016-0673-8
11. Yu Zhengyang, Wang Xin, Zhang Linsheng Structural and Functional Dynamics of Dehydrins: A Plant Protector Protein under Abiotic Stress. Int. J. Mol. Sci. 2018, vol. 19, no. 11, pp. 3420. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms19113420
12. Timmons T.M., Dunbar B.S. Protein blotting and immunodetection. Methods in Enzymology. 1990, vol. 182, pp. 679-688. DOI: https://doi.org/ 10.1016/0076-6879(90)82053-5
13. Weiland G. The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)--a new serodiagnostic method for the detection of parasitic infections. Munchener medizinische Wochenschrift. 1978, vol. 120, pp. 1457-1460.
14. Close T.J., Fenton R.D., Moonan F. A view of plant dehydrins using antibodies specific to the carboxyterminal peptide. Plant Molecular Biology. 1993, vol. 23, pp. 279-286. DOI: https://doi.org/ 10.1007/BF00029004
15. Korotaeva N.E., Oskorbina M.V., Kopyto-va L.D., Suvorova G.G., Borovskii G.B., Voini-kov V.K. Variations in the content of stress proteins in
Критерии авторства
Боровский Г.Б., Иванова М.В., Кондакова М.А., Коротаева Н.Е., Суворова Г.Г., Уколова И.В., Федяева А.В. выполнили экспериментальную работу, на основании полученных результатов провели обобщение и написали рукопись. Боровский Г.Б., Иванова М.В., Кондакова М.А., Коротаева Н.Е., Суворова Г.Г., Уколова И.В., Федяева А.В. имеют на статью равные авторские права и несут равную ответственность за плагиат.
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Боровский Геннадий Борисович, СЕН
д.б.н., профессор,
заместитель директора по научной работе, Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, e-mail: borovskii@sifibr.irk.ru
Иванова Мария Владимировна,
к.б.н., научный сотрудник,
Сибирский институт физиологии и биохимии
растений СО РАН,
e-mail: omaria-84@yandex.ru
Кондакова Марина Александровна,
к.б.н., ведущий инженер,
Сибирский институт физиологии и биохимии
растений СО РАН,
e-mail: kondakova-marina@mail.ru
the needles of common pine (Pinus sylvestris L.) within an annual cycle. Journal of Forest Research. 2012, vol. 17, pp. 89-7. DOI: https://doi.org/10.1007/ s10310-011-0260-y
16. Grabel'nykh. O.I., Pobezhimova T.P., Pav-lovskaya N.S., Koroleva N.A., Borovik O.A., Lyu-bushkina I.V., Voinikov V.K. Antioxidant function of alternative oxidase in mitochondria of winter wheat during cold hardening. Biochemistry (Moscow) Supplement Series A: Membrane and Cell Biology. 2011, vol. 5, no. 3, pp. 249-257. DOI: 10.1134/ S1990747811040040
17. Bradford M.M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Analytical biochemistry. 1976, vol. 72, pp. 248-254. DOI: https://doi.org/10.1016/0003-2697(76)90527-3
18. Jarvis S.B., Taylor M.A., Macleod M.R., Davies H.V. Cloning and Characterisation of the cDNA Clones of three Genes that are differentially Expressed during Dormancy-Breakage in the Seeds of Douglas Fir (Pseudotsuga menziesii). Journal of Plant Physiology. 1996, vol. 147, pp. 559-566. DOI: https://doi.org/10.1016/S0176-1617(96)80046-0
Contribution
Gennadii B. Borovskii, Maria V. Ivanova, Marina A. Kondakova, Natalia E. Korotaeva, Galina G. Suvorova, Irina V. Ukolova, Anna V. Fedyaeva carried out the experimental work, on the basis of the results summarized the material and wrote the manuscript. Gennadii B. Borovskii, Maria V. Ivanova, Marina A. Kondakova, Natalia E. Korotaeva, Galina G. Suvorova, Irina V. Ukolova, Anna V. Fedyaeva have equal author's rights and bear equal responsibility for plagiarism.
Conflict of interests
The authors declare no conflict of interests regarding the publication of this article.
AUTHORS' INDEX
Gennadii B. Borovskii, ÖE3
Dr. Sci. (Biology), Professor, Vice-Director on Science, Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry SB RAS, e-mail: borovskii@sifibr.irk.ru
Maria V. Ivanova,
Ph.D. (Biology), Researcher, Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry SB RAS, e-mail: omaria-84@yandex.ru
Marina A. Kondakova,
Ph.D. (Biology), Leading Engineer, Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry SB RAS, e-mail: kondakova-marina@mail.ru
Коротаева Наталья Евгеньевна,
к.б.н., старший научный сотрудник, Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, e-mail: knev73@yandex.ru
Суворова Галина Георгиевна,
д.б.н., ведущий научный сотрудник, Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, e-mail: galina.g.suvor@gmail.com
Уколова Ирина Владимировна,
к.б.н., старший научный сотрудник, Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, e-mail: irina@sifibr.irk.ru
Федяева Анна Валерьевна,
к.б.н., научный сотрудник,
Сибирский институт физиологии и биохимии
растений СО РАН,
e-mail: fedyaeva.anna@mail.ru
Natalia E. Korotaeva,
Ph.D. (Biology), Senior Researcher, Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry SB RAS, e-mail: knev73@yandex.ru
Galina G. Suvorova,
Dr. Sci. (Biology), Leading Researcher, Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry SB RAS, e-mail: galina.g.suvor@gmail.com
Irina V. Ukolova,
Ph.D. (Biology), Senior Researcher, Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry SB RAS, e-mail: irina@sifibr.irk.ru
Anna V. Fedyaeva,
Ph.D. (Biology), Researcher, Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry SB RAS, e-mail: fedyaeva.anna@mail.ru
