CC BY
98УДК 616.316-008.8
МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К СБОРУ И ИССЛЕДОВАНИЮ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ РОТОВОЙ ПОЛОСТИ
В РАМКАХ ПРЕПОДАВАНИЯ ПРОПЕДЕВТИКИ СТОМАТОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЕЗНЕЙ
В. А. Проходная, Е. Х. Чибичян, А. С. Ломова, А. Ю. Косых
Аннотация. Целью статьи явилось отражение методических принципов исследования жидкостей полости рта в рамках преподавания пропедевтики стоматологических болезней. В статье представлена терминологическая база для характеристики биологических жидкостей полости рта, механизм образования слюны, смешанной слюны, ротовой жидкости, десневой жидкости, методические принципы их забора. Дана характеристика функций биологических жидкостей полости рта, их диагностических возможностей. Студенты получают в рамках предмета представление, что использование слюны может быть не только дополнительным методом в клинических исследованиях, но и имеет много преимуществ по сравнению с анализом крови и мочи. Сбор слюны прост и удобен для случаев неклинических окружающих
условий; он безболезненный; риск заражения медперсонала значительно меньше, чем при работе с кровью; содержание некоторых молекул (например, определенных гормонов, антител и лекарств) в слюне отражает их концентрацию в крови. Также слюна может быть источником для изучения ДНК человека и находящихся в организме микробов. Расширение использования слюны в клиническом анализе поможет ускорить переход от диагностики заболеваний к наблюдению за здоровьем. Высоки потенциальные возможности использования слюны с целью выявления стоматологических и системных заболеваний.
Ключевые слова: преподавание, ротовая полость, слюна, десневая жидкость, сбор, исследование.
METHODOLOGICAL APPROACHES OF COLLECTION AND RESEARCH OF BIOLOGICAL LIQUIDS OF THE MOUTH CAVITY WITHIN THE FRAMEWORK OF TEACHING DISORDERS
OF DENTISTRY DISEASES
V. Prokhodnaya, E. Chibichyan, A. Lomova, A. Kosyh
Annotation. The purpose of the article is to reflect the methodological principles of study of oral fluid in the framework of teaching propaedeutics of dental diseases. The article presents the terminological base for the characteristics of biological fluids of the oral cavity, the mechanism of saliva formation, mixed saliva, mouth fluid, gingival fluid, methodological principles of their collection. The characteristics of functions of biological fluids of the oral cavity, their diagnostic capabilities are given. Within the framework of the subject students receive the notion that the use of saliva can be not only an additional method in clinical studies, but also has many advantages over the analysis of blood and urine. Saliva collection
is simple and convenient for cases of non-clinical environmental conditions; it is painless; the risk of infection of the medical staff is much less than when working with blood; the content of some molecules (for example, certain hormones, antibodies and drugs) in saliva reflects their concentration in the blood. Also, saliva can be a source for studying human DNA and microorganisms in the body. The increased use of saliva in clinical analysis will help accelerate the transition from disease diagnosis to health surveillance. The potential for the use of saliva for the detection of dental and systemic diseases is high.
Keywords: teaching, oral cavity, saliva, gingival fluid, collection, research.
Подготовка квалифицированных врачей — стоматологов-ортопедов является важнейшей составной частью системы стоматологической помощи населению, и от подготовки специалистов зависит доступность и качество охраны здоровья [1, 2]. Впервые в 1992 году на конгрессе Европейской стоматологической ассоциации (ERO/FDI), посвященном проблемам развития стоматологической патологии, был актуализирован вопрос о роли слюны и слюнных желез в патогенезе стоматологических заболеваний. Была создана рабочая группа, которая представила информацию обо всех известных к тому времени факторах, касающихся смешанной слюны и опубликованных в International Dental Journal.
Применение ротовой жидкости для диагностики стоматологических и системных заболеваний получило мощный толчок в 2002 году в результате финансиро-
вания программы Национального института стоматологических и черепно-лицевых исследований (NIDCR) Development and Validation Technologies for Saliva Based Diagnostics (Разработка и апробация технологий для диагностики на основе слюны). Целью программы является создание совместных научно-исследовательских групп, включающих в себя инженеров с навыками в области нанотехнологий и микрофлюидных методов и ученых, занимающихся изучением биологии полости рта, для разработки портативных POC (Point-of-Care — диагностика у постели больного) диагностических платформ для быстрого обнаружения и анализа стоматологических биомаркеров [3]. Благодаря возможности получить аналогичную или идентичную информацию из образцов жидкостей, взятых из полости рта, которые легко собрать и которые не требуют инвазивных процедур, отпадает необходимость в заборе крови.
www.akvarel2002.ru
Диагностика по смешанной слюне является динамично развивающимся направлением медицины, которое превратилось в междисциплинарную науку [4]. В связи с вышеуказанным, в практике кафедры стоматологии №1 ФГБОУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России в рамках преподавания пропедевтики стоматологических болезней изучается диагностическая информативность исследования различных биологических жидкостей полости рта. Усовершенствование списка биомаркеров жидкостей полости рта зависит от их стабильности, точности обнаружения (включая чувствительность и воспроизводимость анализов в клинической лаборатории, легкость их выполнения, высокую специфичность для определения заболевания и стадии его развития) и экономической эффективности целостности клинико-диагностических алгоритмов [5].
Целью работы явилось отражение методических принципов исследования жидкостей полости рта в рамках преподавания пропедевтики стоматологических болезней.
На первом этапе студенты получают терминологическое представление о биологических жидкостях полости рта и физиологических механизмах их образования, а также их функциональной значимости для организма. Ротовая жидкость — это продукты секреции слюнных и слизистых желез оболочки полости рта в совокупности с клетками слущенного эпителия, лейкоцитами, микроорганизмами, остатками пищи, а также десневой жидкостью. Слюна — это секрет, полученный непосредственно из протоков слюнных желез. Смешанная слюна — это основное определение для характеристики среды, которой покрыты все поверхности полости рта. На поверхности зубов слюна играет большую роль в формировании приобретенной пелликулы, которая является тонким (0,5—1 нм) слоем некоторых белков слюны со свойствами связывания гидроксида кальция. Приобретенная пелликула играет основную роль для «защиты организма поверхностями» и в физико-химической защите поверхности зубов. Также приобретенная пелликула важна для бактериальной адгезии и колонизации поверхности зубов, что может, помимо прочего, вести к развитию кариеса и воспалению тканей периодонта (особенно в отсутствие надлежащей гигиены полости рта). Кроме защиты поверхности зубов, слюна играет важную роль как для физико-химической, так и для иммунной защиты слизистой полости рта и слизистой начальных отделов желудочно-кишечного тракта (путем непосредственной антимикробной активности и агглютинации микроорганизмов). Десневая жидкость — это транссудат сыворотки крови в десне-вом желобке; включает в себя лейкоциты, слущенные эпителиальные клетки, микроорганизмы, электролиты, белковые компоненты, ферменты. Является основным поставщиком лейкоцитов в ротовую жидкость.
Из всех перечисленных сред десневая жидкость по химическому составу в большей мере отражает состав плазмы крови. В норме десневая жидкость вырабатывается в незначительных количествах. В течение
суток в полость рта поступает 0,5—2,4 мл десневой жидкости. Однако на стадии клинических изменений, например, при воспалительных заболеваниях пародон-та, ее объем резко увеличивается вследствие нарастания внутритканевого (интерстициального) давления, разности уровня осмотического градиента и повышения проницаемости сосудов собственной пластинки. Появление десневой жидкости связано с морфологией сосудов собственной пластинки и особенностями эпителия зубодесневого прикрепления. Собственная пластинка слизистой оболочки, подстилающая соединительный эпителий, состоит из рыхлой волокнистой соединительной ткани, в которой отсутствует сосочко-вый слой, поэтому граница между эпителием и соединительной тканью ровная. Вследствие этого сосуды ми-кроциркуляторного русла находятся непосредственно под эпителиальной выстилкой зубодесневой борозды и ориентированы по плоскости. Наличие фибрилл в эн-дотелиоцитах указывает на значительную по объему функцию обмена между кровью и перикапиллярной зоной. Посткапиллярные и мелкие венулы с высоким эндотелием более предрасположены к проницаемости и являются основным поставщиком иммунных клеток. Эпителий прикрепления выстилает дно десневой борозды и имеет ряд структурно-функциональных особенностей. Он тоньше, чем эпителий десны, и не оро-говевает. В области шейки зуба эпителий представлен одним слоем базальных и 1—2 слоями супрабальных кубических и ветеренообразных, уплощенных по форме, клеток, расположенных параллельно поверхности зуба, плотно прикрепленных к эмали. Соединительный эпителий относят к малодифференцированным клеткам с большими межклеточными промежутками, имеющими свойство расширяться, что наряду с малым количеством десмосом способствует беспрепятственному поступлению интерстициальной жидкости и выпота плазмы крови, клеток, антибактериальных веществ из кровеносных сосудов собственной пластинки в дес-невую борозду. Наряду с этим осуществляется массивное поступление антигенов в ткани внутренней среды из слюны и поверхности слизистой оболочки, что необходимо для адекватной стимуляции функций иммунной системы. Некоторые вещества могут накапливаться в десне в больших концентрациях.
Таким образом, студентам аргументируется постулат, что жидкости полости рта — это уникальная среда, хорошо приспособленная к постоянному присутствию бактерий и их продуктов. Их защитная функция обусловлена не только механическим смыванием, но и активностью антимикробных механизмов клеток, непрерывно мигрирующих из сосудов собственной пластинки и отвечающих за специфическую защиту. Десневая жидкость занимает особое положение ввиду наибольшего сходства по составу с кровью. Исследование биологических жидкостей полости рта адекватно отражает интенсивность воспалительных процессов при кариесе зубов либо при воспалительных заболеваниях пародонта.
Студенты получают подробные сведения о методиках забора биологических жидкостей полости
рта. Взятие образцов ротовой жидкости у пациентов осуществляют в утренние часы (с 8 до 9 часов) натощак или не ранее чем через 1,5—2 часа после приема пищи. Забор смешанной слюны проводят без стимуляции в течение 5 минут путем сплевывания в стерильную стеклянную пробирку. Объем ротовой жидкости для исследования составляет 20 мл и более. Пробирку центрифугируют в течение 15 минут при 8000 об./мин. и отделяют надосадочную жидкость (супернатант). Образцы слюны стабильны, могут храниться 7 дней при комнатной температуре, 4 недели при 2—8°С и длительный период — при -20°С. Такая высокая стабильность делает возможной пересылку образцов слюны обычной почтой.
Десневую жидкость из десневой борозды собирают по методу Н. А. Чукаевой (1990). Первоначально обследуемый участок очищают от налета и высушивают ватными тампонами. Для забора десневой жидкости используют шприц-тюбик, герметично соединенный с иглой, зашлифованной и закругленной на конце. В шприц набирают 0,1 мл раствора Хенкса. Закругленную иглу с осторожностью, чтобы не повредить десну и не допустить кровотечения, вводят в десневую борозду, выпускают каплю раствора Хенкса, после чего иглу прижимают к десневой стенке борозды или пародон-тального кармана. Далее, проводя иглой вдоль стенки, аспирируют в шприц-тюбик содержимое. Полученную жидкость вносят в пробирку типа Эппендорф 2,0 мл с предварительно набранным раствором Хенкса в объеме 0,3 мл. Десневую жидкость забирают в области 3—4 зубов.
Десневую жидкость либо экссудат пародонтального кармана можно отбирать вторым способом с помощью бумажных эндодонтических штифтов стандартного размера (№30). Объем десневой жидкости определяют по разнице весов бумажного штифта до и после пропитывания по О. А. Ганковской. Эндодонтические бумажные штифты, пропитанные десневой жидкостью, помещают в стерильную пластиковую пробирку типа Эппендорф, содержащую 0,5 мл физиологического раствора, перемешивают на вортексе в течение 10 минут, затем центрифугируют в течение 10 минут при 4°С при 1500 об./мин. Супернатант переносят в полипропиленовые пробирки. Выделенные образцы можно хранить при -20°С или сразу использовать в постановке реакции. Перед постановкой реакции образцы выдерживают при комнатной температуре (18—25°С), аккуратно перемешивают, избегая пенообразования, и разводят в 2000 раз.
Для проведения микробиологических исследований в десневой жидкости методический алгоритм несколько изменяется. Для сбора десневой жидкости используют стандартный стерильный бумажный эндодонтический штифт (файл №30), который помещают в десневую борозду на 30 секунд для сорбции жидкой части, а затем переносят в пробирку типа Эппендорф с 0,5 мл полужидкой транспортной среды Эймса или Стюарта. Транспортировку проводят в специальных термоконтейнерах при температуре не выше -4°С в течение 12 часов.
Для количественного 4-секторного посева используют методику по Мельникову — Цареву на 5%-ном кровяном гемин-агаре (5 мкг/мл гемина, 0,1 мкг/мл менадиона).
Разработана специальная система для сбора слюны Salivette Sarstedt в домашних условиях. Слюна легко собирается при пережевывании хлопкового тампона. Образец слюны получают после помещения тампона в пробирку и центрифугирования. Полученная прозрачная жидкость может использоваться для различных исследований.
При хранении жидкостей полости рта важны некоторые преаналитические аспекты. Важно использовать такую систему, которая не разрушала бы исследуемый в слюне аналит и не изменяла бы его концентрацию. В отличие от сыворотки или плазмы уровень определяемого вещества в слюне или десневой жидкости очень низкий, поэтому его взаимодействие с поверхностью собирающей емкости намного более вероятно. Анали-ты могут абсорбироваться пластмассами. Лучшим материалом для пробирок является полипропилен, хотя его абсорбционные свойства сильно зависят от чистоты сырья. В настоящее время пробирки для сбора ротовой или десневой жидкости изготавливаются из сверхчистого полипропилена с абсорбирующей характеристикой ниже 5%. Ротовую жидкость рекомендуют собирать через полипропиленовую соломинку. Из-за непродолжительного времени взаимодействия смешанной слюны с поверхностью соломинки влияние на исследуемый аналит незначительно.
Нормальным уровнем выделения смешанной слюны принято считать 0,5 и более мл/мин. Слюна осуществляет многочисленные функции в защите и поддержании целостности слизистой оболочки полости рта, а именно: принимает участие в очищении полости рта от остатков пищи, налета и бактерий; благодаря буферным свойствам нейтрализует отрицательное действие сильных кислот и щелочей в пределах емкости буфера; обеспечивает поступление ионов, необходимых для ремине-рализации зубов; обладает противобактериальными, противогрибковыми и противовирусными свойствами.
Минерализующая функция слюнных желез — одна из основных функций этого органа. Слюна обеспечивает минерализацию зубов после их прорезывания и поддерживает оптимальный состав при функционировании. В основе минерализующей функции слюны лежат механизмы, препятствующие выходу из эмали составляющих ее компонентов и способствующие поступлению таких компонентов из слюны в эмаль. Эти механизмы и обеспечивают состояние динамического равновесия состава эмали и окружающей ее биологической жидкости, которая поддерживается на необходимом уровне благодаря равнодействию двух процессов — растворения кристаллов гидроксиапатита эмали и их образования. В свою очередь, гидроксиапатит является основным твердым соединением кальция и фосфора, находящимся в организме при физиологических условиях. При оценке минерализации и деминерализации эмали зубов большое значение имеет концентрация кальция и фосфора, рН и ионная сила слюны.
www.akvarel2002.ru
Составные вещества слюны делятся на 3 класса:
• высокомолекулярные органические соединения;
• низкомолекулярные органические вещества;
• электролиты.
К высокомолекулярным соединениям относятся амилазы, белки, богатые пролином и тирозином, связывающие белки, липиды, витамины, фосфаты, фториды, иммуноглобулины, калликреин, карбогидразы, лактоферрин лактадегидрогеназа, лизоцим, фосфа-тазы, эстеразы и др.; к низкомолекулярным — азотистые вещества, глюкоза, креатинин, мочевина, перок-сидазы, рибонуклеазы и др. Электролитами являются аммиак, бикарбонат, калий, кальций, магний, натрий и др.
При изучении химического состава биологических жидкостей полости рта останавливаются на роли белков для мукозального иммунитета. При этом рассматриваются основные классы антител слюны с наибольшим вниманием к секреторным антителам, антимикробные пептиды и белки, дается понятие о секреторном компоненте полимерного иммуноглобули-нового рецептора, разбираются основы фагоцитоза, антигенного представления, продукция цитокинов, защитные белки врожденного иммунитета — лакто-феррин, дефензины, кателицидины, шаперокины, адреномедуллин, гистатины, секреторный ингибитор лейкоцитарной протеиназы, цистатины, а также муцины слюны.
Многие молекулы, полученные из ротовой или десне-вой жидкости, используются в качестве диагностических биомаркеров заболеваний полости рта, включая состояния, вызванные грибами, вирусами папилломы человека, вирусом Эпштейна — Барр, цитомегаловиру-сом и бактериями (несколько видов, участвующих в заболеваниях пародонта и кариесе зубов).
Последние достижения в диагностике при помощи ротовой и десневой жидкости были вызваны новыми молекулярными подходами (протеомики, геномики и транскриптомики) и метагеномными анализами. Про-теомный анализ подразумевает идентификацию белковых молекул с высокой эффективностью при низкой себестоимости исследования при масс-спектрометрии. Масс-спектрометрия — метод идентификации молекул путем измерения отношения их массы к заряду
(m/z) в ионизированном состоянии. MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption's Ionization) — ионизация вещества с помощью матрицы и лазерного излучения. TOF MS (Time Of Flight Mass-Spectrometry) — время-пролетная масс-спектрометрия. Масса молекулы оценивается по времени пролета от источника ионизации до детектора [6]. Сравнение масс-спектра с данными, содержащимися в базе данных, приводит к высококачественной идентификации белков. Данные по протео-мике слюны накапливаются в базе (http://bioinformatics. ua.pt/OralCard/ и http://www.hspp.ucla.edu/), способствуя качественному анализу слюны. Установленные белковые паттерны могут использоваться как в диагностических целях, так и для прогноза течения заболевания. Полученный спектр представляет собой набор пиков, отражающих наиболее представленные белки в микроорганизме и является уникальным для данного организма.
Итак, студенты в рамках преподавания пропедевтики стоматологических болезней получают полное представление, что биологическая среда полости рта представляет собой уникальную субстанцию, имеющую большие потенциальные возможности для использования в фундаментальных исследованиях и в медицинской диагностике. Преподавателем четко характеризуются перспективы анализа ротовой и десневой жидкости в диагностических целях. Это обусловлено целым рядом причин. Так, использование слюны может быть не только дополнительным методом в клинических исследованиях, но и имеет много преимуществ по сравнению с анализом крови и мочи: сбор слюны прост и удобен для случаев неклинических окружающих условий; он безболезненный; риск заражения медперсонала значительно меньше, чем при работе с кровью; содержание некоторых молекул (например, определенных гормонов, антител и лекарств) в слюне отражает их концентрацию в крови. Также слюна может быть источником для изучения ДНК человека и находящихся в организме микробов. Расширение использования слюны в клиническом анализе поможет ускорить переход от диагностики заболеваний к наблюдению за здоровьем. Высоки потенциальные возможности для использования слюны с целью выявления стоматологических и системных заболеваний.
ЛИТЕРАТУРА
1. Еричев В. В. и др. Процесс формирования мануальных навыков студентов стоматологического факультета на кафедре ортопедической стоматологии ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России // Международный журнал экспериментального образования. — 2014. — №10. — С. 129—131.
2. Лапина Н. В. и др. Модернизация системы подготовки врачей стоматологов-ортопедов на кафедре ортопедической стоматологии ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. — 2014. — №4—1. — С. 199—201.
3. Николенко В. Н. и др. Диагностическая значимость исследования ротовой жидкости в онкологии // Опухоли головы и шеи. — 2013. — №1. — С. 39—42.
4. Malamud D. Saliva as a diagnostic fluid // Dent. Clin. North. Am. — 2011. — Vol. 55. — №1. — P. 159—178.
5. Лихорад Е. В. и др. Слюна: значение для органов и тканей в полости рта в норме и при патологии // Медицинский журнал. — 2013. — №3. — С. 7—11.
АВТОРСКАЯ СПРАВКА
государственный медицинский университет» Минздрава России,
г. Ростов-на-Дону (РостГМУ), e-mail:
ФГБОУ ВО «Ростовский ms.victoria111@mail.ru
Проходная Виктория Александровна — доктор медицинских наук, профессор кафедры стоматологии №1 РостГМУ; Чибичян Елена Христофоровна — аспирант кафедры стоматологии №1 РостГМУ;
Ломова Анастасия Сергеевна — кандидат медицинских наук, ассистент кафедры стоматологии №1 РостГМУ; Косых Артем Юрьевич — аспирант кафедры стоматологии №1 РостГМУ.
