CC BY
64
МЕТОД ТЕМПОРАЛЬНОГО ТЕМПЕРАТУРНОГО ГРАДИЕНТНОГО ГЕЛЬ-ЭЛЕКТРОФОРЕЗА (TTGE) В ИССЛЕДОВАНИЯХ МУТАЦИЙ ГЕНОМА ЛЮДЕЙ, ПОДВЕРГШИХСЯ ВОЗДЕЙСТВИЮ ГАММА-РАДИАЦИИ
А.В. Щербатенко1’ 3), В.Н. Антипова1-1, Н.А. Гуляева1-1, М.Л. Захарова2-1, К.Н. Муксинова2) В.Г. Безлепкин1, 3), А.И. Газиев1-1 1Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино;
2ФГУП Южно-Уральский институт биофизики ФМБА, Озерск;
2Пущинский Государственный университет, Пущино E-mail: alexey-shcherbatenko@rambler.ru
Результаты проведенных анализов показывают, что метод TTGE может быть использован в массовых анализах для оценки воздействия радиации на организм человека путем выявления неизвестных мутаций в ПЦР-амплифицируемых фрагментах ДНК соматических клеток. Изучение генетической вариабельности ядерной и митохондриальной ДНК клеток периферической крови людей, подвергшихся пролонгированному внешнему воздействию гамма-радиации, позволяет полагать, что облучение в дозах от 250 сГр до 500 сГр может быть фактором, обуславливающим повышенный уровень изменений в геноме кроветворных клеток в отдаленный пострадиационный период.
Проблема выявления в геноме человека мутаций, ассоциированных с различными наследственными и индуцированными патологиями, актуальна в плане изучения процессов геномных перестроек, как фундаментального биологического явления. Разработка этого научного направления важна также для прояснения этиологии соответствующих заболеваний и оценки генетического риска воздействия на человека генотоксических факторов, в частности ионизирующей радиации (ИР). Необходимость выявления изменений в геноме соматических и половых клеток при клинических и эпидемиологических обследованиях значительных по численности групп населения делает актуальным поиск методов оценки мутаций и полиморфизмов, отвечающих таким требованиям как чувствительность, скорость и рентабельность (снижение трудоемкости и материальных затрат в расчете на отдельный анализ). Ожидается, что существенный прогресс в такого рода исследованиях может быть достигнут благодаря использованию комплекса новых методов молекулярной биологии, при учете «истории формирования индивидуальных доз облучения» и физиологических особенностей лиц, подвергшихся воздействию радиации. Весьма важным факторм, спосбствующим унификации анализов и их воспроизводимости в разных лабораториях является стандартизация оборудования и расходных материалов, необходимых для реализации метода.
В настоящее время в лабораторных иследованиях генетические мутации могут быть определены с помощью SSCP (single-strand conformation polymorphism analysis), с применением аллель специфичной ПЦР, с использованием различных зондов, посредством определения первичной последовательности нуклеотидов прямым секвенированием. Сравнительная оценка специалистами достоинств и слабых мест этих технологий позволяет считать на сегодняшний день одним из наиболее приемлемых методов, обеспечивающих в скрининговых исследованиях детекцию мутаций на генном уровне, темпоральный температурный градиентный гель-электрофорез (TTGE) в сочетании с локус-специфической ПЦР. Этот вариант гель-электрофореза в денатурирующих условиях при градиенте температуры по времени был разработан Yoshino et al. [1] в 1991 году. Он основан на различной способности к плавлению специфических последовательностей нормальной и мутантной ДНК в условиях градуального повышения температуры геля (в диапазоне расчетной температуры диссоциации анализируемых фрагментов ДНК, Tm) в течение всего времени электрофореза [1-3]. TTGE, являясь модификацией широко применяемой формы DGGE, более надежен, обеспечивает лучшее
разделение гомо- и гетеродуплексов, сформированных из амплифицированных фрагментов ДНК, не требует приготовления гелей с градиентом денатурирущих реагентов. В определенных ситуациях в состав праймеров можно не включать протяженные (до 60 нуклеотидов) GC-«скрепки». Чувствительность метода TTGE характеризует, например, то обстоятельство, что удается выявить даже 4%-й уровень гетероплазмических мутаций митохондриальной ДНК (мтДНК) у человека на фоне гомоплазмического полиморфизма [2,3]. TTGE позволяет выявить в ампликонах тестируемых образцов наличие или отсутствие точковых мутаций (без идентификации конкретных замен оснований), за счет различий в температурах плавления гомо- и гетеродуплексов (возникающих вследствие замены оснований) и разлтчий их электрофоретической подвижности, соответственно. Внешним проявлением возникновения точковых мутаций является гетероплазмия, регистрируемая по появлению на дорожках TTG-электорофореза нескольких полос, вместо единственной, что характерно для локусов «дикого» типа, немутантных.
Корпорация Bio-Rad Labs. Inc. - известный производитель высокотехнологичного научного оборудования - в настоящее время представляет на рынок комплект оборудования и программного обеспечения для проведения TTGE-анализов. Наличие и доступность (при финансовых возможностях) такого стандартизированного оборудования является основой корректного применения в разных лабораториях одного и того же метода и получения сравнимых результатов.
В наших исследованиях метод TTGE в сочетании с ПЦР был использован для анализа генетических изменений в ДНК периферической крови (ПК) людей в отдаленные сроки после воздействия ИР. Проведены исследования по определению мутаций в ядерной и митохондриальной ДНК более 20 доноров, не подвергшихся облучению, и около 60 человек, получивших разную дозовую нагрузку (в диапазоне 5 - 500 сГр) за период работы на предприятии ядерной промышленности (ПО «Маяк», Челябинская область). Препараты ДНК были получены из образцов периферической крови профессионалов-ядерщиков, подвергшихся
пролонгированному внешнему воздействию гамма-излучения за 20-30 лет до проведения обследований. Анализировались два локуса яДНК (4 и 8 экзоны гена р53 и один локус мтДНК из района D-петли (D-loop1). Традиционная локус-специфическая ПЦР проводиась на амплификаторах MiniCycler PTC-150 (MJ Research, Inc., Великобритания) и «Терцик» (НПФ «ДНК-Технология», Россия). Метод TTGE реализован с применением аппарата Bio-Rad D-Code (Bio-Rad Labs. Inc., США) в 6% полиакриламидном геле с мочевиной при 145 V и линейном градиенте температуры 1,2-1,5 °С/час. Градиент температуры геля в процессе разделения рассчитывался с применением программного продукта WinMelt™, Version 2.0 (Bio-Rad Labs. Inc., США) на основе учета нуклеотидной последовательности тестируемых фрагментов. При выявлении мутаций в гене р53 в качестве эталонного образца ДНК использовался продукт ПЦР-амплификации фрагмента гена р53 человека из набора «Lab. kit BIO-RAD» (смесь нормальной и несущей точковую мутацию последовательностей).
На рис. 1 слева показана TTGE-электрофореграмма ампликонов 4 экзона гена р53 ДНК людей, не подвергавшихся облучению (дорожки 1 - 4). В группе из 23 человек был выявлен один донор с мутацией (дорожка 3). Эта мутация не обнаружена у родителей донора (дорожки 1 и 2) и у второго ребенка в семье (дорожка 4). Выяснилось, что за 4 года до проведения TTGE-анализа у индивида с мутацией был диагностирован узловой зоб 1-й степени. Это обстоятельство представляет интерес в связи с известными фактами повышенной частоты мутаций у лиц, с разными формами опухоли щитовидной железы [4]. По 8 экзону в обследованной контрольной группе доноров мутаций не выявлено.
правой части рис.1 показан результат анализа продукта амплификации 4 экзона гена p53 ДНК из клеток крови трех людей, подвергшихся гамма-облучению (дорожки 5 - 7) в диапазоне доз 300 - 400 сГр. Гетероплазмия регистрируется на препаратах ДНК у донора, фореграмма которого приведена на 6-й дорожке. Всего в группе из 24 обследованных с накопленными дозами от 250 до 500 сГр мутации в 4 экзоне обнаружены в трех случаях. В 8 экзоне мутации (гетероплазмия) выявлены только у 2 доноров. Мутации на участке D-loop1 мтДНК выявляются у 6 из 13 индивидумов, для которых диапазон накопленных доз пролонгированного облучения составляет 250 - 400 сГр. Кровь у этой группы доноров была взята через 16-28 лет после прекращения контакта с источниками ИР. В группе пожилых доноров аналогичного возраста, не подвергшихся облучению, мутации в D-loop1 выявлены у 3 индивидуумов из 18. Ранее в работах других авторов сообщалось о повышенной частоте мутаций в D-loop1 у пациентов, прошедших курс радиохимиотерапии по поводу онкозаболеваний, и в клетках лиц старшей
возрастной группы [5,6]
Анализ частоты точковых мутаций в экзонах гена р53 в акриламиде в наших исследованиях реализован в полуколичественном варианте, как выявление собственно факта гетроплазмии в ДНК из ПК у отдельных индивидов. Технология количественного определения уровня гетероплазмии требует на этапе анализа изображения ДНК-фингерпринтов
использования телекамеры на CCD-матрице («charge coupled device”) с широким динамическим диапазоном и специального программного обеспечения [7].. Применение такого оборудования (отечественный вариант телекамеры от ООО «ДельтаТех», Москва [8].) можно полагать, позволит оценивать не только частоту встречаемости мутаций в выборке, но количество мутаций в препаратах ДНК, полученных от конкретных доноров. Работа в этом направлении продолжается.
В настоящее время сведения о сроках сохранения индуцированных мутаций мтДНК в клетках после воздействия на организм повреждающих агентов весьма ограничены. Возможно, значительная часть мутантных копий мтДНК в клетках периферической крови в процессе обновления крови подвергаются элиминации. Обнаруженные в нашей работе мутации гена р53, локализованного в ядерной ДНК, и участка D-loop1 мтДНК демонстрирует повышенный уровень нестабильности генома клеток периферической крови людей, подвергшихся пролонгированному гамма-облучению в период работы на предприятии ядерной промышленности, спустя 20 -30 лет после прекращения контактов с источниками излучения. Существенным моментом при интерпретации результатов является учет «истории формирования индивидуальных доз облучения» и медико-биологических характеристик лиц подвергшихся воздействию радиации. Применение метода TTGE может быть чувствительным и рентабельным подходом в скрининговых исследованиях для ретроспективного выявления радиационного воздействия на человека. Однако, результаты наших исследований, а также данные, полученные в работе Wilding et al. [9], пока не позволяют утверждать, что определение частоты
1 2 3 4 5 6 7
Рис.1. ТГОЕ-анализ про-
дукта амплификации 4 экзона гена р53 ДНК из клеток крови людей контрольной группы (дорожки 1-4) и подвергшихся гамма-облуче-ию в диапазоне доз 300-400 сГр (пояснения. (дорожки 5 -7).
точковых мутаций ДНК в клетках периферической крови может быть способом количественной ретроспективной дозиметрии в отдаленные сроки после радиационного воздействия. Можно полагать, что результаты исследования будут полезны как для дальнейшей разработки новых молекулярно-генетических методов оценки радиационного риска, так и для понимания закономерностей и механизмов формирования радиационно-индуцированной нестабильности генома соматических клеток у человека.
Выполнение работы финансировалось грантом РФФИ № 06-04-49418 и Программой Президиума РАН “Фундаментальные науки - медицине”, 2007г.
1. Yoshino K., Nishigaki K. and Yuzuru Husimi Y. // Nucleic Acids Res. 19, 3153, 1991
2. Chen T., Boles R.G., Wong L. C.// Clin. Chem. 1999. V. 45. P. 1162-1167. 23.
3. Wong L.C., Liang M., Kwon H. et al. // Clin. Chem. 2002. V. 48. P. 1901-1912.
4. Дедов И.И., Трошина Е.А., Мазурина Н.В. и др. // Проблемы эндокринологии,
(2000) 46, 2, 22-30
5. Wardell T.M., Ferguson E., Chinnery P.F. et al. // Mutat. Res. 2003. V. 525. P. 19-27.
6. Bo R. D., Crimi M., Sciacco M. et al. // Neurobiol. Aging 2003. V. 24. P. 829-838.
7. Boles RG, Chaudhari D, Soderkvist J. et al. // Clin. Chem. 2003 49(1):198-200
8. http:www.deltatekh.ru/
9. Wilding, C.S., Cadwell, K., Tawn, E.J. et al. // Radiat. Res. 2006. V. 165. P. 202-207.
USING OF TEMPORAL TEMPERATURE GARADIENT GEL ELECTROPHORESIS TO INVESTIGATE MUTATIONS IN PERIPHERAL BLOOD CELLS GENOME OF HUMANS EXPOSED TO PROLONGED EXTERNAL GAMMA-RADIATION
A.V. Shcherbatenko1’3-1, V.N. Antipova1-1, N.A. Gulyaeva1-1, M.L. Zakharova2-1, L.A. Fomenko1-1,
K.N. Muksinova2-1, V.G. Bezlepkin1,3-1 ^Institute of Theoretical and Experimental Biophysics, RAS, ^South-Urals Institute of Biophysics Ozersk,
^Pushchino State University, Pushchino e-mail: alexey-shcherbatenko@rambler.ru
The results show that the method of TTGE can be used in mass analyses to assess the effects of radiation and other genotoxic agents in man by detection of unknown mutations in peripheral blood DNA. The studies of genetic variability of nuclear and mitochondrial DNA in peripheral blood cells of humans exposed to a prolonged external radiation allowed the suggestion that irradiation in the dose range between 50 cGy and 500 cGy may be a factor causing an increased level of genome alterations in haemopoietic cells at remote times.
