МЕТОД СЕЛЕКТИВНОГО ПОИСКА АЛЛЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ В ГЕНЕ АТМ: РЕЗУЛЬТАТ ЕГО КЛИНИЧЕСКОГО ТЕСТИРОВАНИЯ Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

УДК [575.113.2:577.112.383.2]:543.9

МЕТОД СЕЛЕКТИВНОГО ПОИСКА АЛЛЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ В ГЕНЕ АТМ: РЕЗУЛЬТАТ ЕГО КЛИНИЧЕСКОГО ТЕСТИРОВАНИЯ

ГУРЬЯНОВА И.Е.,

к.б.н., доцент, заведующий лабораторией, Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии, Минск, Республика Беларусь; старший научный сотрудник, НИЛ "Иммунопатология", Институт фундаментальной медицины и биологии, Казанский Федеральный Университет, Казань, Российская Федерация

ВОЛОДАЩИК Т.П.,

младший научный сотрудник, Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии, Минск, Республика Беларусь

АБРАМОВ С.Н.,

младший научный сотрудник, НИЛ "Иммунопатология", Институт фундаментальной медицины и биологии, Казанский Федеральный Университет, Казань, Российская Федерация

ПОЛЯКОВА Е.А.,

к.б.н., заведующий лабораторией, Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии, Минск, Республика Беларусь; старший научный сотрудник, НИЛ "Иммунопатология", Институт фундаментальной медицины и биологии, Казанский Федеральный Университет, Казань, Российская Федерация

БЕЛЕВЦЕВ М.В.,

к.б.н., доцент, заместитель директора по научной работе, Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии, Минск, Республика Беларусь; заведующий лабораторией, НИЛ "Иммунопатология", Институт фундаментальной медицины и биологии, Казанский Федеральный Университет, Казань, Российская Федерация

Аннотация. Синдром Луи-Бар - это тяжелое редкое мультисистемное нейродегенеративное заболевание, возникающее из-за аллельных вариантов в гене АТМ в компаунд-гетерозиготном или гомозиготном состоянии, характеризующееся мозжечковой атаксией, телеангиэктазиями кожи и конъюнктивы глаз, иммунодефицитом, прогрессирующей дыхательной недостаточностью и повышенным риском злокачественных новообразований. Лабораторная диагностика отличается высокой вариабельностью показателей иммунитета. Тяжесть заболевания обычно зависит от возраста пациента, поскольку без точного диагноза пациенты с синдромом Луи-Бар получают неадекватное или несвоевременное лечение, что и приводит к развитию тяжелых осложнений, ранней инвалидизации и смертности. Из-за большого размера (более 130 т.п.о.) гена АТМ и существования более 10 000 клинически значимых нарушений, выявление патогенетических аллельных вариантов у пациентов с синдромом Луи-Бар методом автоматического секвенирования по Сенгеру является трудо- и затратоемким процессом. В данный статье мы отразили результаты применения на практике метода генетической диагностики, основанного на секвенирование кодирующих регионов гена АТМ.

Ключевые слова. Синдром Луи-Бар, атаксия-телеангиэктазия, ген ATM, секвенирование, панель олигопраймеров

Введение. Ген ATM кодирует одноименный белок - серин/треониновую протеинкиназу АТМ. АТМ-белок активируется при разрывах нитей ДНК и фосфорилирует несколько ключевых белков, которые инициируют остановку клеточного цикла и запускают репарацию

ДНК или апоптоз [1]. Аллельные варианты в гене ATM являются причиной аутосомно-рецессивного заболевания - атаксии-телеангиэктазии (синдром Луи-Бар, OMIM # 208900), и также ассоциированы с различными видами онкологии: лейкозы, лимфомы, новообразования молочной железы и мочевого пузыря [2]. Частота встречаемости синдрома Луи-Бар колеблется от 1:40 000 до 1:100 000 населения, а в некоторых странах частота выявляемости данной патологии составляет реже чем 1:300 000 [3]. Основными клиническими особенностями синдрома Луи-Бар являются прогрессирующие нейродегенеративные проявления, вариабельные иммунологические нарушения, сопровождающиеся повышенной склонностью к развитию инфекций, а также повышенная склонность к развитию онкологических заболеваний и повышенная чувствительность к ионизирующей радиации [4]. Нарушение походки вследствие мозжечковой атаксии, часто является первым признаком заболевания и нередко ведет к постановке ложного первичного диагноза - детского церебрального паралича [5].

Лабораторная диагностика отличается высокой вариабельностью показателей как клеточного, так и гуморального иммунитета. Уровень альфа-фетопротеина повышен у 80-85% пациентов и является наиболее часто используемым лабораторным биомаркером при диагностике синдрома Луи-Бар [5]. Кроме этого, в 80% случаев выявляется снижение сывороточных IgA, IgE, IgG и повышение низкомолекулярного IgM. У пациентов также часто наблюдается лимфопения, особенно затрагивающая Т-лимфоциты, выявляются дефекты дифференцировки В-клеток при нормальном количестве циркулирующих В-лимфоцитов, патогенетически обоснованные наличием нарушения реаранжировок ДНК Т- и В-клеточного рецепторов [6]. Лимфопению, обусловленную нарушением реаранжировок ДНК Т- и В-клеточного рецепторов, можно выявить при помощи оценки количества продуктов рекомбинации генов ДНК Т- и В-клеточного рецептора TREC и KREC более чем в 85% пациентов с синдромом Лиу-Бар [7]. Однако, в 25%-30% случаев количество TREC и KREC у пациентов неонатального периода и младшего возраста могут оставаться в пределах нормальных значений [5,7].

Таким образом, поиск аллельных вариантов в гене АТМ является важным диагностическим инструментом, позволяющим достоверно подтвердить клинический диагноз. Кроме этого, выявление патогенетических аллельных вариантов дает возможность детектировать заболевание у сибсов на доклинической стадии или выполнять пренатальную диагностику.

Ген ATM расположен на 11 хромосоме (11q22-q23) и включает в себя 133 121 нуклеотидов, из них всего 12 615 нуклеотидов формируют кодирующую часть гена, которые распределены по 63-ем экзонам [8]. Из-за большого размера гена АТМ выявление клинически значимых аллельных вариантов у пациентов с синдромом Луи-Бар является трудоемким процессом. Согласно публичным базам данных LOVD и Varsome в экзонных областях гена АТМ локализовано 87,4-87,8% всех нарушений с патогенным и неопределенным клиническим значением [9,10]. Мы предлагаем при генетической диагностике пациентов с предположительным диагнозом синдром Луи-Бар первоначально использовать метод селективного поиска аллельных вариантов, основанный на секвенировании кодирующих регионов гена АТМ.

Целью исследования явилось разработать метод селективного поиска аллельных вариантов в гене АТМ.

Материалы и методы исследования. В исследование включены образцы кДНК от 18 неродственных пациентов, проходивших генетическое обследование в государственном учреждении «Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии» д.Боровляны в период времени с 2011 по 2023 гг. Среди которых, 13 пациентов были гражданами Республики Беларусь, 5 - Российской Федерации.

В основе метода селективного поиска аллельных вариантов в гене АТМ лежит создание панели олигопраймеров для амплификации регионов, охватывающих всю кодирующую последовательность гена АТМ. Дизайн олигопраймеров осуществляли с использованием программного обеспечения Primer-BLAST (Primer designing tool, https://www.ncbi.nlm.nih.gov). Отсутствие на 3'-конце стабильных петель, неспособность формировать праймер-димеры, отсутствие кластеров повторяющихся нуклеотидов, отсутствие альтернативных сайтов отжига прямого и обратного олигопраймеров в пределах одной хромосомы проверяли с помощью программы OligoCalc (Oligonucleotide properties calculator,

http://biotools.nubic.northwestem.edu) и гетеро-димерного анализа в программе OligoAnalyzer (IDT SciTools, https://www.idtdna.com). Последовательности олигопраймеров для амплификации кодирующих регионов гена АТМ представлены в таблице 1. Таблица 1 - Последовательности олигопраймеров для амплификации кодирующих регионов гена АТМ

Название олигопраймера Последовательность (5'-3') Температура отжига Длина ПЦР-продукта (п.о.)

ATM RNA 1 F TGACCTTCCGAGTGCAGTG 59.63 645

ATM RNA 1 R CAGCATCCTTTGGTAACAGCA 58.84

ATM RNA 2 ! TCTCTGTGTACTTCAGGCTCT 58.50 652

ATM RNA 2|R TGCAAGGGACACTGTAATCACT 59.63

ATM RNA 3 F TCTGTCACCAGGTTTTTAATGAAG 57.37 594

ATM RNA 3 R TACTGGTGGTCAGTGCCAAA 59.16

ATM RNA 4 F TGGAGCCATAATTCAGGGTAGT 58.61 640

ATM RNA 4 R AAGACGTGAACACCGGACAA 59.82

ATM RNA 5 I ACTGGATCGCTGTCTTCTGG 57.47 696

ATM RNA 5|R GCTGCCCTAAAGGACACAGT 59.96

ATM RNA 6 F AGCTGAAGAATATCTGTCAAAGCAA 59.06 657

ATM RNA 6 R GAATCTCCCTTCGTGTCCTGG 60.13

ATM RNA 7 F TTCGCATGTTGGCTGCAGAG 61.58 690

ATM RNA 7 R CAGTCTCTCTTTGCTGTGCC 58.84

HMUNHHT TCTTCTAACAGACTGCTTTCCA 57.94 681

HMHHHH TAAGTCACGGCTGTCTGGC 59.7

ATM RNA 9 F TGGGCCTTTGTTCTTCGAGAC 60.54 608

ATM RNA 9 R CCAGTGTGGTTTATTGCCATCT 58.91

ATM RNA 10 F TCCGCAAGATGGGATTATGGT 59.23 577

ATM RNA 10 R TTTTGTGCCTCCACTGTCCAA 60.34

ATM RNA 11 F TCTGTGGATTCCTCTAAGTGAAAA 57.57 693

ATM RNA 11 R CCTCCACCACAGCCATACAA 59.67

ATM RNA 12 H TTGCATTTGAAGAAGGAAGCCA 59.04 637

ATM RNA 12 R TCCCCAATGCTTTCCAGCTC 60.32

■TM RNA 13 F GATGTGTAAGCGCAGCCTTG 59.90 637

ДГМ RNA 13Ц TCCAGCAACTTCTACTGCCT 58.65

■Мщцщ TGTCTGAGGGTTTGTGGCAA 59.74 594

¡■■■■I GCCTCCCATCATCTTGGTCC 60.18

ATM RNA 15 F TGGCATGATGAAGAGAGACGG 59.86 629

ATM RNA 15 R CCTTGCCATCGGAACCTACA 59.75

ATM RNA 16 F TTTCGCTTAGCAGGAGGTGT 59.31 691

ATM RNA 16 R TGCCCATGCCATCCACAATA 59.74

ATM RNA 17 F GGGCAAAATCCTTCCTACTCCT 59.76 686

ATM RNA 17 R GAGTGAAAGCAGAGATGTTCCT 58.06

Разработанная панель включила 17 пар олигопраймеров, что в 3,7 раза меньше количества пар олигопраймеров, используемых для амплификации последовательностей каждого из 63 экзонов с прилегающими к ним слайс-регионов. За счет использования в качестве матрицы кДНК, олигопраймеры позволяют получать нуклеотидные последовательности нескольких экзонов подряд, но при этом длина фрагментов не превышает 700 п.о. (рисунок 1).

Рисунок 1 - Визуализация локализации подобранных олигопраймеров, позволяющих амплифицировать фрагменты захватывающие все кодирующие регионы гена АТМ

Амплификацию необходимых фрагментов проводили методом полимеразной цепной реакции на программируемом термоциклере Verity (Life Technologies, США) с использованием реакционной смеси (Invitrogen, США) и синтезированных олигопраймеров (Праймтех, РБ)

Определение аллельных вариантов всех кодирующих регионов гена ATM, осуществляли методом автоматического секвенирования по Сенгеру на генетическом анализаторе 3500 Applied Biosystems (Thermo Scientific, США) с использованием набора BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США).

Результаты исследования. В нашем исследовании аллельные варианты локализовались в кодирующих регионах в 30 из 36 случаев, а сплайс-сайт регионах соответственно в шести. При применении метода селективного поиска аллельных вариантов в гене АТМ нарушения в сплай-сайт регионах не выявлены ввиду используемой технологии, в свою очередь, все клинически значимые варианты, локализованные в кодирующих регионах были выявлены, зиготность нарушений идентична исходным данным (таблица 2).

Таблица 2 - Результат применения метода селективного поиска аллельных вариантов в гене АТМ

№ Пол Детектирование нарушения: Результат Диагноз

1 м с.4002-4005 del. CTTA, het. Выявлено, het. с-м Луи-Бар

с. 4148 C^A, het. Выявлено, het.

2 ж c. 2115C^G, het. Выявлено, het. с-м Луи-Бар

c. 5441del T, het. Выявлено, het.

3 м с.7307+1 G^A, het. Не выявлено Необходимо дообследование

c. 5932 G^T, het. Выявлено, het.

4 ж c. 8565 T^G, hom. Выявлено, hom с-м Луи-Бар

5 м c. 1561-1562 del AG, het. Выявлено, het. с-м Луи-Бар

c. 6154 G^A, het. Выявлено, het.

6 м c. 1053 G^T, het. Выявлено, het. с-м Луи-Бар

c.5015-5018 del GAAG, het. Выявлено, het.

7 ж c. 5932 G^T, het. Выявлено, het. Необходимо дообследование

c.7630-2 A^C, het. Не выявлено

8 м c. 4148 C^A, het. Выявлено, het. с-м Луи-Бар

c. 5932 G^T, het. Выявлено, het.

9 м c. 7997 C^A, het. Выявлено, het. Необходимо дообследование

c.8584+2T^C, het. Не выявлено

10 м c. 5932 G^T, hom. Выявлено, hom. с-м Луи-Бар

11 ж c. 5932 G^T, het. Выявлено, het. Необходимо дообследование

c.5497-1 G^A, het. Не выявлено

12 ж с.4148 C^A, het. Выявлено, het. Необходимо дообследование

c. 4776+3 A^C, het. Не выявлено

13 ж с. 4630-2 A^C, het. Не выявлено Необходимо дообследование

c 8147 T^C, het. Выявлено, het.

14 ж ex. 5 c.432-433 ins A, het. Выявлено, het. с-м Луи-Бар

c. 6820 G^C, het. Выявлено, het.

15 м c. 1339 C^T, het. Выявлено, het. с-м Луи-Бар

c. 8287 C^T, het. Выявлено, het.

16 м c. 5932 G^T, hom. Выявлено, hom. с-м Луи-Бар

17 ж c. 7438 del C, het. Выявлено, het. с-м Луи-Бар

c. 8753 T^G, het. Выявлено, het.

18 ж с. 2413 C^T, het. Выявлено, het. с-м Луи-Бар

c. 6776 6777 del CT, het. Выявлено, het.

Примечание: запись нуклеотидов представлена согласно референсной последовательности ENST00000675843.1; het. - гетерозиготное нарушение, hom. -гомозиготное нарушение; пациент №1-13 из Республики Беларусь, пациент №14-18 из Российской Федерации

Таким образом, примененный метод генетической диагностики позволил выявить 83,3% патогенетически значимых аллельных вариантов в нашей выборке пациентов, что является его диагностической эффективностью. Полученные данные демонстрируют приемлемые результаты для использования метода селективного поиска аллельных вариантов в гене АТМ в лабораторной практике, а сокращение необходимого для анализа количества ампликонов позволяет снизить трудо- и затратоёмкость генетической диагностики.

Однако, помимо большого количества экзонов, сложность диагностики синдрома Луи-Бар заключается еще и в том, что данное заболевание наследуется по аутосомно-рецессивному типу, т.е. необходимо выявить два гетерозиготных нарушения или одно гомозиготное для подтверждения диагноза. Ввиду чего, не выявление 6 нарушений в сплайс-сайте в нашем исследовании, повлекло за собой не выявление гетерозиготного компаунда, необходимого для подтверждения диагноза. В следствии чего, применение метода селективного поиска аллельных вариантов в гене АТМ способствовало генетическому подтверждению синдрома

Луи-Бар у 12 пациентов из 18, что соответствует 66,7%. Такой процент не позволяет использовать предложенный метод в качестве уточняющего (подтверждающего) метода исследования при диагностике синдрома Луи-Бар, однако может быть использован в системе первичного обследования.

Выводы. Учитывая, что в экзонных областях гена АТМ локализовано около 85% всех аллельных вариантов с патогенным и неопределенным значением, внедрение технологии секвенирования кодирующих регионов как молекулярно-диагностического метода диагностики является рациональным. В качестве эффективной технологии может применяться метод селективного поиска аллельных вариантов в гене АТМ. Данный метод не требует ожидания набора группы пациентов, как например при выполнении исследования методом высокопроизводительного секвенирования, и может быть принят к выполнению непосредственно в день решения о необходимости выполнения генетического исследования. Разработанная панель олигопраймеров позволяет амплифицировать фрагменты захватывающие кодирующие регионы гена АТМ в полном объеме. Описанный метод сокращает расход реагентов, стоимость, а также время выполнения исследования при молекулярно-генетическом анализе гена АТМ. Данная эффективная и быстрая технология может быть реализована в рутинной лабораторной практике.

Благодарности. Работа выполнена при поддержке Министерства здравоохранения Республики Беларусь. Работа выполнена за счет средств субсидии, выделенной в рамках государственной поддержки Казанского (Приволжского) федерального университета в целях повышения его конкурентоспособности среди ведущих мировых научно-образовательных центров.

ЛИТЕРАТУРА

1. Потякина К.Е. Ген ATM [Электронный ресурс] // ГЕНОКАРТА Генетическая энциклопедия. 2020. 21 мая. Дата обновления: 20.10.2020. URL: https://www.genokarta.ru/gene/ATM (дата обращения: 21.08.2023).

2. Clinical Characteristics of Patients With Pancreatic Cancer and Pathogenic ATM Alterations / Z. Hannan [et al.] // JNCI cancer spectrum. 2021. Vol. 5(2). P. 1-4. doi:10.1093/jncics/pkaa121.

3. Riboldi G.M., Samanta D., Frucht S. Ataxia Telangiectasia. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing, 2023.

4. Ataxia-telangiectasia: epidemiology, pathogenesis, clinical phenotype, diagnosis, prognosis and management / P. Amirifar [et al.] // Expert review of clinical immunology. 2020. Vol. 16(9). P. 859871. doi: 10.1080/1744666X.2020.1810570.

5. Характеристика клинических и лабораторных проявлений в группе пациентов с синдромом атаксии-телеангиэктазии / Т.В. Асекретова [и др.] // Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии. 2022. Т. 21, N 3. С. 47-55.

6.Кондратенко И.В., Бологов А.А. Первичные иммунодефицита: Учебное пособие. Москва: ИндексМед Медиа, 2020. - 791 с.

7.Количественное определение кольцевых фрагментов ДНК Т- и В-клеточного рецептора TREC/KREC у пациентов с атаксиейтелеангиэктазией с мутацией в гене ATM / Е.А. Полякова [и др.] // Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2022. N 2. С. 6-11.

8.ATM (human gene) [Electronic resource] / Ensembl genome browser 104. URL: http://www.ensembl.org/index.html (date of access: 22.08.2023).

9.ATM gene [Electronic resource] / Leiden Open Variation Database. URL: https://www.lovd.nl/ (date of access: 22.08.2023).

10.ATM gene [Electronic resource] / Varsome. URL: https://varsome.com/gene/hg19/atm (date of access: 22.08.2023).