CC BY
40
© Т.Н. Варсегова, 2006
Методические особенности гистоморфометрии и стереологического анализа периферических нервов в экспериментальных исследованиях1
Т.Н. Варсегова
The technique-related peculiarities of histomorphometry and stereologic analysis of peripheral nerves in experimental studies
T.N. Varsegova
Федеральное государственное учреждение науки «Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" им. академика Г. А. Илизарова Росздрава», г. Курган (генеральный директор — заслуженный деятель науки РФ, член-корреспондент РАМН, д.м.н., профессор В.И. Шевцов)
Морфологическое описание берцовых нервов в условиях дистракционного остеосинтеза являлось предметом специальных исследований [1-4]. По мере разработки новых методик остеосинтеза возрастает интерес к изучению количественных характеристик периферических нервов, объективно отражающих полноту их мор-
фологического восстановления после повреждений [9, 14, 16], а также направленность и временные параметры изменений их морфофунк-ционального состояния в различных условиях эксперимента. Соответственно целесообразна и разработка адекватной технологии количественного исследования периферических нервов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эксперименты проведены на 23 взрослых беспородных собаках, которым после закрытой флек-сионной остеоклазии берцовых костей удлиняли голени аппаратом Илизарова с автоматическим приводом в течение 28 дней с суточным темпом 1 мм за 60 приемов (I серия) и в течение 10 дней с суточным темпом 3 мм за 180 приемов (II серия). Все эксперименты (содержание собак, хирургические вмешательства, эвтаназия) проведены в соответствии с нормативными документами (Приказ МЗ СССР № 755, 1977 г.). Животных выводили из опыта в конце дистракции (I серия п=7, II серия п=3), через 30 дней фиксации (I серия п=3, II серия п=3) и через месяц после снятия аппарата (I серия п=4, II серия п=3). Учитывая различную скорость деструкции тканей, забор и фиксацию большебер-цовых нервов (ББН) осуществляли в первую очередь, так как аутолитические изменения в них наступают сразу после гибели животного. После эвтаназии ББН оперированных и контралатераль-ных конечностей на уровне средней трети голени закрепляли на твердой основе с целью избежания деформации и резецировали для морфологического исследования, отступая на 2 см дистальнее и проксимальнее от основы.
Нервные стволы обладают ярко выраженной анизоморфностью, так как нервные пучки и волокна в них располагаются вдоль длинной оси. Таким образом, для получения репрезентативных выборок изображений с максимально возможным количеством анализируемых структур для
1 Научный руководитель работы д.м.н. М.М. Щудло.
морфометрического исследования использовали продольные либо поперечные патогистологиче-ские препараты (срезы). С целью визуализации интересующих структур и химических веществ в изучаемых объектах подобраны адекватные гистологические и гистохимические методики.
Для комплексного исследования периферических нервов на разных морфологических уровнях (органном, тканевом и клеточном) использовали срезы, толщина которых составляет примерно 1/20 диаметра изучаемых структур. При этом возникающий в результате затенения светлоокрашенных структур темноокрашенными эффект Холмса, вносящий систематическую ошибку при морфометрии, сводится к минимуму [11].
Проксимальные и дистальные фрагменты ББН отсекали, делили на столбики, размещали вертикально на заранее промаркированных фильтровальных бумажках и помещали в жидкий азот. На микротоме-криостате МК-25 ТУ 64-1-856-78 при t = -18 °С готовили тотальные поперечные срезы толщиной 7-10 мкм, монтировали на предметные стекла. С целью визуализации периневрия, кальций-кобальтовым методом [7] выявляли активность миозиновой АТФ-азы (рис. 1), являющейся маркером клеток с подвижной цитолеммой (в данном случае периневральных). Такие патогистологиче-ские препараты использовали для количественной оценки реакции нервных стволов на дозированное растяжение. С этой целью, используя большой исследовательский фотомикроскоп "Opton" (Германия) c аппаратно-программным комплексом 'ТО-aMoфh" (Москва), оцифровывали изображения
тотальных срезов, в них, используя программу "MEDIAS" ("DiaMorph", Россия), измеряли общую площадь поперечного сечения нерва (An), суммарную площадь пучков нервных волокон вместе с окружающим их периневрием (Af.pn).
Рис. 1. Большеберцовый нерв собаки. Поперечный тотальный криостатный срез. Реакция на миозино-вую АТФ-азу. Лупа 10х. П - периневрий; С - сосуды эпиневрия
Материал, закрепленный на твердой основе фиксировали в смеси 2 % растворов глутарового и параформальдегидов на фосфатном буфере (рН 7,4) и делили на столбики. Часть из них отмывали в проточной воде, на микротоме-криостате готовили продольные и поперечные срезы толщиной 25 мкм, монтировали на предметные стекла и им-прегнировали азотнокислым серебром по пунктам 6-10 методики А.К. Коломийцева с соавт [5]. Продольные срезы использовали для оценки изменения извитости нервных волокон, длин интерно-дальных сегментов, состояния насечек Шмидта-Лантермана и перехватов Ранвье.
Часть столбиков по специально разработанной автором методике заливали в аралдит. Возможности использования полутонких эпоксидных срезов (ПТС) ограничивала их малая стандартная площадь - до 1 мм2, затруднявшая получение репрезентативных выборок изображений для стереологических исследований. Чтобы преодолеть указанное противоречие, был разработан, апробирован и внедрен в повседневную практику ряд технических приемов, позволяющих увеличить площадь одномикронных полутонких срезов до 4-8 мм2: 1) применение специального режима проводки материала (увеличение сроков экспозиции и дополнительная пропитка в смоле с катализатором при комнатной температуре); 2) площадь основания пирамидки при ее высоте до 1,0 мм должна быть как минимум в 4 раза больше площади среза, что позволяет избежать вибрации блока и образования механических дефектов на срезах при ультрато-мировании; 3) тщательный контроль качества и отбор стеклянных ножей, либо использование
алмазного ножа с достаточной длиной режущей кромки; 4) фиксация срезов к предметному стеклу, предварительно покрытому тонкой целлоидиновой пленкой, для предотвращения появления при окраске неровностей и складок из-за различных биомеханических свойств тканевых составляющих исследуемых объектов [12].
Для количественного исследования внутри-ствольных составляющих использовали ПТС, окрашенные метиленовым синим и основным фуксином по Уикли [8], позволяющие работать на больших увеличениях (объективы 40, 100х). Оцифрованные изображения полутонких срезов (б) и электронограмм (а) периферических нервов сопоставимы (рис. 2), что дало возможность идентифицировать и исследовать на светооптическом уровне эндоневрий, безмиелиновые и миелиновые нервные волокна (МНВ) - диаметры 1-20 мкм.
t
Рис. 2. Большеберцовый нерв собаки. Аралдит, поперечный ультратонкий (а, электронограмма, ЮООх) и полугонкий (б, окраска по Уикли, об. - 100; ок. - 12,5х) срезы. Э - эндоневрий, М - мякотные, стрелки - без-мякотные нервные волокна, Я - ядро шванновской клетки в составе мякотного нервного волокна; двойная и тройная стрелки - безмякотные нервные волокна, срезанные на уровне ядра нейролеммоцита
С помощью тестовой решетки равноудаленных точек [13] в программе Adobe Photoshop 3,0 рассчитывали стереологические параметры: относительный объем нервных волокон и эндонев-рия, численные плотности МНВ (NAmnf), их реактивно-деструктивно измененных форм и долю (%) последних в общем объёме выборки. В программе РhоtоFinish измеряли средние диаметры МНВ (Dmnf), строили прецизионные гистограммы их распределения с шагом 1 мкм. С целью исследования ББН как канала передачи информации определяли энтропию по Шеннону, относительную энтропию, избыточность и организацию [6].
Контролем послужили ББН 3 интактных беспородных собак. Достоверность различий определяли в программе «AtteStat» (версия 1,0; И.П. Гайдышев, 2003) по критериям рандомизации и Вилкоксона для независимых выборок.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты исследования показали, что в обеих сериях ББН на стороне удлинения макроскопически не обнаруживали признаков травма-тизации. Ни на одном из сроков эксперимента общие площади поперечных сечений ББН на стороне удлинения на уровне дистракционного регенерата достоверно не увеличивались относительно аналогичных контралатеральных нервов, а суммарная площадь пучков волокон, включая периневрий, достоверно повышалась только во II серии (табл. 1) через 10 дней дист-ракции в ускоренном тепе (3 мм в сутки).
По окончании дистракции в проводниковой части нервов удлиненных конечностей обнаружили единичные, преимущественно крупные проводники с признаками реактивно-деструктивных
изменений, составившие в среднем 2,4 % в I и 2,6 % во II сериях (табл. 2).
Такие волокна встречаются и в интактных нервах, а незначительное повышение их количества, по мнению авторов, может быть связано с элиминацией нефункциональных в новых морфофизио-логических условиях удлиненной конечности, преимущественно наиболее чувствительных мие-линовых нервных волокон большого калибра, что согласуется с литературными данными [15].
Большинство же мякотных волокон (рис. 3, А) имело нормальную структуру. На последующих этапах эксперимента измененные волока также единичны (рис. 3, Б) в обеих сериях, и доля их сопоставима с контрольными значениями.
Таблица 1
Общая площадь поперечного среза нервного ствола (Ап) и суммарная площадь пучков нервных волокон с периневрием (А&рп) на этапах эксперимента (М+т)
Сроки (серия) эксперимента Ап (103мкм2) АГ-рп (103мкм2)
Опытная Контралатер. Опытная Контралатер.
Д28(1) 2311,6+279,5 1958,0+288,4 705,5+46,3 784,8+26,6
Ф30(1) 3563,7+766,4 2650,3+344,8 868,2+135,7 903,3+90,3
БА30(1) 2248,1+311,6 2029,1+221,0 820,8+64,9 778,7+58,2
Д10(П) 2322,2+203,1 2234,7+385,1 917,0+64,7* 718,5+23,9
Ф30(П) 2194,4+396,6 2348,1+193,4 654,1+35,5 665,1+33,0
БА30(П) 1765,3+588,7 1738,0+530,9 698,8+1,23 665,9+4,1
■ различия между опытной и контралатеральной конечностями достоверны по критерию рандомизации при p < 0,05.
Таблица 2
Доли измененных мякотных нервных волокон в контроле и на этапах экспериментов
Сроки эксперимента Конец дистракции Фиксация 30 дней (Ф-30) Без аппарата 30 дней (БА-30)
I серия (Д28) 2,37±0,74 % 0,54±0,18 % 0,85±0,13 %
II серия (Д-10)2,61±0,11 % 1,43±0,12 % 1,61±0,12 %
Контроль до 1,52 %
Рис. 3. Поперечные полутонкие срезы болыпеберцовых нервов, II серия, окраска по Уикли. А — дистракция 10 дней. Об,-40, ок.- 12,5х; Б - фиксация 30 дней. Об,- 100 МИ; ок.- 12,5х; на стрелке - деструктивно измененное миелиновое волокно
Относительный объем волокон в I серии через 28 дней дистракции понижается в 1,4 раза по сравнению с контрольными значениями (рис. 4). Через 30 дней фиксации конечности в аппарате доля нервных волокон возрастает на 25,5 % по сравнению с предыдущим сроком, но остается достоверно пониженной (в 1,1 раза) относительно нормы. В конце эксперимента достоверные различия по этому параметру отсутствуют.
Во II серии в конце дистракции относительный объем эндоневрия оперированных конечностей повышается в 1,1 раза по сравнению с ин-тактными значениями (рис. 4). Через 30 дней фиксации в аппарате этот параметр продолжает увеличиваться - соответственно объемная плотность нейральных элементов понижается в среднем на 10,1 % по сравнению с контролем. В конце эксперимента относительный объем нервных волокон повышается на 5,7 % относительно предыдущего срока - наблюдается тенденция восстановления объемных отношений внутрипучко-вых элементов большеберцового нерва.
Рис. 4. Объемные плотности нервных волокон и эн-доневрия ББН в контроле (1) и на этапах удлинения в сериях I (А) и II (Б): 2 - конец дистракции, 3 - конец фиксации, 4 - без аппарата 30 дней
В I серии по окончании дистракции наряду с сохранившимися нервными проводниками в большеберцовом нерве удлиненной конечности обнаруживаются миелинизирующиеся аксоны с очень тонкой, чётко окрашенной миелиновой оболочкой. При этом численная плотность мя-котных нервных волокон на 12 % превышает контрольные значения (рис. 5). На этапе фиксации МЛтпг остается повышенной, но через 30 дней после снятия аппарата достоверные различия по этому параметру отсутствуют.
Во II серии к концу дистракции численная плотность миелиновых нервных волокон боль-шеберцового нерва удлиненной конечности достоверно снижена на 20 % относительно контроля (рис. 5). Однако это нельзя рассматривать как свидетельство потери численности нервных проводников, поскольку в это время возрастают суммарная площадь пучков нервных волокон и объёмная доля эндоневрия в результате нарушения циркуляции эндоневральной жидкости. На этапе фиксации этот параметр достоверно
превышает интактные значения в 1,1 раза, что, по мнению автора, связано с процессами регенерации и спраутинга: именно в это время в полутонких срезах обнаруживаются миелинизи-рующиеся аксоны малого диаметра. После снятия аппарата нормализуется.
^ < I серия —»—II серия-Контроль
Конец Фиксация Без аппарата
дистракции 30 дней 30 дней
Рис. 5. Изменение численной плотности миелино-вых нервных волокон ББН в контроле и на этапах удлинения голени собак автодистракторами в различных режимах: *** - различия между опытом и контролем достоверны по критерию Вилкоксона при р<0,001
Такие колебания численной плотности МНВ отражают процессы новообразования волокон (в I серии преимущественно на этапе дистракции, во II серии - фиксации) и элиминации избыточных [10] и функционально «изношенных» нервных проводников на последующих этапах эксперимента.
Рассмотрим, как меняется распределение мякотных волокон по диаметру. В интактном большеберцовом нерве взрослых беспородных собак мякотные волокна имели диаметры от 2 до 17 мкм с бимодальным характером гистограммы распределения.
В конце дистракции в обеих экспериментах бимодальность сохранялась, моды находились в тех же диапазонах, что и в интактном материале (рис. 6). Однако в I серии, по сравнению с контролем, гистограмма смещена влево на 1 разряд: исчезли волокна с Б>16,0 мкм и появилась фракция волокон диаметром менее 2,0 мкм. Средний диаметр волокон уменьшился и варьировал от 6,13 до 6,40 мкм (контроль 6,47-7,10). Во II серии в конце дистракции (рис. 6) гистограмма была укорочена справа на 3 разряда (волокна диаметром более 14,1 мкм отсутствовали), однако Отп? варьировал от 7,07 до 8,39 мкм.
Через 30 дней фиксации в аппарате в I серии левая граница гистограммы восстанавливалась, Бтп£ возрастал до 6,95 мкм, но отсутствовали волокна диаметром более 15,-17,0 мкм (рис. 6). Через 30 дней после снятия аппарата популяция МНВ проявляет тенденцию к восстановлению: появляется фракция волокон диаметром 15,116,0 мкм. БтпГ превышал контрольные значения и варьировал от 7,21 до 7,30 мкм.
Рис. 6. Распределение по диаметрам миелиновых нервных волокон ББН интактных и опытных животных на этапах эксперимента: I серия (вверху) Д-28, Ф-30 и БА-30; II серия (внизу) Д-10, Ф-30 и БА-30
Во II серии через 30 дней фиксации гистограмма была укорочена справа уже на 4 разряда относительно контроля (рис. 6), так как отсутствовали волокна диаметром более 13,1 мкм. В то же время гистограмма смещалась влево: появлялась фракция волокон диаметром менее 2,0 мкм. При этом Dmrlf уменьшался и варьировал от 6,23 до 6,91 мкм. Через 30 дней после снятия аппарата левая граница гистограммы восстанавливалась, правая проявляла тенденцию к восстановлению: вновь появлялась отсутствовавшая на предыдущем сроке фракция волокон диаметром 13,1-14,0 мкм. Dmnf варьировал от 5,91 до 7,26 мкм.
Уменьшение Dmnf было явлением временным: на этапах фиксации и после снятия аппарата происходила их структурная адаптация. Такое временное истончение нервных волокон, по мнению автора, связано с их упругой деформацией растяжения при удлинении голени. Последующее восстановление размерных параметров укладывается в известную [2, 4] концепцию об интеркалярном росте упруго напряженных тканевых структур за счет активизации биосинтетических процессов в клетках.
По данным информационного анализа, на
всех сроках эксперимента в обеих сериях энтропия по Шеннону и относительная энтропия не отличались от контрольных значений, что свидетельствовало о сохранении упорядоченности большеберцового нерва как органа в условиях данных экспериментов. При этом в I серии в конце дистракции возрастали по сравнению с контролем избыточность и организация, снижаясь на этапе фиксации и возвращаясь к норме после снятия аппарата. Во II серии значения избыточности и организации были понижены на всех сроках эксперимента. Уменьшение избыточности свидетельствует о появлении помех и снижении надежности передачи информации по нерву, а ее возрастание - о том, что нерв как система становится более лабильным и менее экономичным [6].
Таким образом, результаты исследования большеберцовых нервов на разных этапах эксперимента показали, что при разных режимах удлинения реакция нервов на растяжение была однотипна. В I первой серии отклонение мор-фометрических и стереологических параметров от интактных значений наиболее выражено по окончании дистракции и к концу эксперимента
достоверные различия отсутствуют: происходит структурно-функциональная адаптация нейронов к увеличению длины конечности. Во II серии удлинение производилось в течение короткого промежутка времени (10 дней), поэтому пластические перестройки большеберцового нерва наиболее выражены на этапе фиксации и
не завершаются к концу эксперимента. Существенно то, что при разных режимах удлинения голени доля миелиновых нервных волокон с признаками реактивно-деструктивных изменений превышала интактные значения только в конце дистракции.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Разработанная технология количественного исследования объективно отражает полноту восстановления периферических нервов, от ко-
торой зависит и морфофункциональное состояние удлиняемой конечности в различных условиях дистракционного остеосинтеза.
ЛИТЕРАТУРА
1. Илизаров, Г. А. Изменения нервных стволов голени при удлинении у собак / Г. А. Илизаров, А. А. Шрейнер, А. Б. Кузнецова // Фрагмент итогового отчета по теме 061 основного плана НИР : Влияние темпа и ритма дистракции на остеогенез у собак. -Курган, 1982. № гос. per. 7803753. Инв. № ВНТИ Центра 0283.0080251.
2. Рекапитуляция признаков онтогенетического роста в оболочках нервных стволов при экспериментальном удлинении конечности у взрослых собак / Г. А.Илизаров, М. М. Щудло, А. Б. Кузнецова, А. А. Шрейнер // Проблемы чрескостного остеосинтеза в ортопедии и травматологии. Закономерности регенерации и роста тканей под влиянием напряжения растяжения : сб. науч. тр. КНИИЭКОТ. - Курган, 1982. - Вып. 8. - С. 72-79.
3. Илизаров, Г. А. Изменения нервов голени при её удлинении в эксперименте / Г. А. Илизаров, М. М. Щудло // Лечение ортопе-до-травматологических больных в стационаре и поликлинике методом чрескостного остеосинтеза, разработанным в КНИИЭКОТ : Тез. докл. Всесоюз. науч.-практ. конф. - Курган, 1982. - Ч.2. - С. 198 - 201.
4. Карымов, Н. Р. Изменения нервов удлиняемого сегмента конечности при разной дробности дистракции (морфофункциональ-ное исследование) : автореф. дис... канд. мед. наук. / Н. Р. Карымов. - Пермь, 1995. - 24 с.
5. Коломийцев, А. К. Быстрый метод импрегнации азотнокислым серебром элементов периферической нервной системы, пригодный для целлоидиновых и парафиновых срезов / А. К. Коломийцев, Ю. Б. Чайковский, Т. Л. Терещенко // Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. - 1981. - Т. LXXXI, № 8. - С. 93-96.
6. Леонтюк, А. С. И. Информационный анализ в морфологических исследованиях / А. С. Леонтюк, Л. А. Леонтюк, А. И. Сыкало. - Минск : Наука и техника, 1981. - 159 с.
7. Лойда, З. Гистохимия ферментов: лабораторные методы / З. Лойда, Р. Госсрау, Е. Шиблер. - М. : Мир, 1982. - 230 с.
8. Уикли, Б. Электронная микроскопия для начинающих / Б. Уикли. - М. : Мир. - 1975. - 325 с.
9. Уткин, В. А. Оценка разных способов восстановления поврежденного нерва по проявлениям денервационного синдрома / В. А. Уткин, Н. А. Щудло, М. М. Щудло // Гений ортопедии. - 1996. - № 4. - С. 20-24.
10. Чайковский, Ю. Б. Регенерационная неврома / Ю. Б. Чайковский // Морфология. - 1999. - Т. 15, №»1. - С. 55-67.
11. Проблема эффекта Холмса в количественной телепатологии (метод. аспекты) / М. М Щудло и др. - Известия Челябинского научного центра. - 2003. - Вып. 1, N° 18. - С. 1-5. http://www.sci.urc.ac.ru/news/2003
12. Щудло, М. М. Целлоидинирование полутонких срезов большой площади для предупреждения образования складок при окраске / М. М. Щудло // Архив патологии. - М. : Медицина. - 1982. - № 11. - С. 66-67.
13. Щудло, М. М. Количественный анализ метахромазии суставного хряща в телепатологии / М. М. Щудло, Т. А. Ступина, Н. А. Щудло // Известия Челябинского научного центра. - 2004. - Спец. вып. к 60-летию РАМН. - С. 17-22. http://csc.ac.ru/news/2004_special/04.zip
14. Индекс невротизации и параметры мякотных волокон в пересеченном и регенерирующем нерве после плазматического склеивания торцов его отрезков и микрохирургического анастомозирования / Н. А. Щудло, М. М. Щудло, И. В. Борисова, И. А. Ме-щерягина // Известия Челябинского научного центра - 2001. - Вып. 13, № 4. - С. 82-87.
15. Asbury, A. K. Peripheral nerve disorders: a practical approach / A. K. Asbury, R. W. Gilliat. - London ; Boston : Butterworths, 1984. -339 p.
16. Stoll, G. Symposium: peripheral neuropathies nerve injury, axonal degeneration and neural regeneration: basic insights / G. Stoll, H. W. Muller // Brain Pathology. - 1999. - Vol. 9. - P. 313-325.Рукопись поступила 15.02.06.
