CC BY
12SSjmSS 18-20 октября 2022 г.
Метод высокочувствительной детекции внеклеточных везикул на основе магнитных наномаркеров, разработанный с помощью визуализирующей проточной
цитометрии
12 1 Скирда А.М. ' , Орлов А.В. ,
12 1 Новичихин Д.О. ' , Брагина В.А.
1- Федеральный исследовательский центр «Институт общей физики им. А.М. Прохорова Российской академии наук», Москва 2- Национальный исследовательский ядерный университет «МИФИ», Москва.
Е-mail: artemskirda@,mail. ru
DOI: 10.24412/cl-35673-2022-1-147-149
В основе диагностики широкого спектра социально-значимых заболеваний лежат неинвазивные и малоинвазивные методы, позволяющие судить о состоянии пациента по наличию или отсутствию определенных маркеров в анализируемых биологических образцах. В настоящее время одной из наиболее интенсивно развивающихся областей является «жидкая биопсия» — новый подход, основанный на определении концентраций молекулярных биомаркеров в различных биологических жидкостях (плазме, сыворотке крови, моче и т.д.). Особый интерес представляют мембранные рецепторные белки, присутствующие на поверхности внеклеточных везикул. Обнаружение данных белковых маркеров выше определенных пороговых значений может свидетельствовать о развитии онкологических заболеваний [1], возрастных изменениях организма [2] или структурных изменениях в сердечно-сосудистой системе [3].
В данной работе был разработан комплекс подходов на основе оптических и магнитных методов, позволяющих проводить высокочувствительную детекцию внеклеточных везикул с применением магнитных наночастиц (МЧ) в качестве меток, а также осуществлять визуализацию иммунокомплексов «везикулы— биоконъюгаты МЧ» с помощью метода визуализирующей проточной цитометрии.
В качестве антигенов для детекции везикул использовались их
SoVbTv™ ФИЗИКА В БИОЛОГИИ, МЕДИЦИНЕ, СЕЛЬСКОМ ХОЗЯЙСТВЕ И ЭКОЛОГИИ
поверхностные мембранные белки: CD81, CD9 и EpCAM. Подбор оптимальных антител для детекции данных белковых маркеров осуществлялся с применением метода спектрально-корреляционной интерферометрии [4] по регистрации кинетики специфических взаимодействий антиген-антитело. Визуализация иммунокомплексов «везикулы—биоконъюгаты МЧ» проводилась с помощью цитофлуориметра Amnis ImageStream X Mark II при 40-кратном увеличении. Белковые маркеры везикул взаимодействовали с биоконъюгатами «антитело-МЧ», меченными флуоресцентными метками, возбуждающимися излучением с длинами волн 488 и 642 нм. Для измерения бокового светорассеяния использовался лазер с длиной волны 785 нм и мощностью 70 мВт.
С помощью метода визуализирующей проточной цитометрии было установлено, что подбор антител на основе измерения кинетических констант взаимодействия пар антиген-антитело, полученных с помощью метода спектрально-корреляционной интерферометрии, был осуществлен оптимальным образом. На рис. 1 представлены изображения флуоресцентно меченных биоконъюгатов «антитело-МЧ», специфично связавшихся с мембранными белковыми маркерами везикул. На основе полученных данных была разработана иммуноаналитическая система, превосходящая по чувствительности коммерчески доступные тест-системы для детекции внеклеточных везикул, с пределом детекции 3.7*105 везикул в мкл и динамическим диапазоном более двух порядков [5].
РЕ
Су5
SSC
Рис. 1. Изображения иммунных комплексов, образованных Су5-анти-CD9-MЧ с внеклеточными везикулами, окрашенными PE-анти-CD81 антителами в Су5, РЕ каналах и канале бокового светорассеяния
SSjmSS 18-20 октября 2022 г
Авторы выражают благодарность научному руководителю, к.ф.-м.н. Никитину П.И. за постановку научной задачи, помощь в измерениях и обсуждение результатов, а также коллеге Мочаловой Е.Н. за предоставление доступа к визуализирующему проточному цитометру Amnis ImageStream X Mark II.
1. Yoshioka Y. et al. Journal of extracellular vesicles. 2013, 2(1), 20424.
2. Robbins P.D. et al. Stem cell investigation. 2017, 4.
3. Chistiakov D.A. et al. International journal of molecular sciences. 2016, 17(1), 63.
4. Nikitin P.I. et al. Sensors and Actuators B: Chemical. 2005, 111, 500504.
5. Bragina V.A. et al. Nanomaterials. 2022, 12(9), 1579.
