CC BY
7
рируют на ротационном испарителе до объема 0,2— 0,3 мл при температуре воды в водяной бане около 50 °С. Остаток удаляют в токе воздуха.
Экстракты из растительных объектов подвергают дополнительной очистке. Сухой остаток из капусты растворяют в 5 мл охлажденного ацетона, приливают 5 мл дистиллированной воды и 30 мл охлажденного осаждающего раствора, который готовят следующим образом: 5 г хлористого аммония растворяют в 100 мл дистиллированной воды, добавляют 10 мл 86% ортофосфорной кислоты и доводят до 1 л водой. Колбу на 40 мин помещают в холодильник. После охлаждения ее содержимое отфильтровывают через плотный бумажный фильтр. Из водно-ацетонового экстракта болстар экстрагируют 3 порциями н-гексана по 30 мл в течение 3 мин. Экстракт объединяют, сушат над безводным сернокислым натрием и концентрируют до объема 0,2—0,3 мл при температуре воды около 40 °С. Остаток удаляют в токе воздуха.
Экстракт из ботвы картофеля очищают на хрома-тографической колонке диаметром 2 см и высотой 20 см, которую заполняют следующим образом. В нижнюю часть колонки помещают кусочек стекловолокна, далее слой окиси алюминия II степени активности по Брокману (1,5 см), затем смесь из 1 г окиси алюминия и 1 г активированного угля и снова слой окиси алюминия (1,5 см). Сверху кладут кусочек стеклоткани. Чтобы снизить адсорбционную емкость колонки, через нее предварительно пропускают 50 мл хлороформа. Сухой остаток растворяют в 5 мл хлороформа и переносят на колонку. Элюирование проводят 75 мл хлороформа
под разрежением водоструйного насоса. Элюат отгоняют на ротационном испарителе до 0,2—0, 3 мл. Остаток переносят на пластинку «Силуфол». Стенки колбы смывают несколькими каплями гексана, который наносят в центр пятна. Справа наносят стандартные растворы болстара. Пластинки помещают в хроматографические камеры с системой подвижных растворителей.
После подъема фронта растворителя на высоту 10 см пластинку вынимают из камеры, подсушивают на воздухе и помещают на 10 мин под источник УФ-света, после чего обрабатывают проявляющим реагентом. При газохроматографическом определении сухой остаток растворяют в 3—4 мл н-гексана или ацетона и переносят в градуированную пробирку. Объем доводят до 10 мл. В испаритель вводят 3—4 мкл рабочего раствора.
Содержание препарата находят по формуле:
где X — содержание болстара в анализируемой пробе, мг/кг или мг/л; V — общий объем рабочего раствора, мл; К — количество препарата в оликво-те, найденное по калибровочному графику, нг; Р — навеска (объем) анализируемого вещества, г (мл).
Стандартные растворы болстара с содержанием 100 и 10 мкг препарата в 1 мл н-гексана или ацетона хранят в холодильнике. Чувствительность метода 0,01—0,001 мг/кг. Процент определения 85—91.
Поступила 16.09.81
УДК 613.632.4 + 614.721:678.041.2]-074:543.544
И. С. Духовная, Е. М. Юн
МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТАБИЛИЗАТОРА N. N1-ДИФЕНИЛ-п-ФЕНИЛЕНДИАМИНА
ВНИИ гигнены и токсикологии пестицидов, полимерных и пластических масс, Киев
В производстве синтетических каучуков и резин на их основе, предназначенных для контакта с различными объектами окружающей среды, все шире применяется противостаритель днфеннл-п-фенилендиамин (Диафен ФФ, ДФФД).
В литературе описаны методы определения Диа-фена ФФ в резинах (Campbell и Joung; Wake), красках для волос (Smyth и Мс Keown), искусственных смесях (Uchytyl; Ivan и Cintacu), технических продуктах (К. Б. Пиотровский и А. А. Таран). За редкими исключениями при этом используются методы бумажной и тонкослойной хроматографии. Однако крайне невелико число публикаций по определению этого распространенного противоста-рнтеля и антиозонанта при саннтарно-хнмических исследованиях полимерных материалов.
Мы разрабатывали метод определения Диафена ФФ для целей санитарно-химического контроля. В основу метода была положена хроматография в тонком слое силикагеля.
В молекуле Диафена ФФ у атомов азота находятся фенильные заместители, которые понижают его сорбируемость по сравнению с молекулой незамё-щенного диамина, создавая стерические препятствия к адсорбции, а также понижая электронную плотность на атомах азота вследствие его электрон-акцепторных свойств. На этом основании при выборе системы подвижных растворителей нами были исследованы подвижные фазы, представляющие собой бинарные смеси на основе неполярных органических растворителей — гексана и четыреххло-ристого углерода (И. С. Духовная).
Хроматографирование Диафена ФФ и неозона Д на пластинках снликагель—гипс
R f
Система подвижных растворителей
диафен ФФ неозон Д
Гексан 0,00 0,00
Четыреххлористый углерод 0,00 0,22
Гексан—диэтиловый эфир 9:1 0,00 —
Гексан—ацетон 9:1 0,18 0,33
Четыреххлористый углерод— 0,73
диэтиловый эфир 9:1 0,46
Четыреххлористый углерод— 0,80
ацетон 9:1 0,50
Известно (И. П. Маслова и соавт.), что Днафен ФФ особенно эффективен в тех случаях, когда применяется в комбинации с неозоном Д (фенил-р-наф-тиламин). На этом основании хроматографическое поведение Диафена ФФ изучалось в присутствии неозона Д. Метод определения последнего описан нами ранее (И. С. Духовная и Н. Ф. Казаринова).
На основании данных исследования хроматогра-фического поведения Диафена ФФ (см. таблицу) для его определения в присутствии неозона Д была выбрана система подвижных растворителей четы-реххлористый углерод — диэтиловый эфир в соотношении 9:1, позволяющая четко разделить эти вещества.
В качестве реагента для обнаружения был выбран диазотированный п-нитроанилин, который готовят следующим образом. Раствор А. 0,7 г п-нитроанилина растворяют в 100 мл смеси вода — концентрированная соляная кислота 91 : 9. Раствор Б. 1% раствор нитрита натрия. Перед употреблением к 5 мл раствора Б при охлаждении и перемешивании по каплям добавляют 5 мл раствора А. С помощью этого реактива Диафен ФФ обнаруживается в виде зеленовато-коричневых пятен, неозон Д — в виде лиловых. Открываемый минимум
I на пластинке для каждого вещества составляет 0,5 мкг.
Диафен ФФ хорошо растворим во многих органических растворителях. Известно, что наибольшие константы распределения ароматических аминов между органическими растворителями и водой наблюдаются при использовании хлороформа и хлористого метилена (И. М. Коренман). Последние и были применены нами при исследовании возможностей экстракционного концентрирования Диафена ФФ из водных сред. Полученные результаты показали, что при использовании в качестве экст-рагента хлористого метилена наблюдается 85— 90% полнота извлечения. В случае применения хлороформа процент извлечения не превышает 50—70.
Ф Таким образом, для определения Диафена ФФ пробу объемом 100 мл дважды экстрагируют хлористым метиленом порциями по 30 мл. Объединенные экстракты упаривают на водяной бане, темпе-
ратура которой не превышает 80 °С, до объема 0,1—0,3 мл и хроматографируют на пластинках с тонким слоем силикагеля КСК, скрепленного 12% гипса, в системе подвижных растворителей четы-реххлористый углерод — диэтиловый эфир 9:1. При определении Диафена ФФ в модельных растворах кислого характера перед экстракцией к пробе добавляют 2 г едкого натра в случае 0,2'и 0,3% растворов кислот и 5 г в случае 2 и 3% растворов, охлаждают их до комнатной температуры и проводят определение описанным выше способом. При исследовании водно-спиртовых сред спирт отгоняют в вакууме водоструйного насоса при температуре водяной бани не выше 30 °С и затем Диафен ФФ определяют так же, как описано выше для водных сред.
При определении Диафена ФФ в 96% спирте последний отгоняютввакууме дообъема 0,1—0,3 мл, остаток наносят на пластинку и далее определяют, как обычно. Минимально определяемое количество Диафена ФФ в воде и модельных растворах составляет 0,01 мг/л. Процент определения его в воде 91,9, в модельных растворах кислого характера 83—86. Описанные условия концентрирования и хроматографического определения позволяют раздельно определять Диафен ФФ и неозон Д при их совместном присутствии в пробе.
Количество обоих веществ измеряют по зависимости между логарифмом количества вещества и корнем квадратным из площади хроматографиче-ской зоны (Purdy и Truter), полученной для данной серии хроматографических пластинок. Для получения графика после обнаружения веществ на хро-матограммах окрашенные пятна переносят на промасленную миллиметровую бумагу, подсчитывают число квадратных миллиметров в пятне и строят зависимость между логарифмом количества вещества и корнем квадратным из полученных площадей хроматографических зон. Линейность графиков и для Диафена ФФ, и для неозона Д соблюдается в интервале 1—15 мкг. Относительная ошибка количественных определений Диафена ФФ составляет 8,2-И),4%, неозона Д 7,3-^0,2%.
Разработанный метод определения Диафена ФФ и неозона Д применен нами при санитарно-химиче-ских исследованиях резин различных марок и назначения.
Литература. Духовная И. С., Казаринова Н. Ф. — В кн.: Гигиена применения полимерных материалов. Киев, 1976. с. 261. Коренман И. М. Экстракция органических веществ.
Горький, 1969. Химические добавки к полимерам. Справочник. /Маслова И. П., Золотарева К- А., Глазунова Н. А. и др. М., 1973.
Пиотровский К■ Б., Таран А. А. — Пром-сть синтет.
каучука, 1969, № 3, с. 17—19. Campbell R. И., loung Е. I. — Rubb. Age, 1968, v. 100,
p. 71—75; — Analyt. Abstr., 1969, v. 17, p. 345. Ivan /., Cin/acu R. — J. Chromatogr., 1974, v. 88. p. 391—397.
Smyth R. В., Mc Keown G. /. — Ibid., 1964, v. 16, p. 454.
Uchylyl В. — Ibid., 1974, v. 93, p. 447—452. Purdy S. Truler E. V. — Analyst, 1962, v. 87, p. 802—
Wake W. C. The Analysis of Rubber and Rubber-like Po- 809. lymers. London, 1969. Поступила 11.09.81
УДК в12.мг.З-06:вГЗ
В. С. Новиков
К МЕТОДИКЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕЙКОЦИТОВ В ФИЗИОЛОГО-ГИГИЕНИЧЕСКИХ ЭКСПЕРИМЕНТАХ
Изучение функциональной активности лейкоцитов в физиолого-гигиенических экспериментах имеет ряд особенностей, связанных с обследованием практически здоровых людей. При этом большое значение имеет комплексное определение количественных и качественных показателей физиологической активности лейкоцитов, что позволяет установить характер и глубину развивающихся сдвигов. Кроме того, используемые в гигиеническом варианте тесты должны быть технически просты и методически доступны врачебному персоналу, не имеющему специальной лабораторной подготовки. Указанным требованиям в определенной степени отвечает комплексный метод определения функциональной активности лейкоцитов по А. И. Шустову. Данный метод позволяет изучать две стадии фагоцитарного процесса — поглощение и переваривание микробного объекта — и одновременно определять показатели, характеризующие физико-химическую устойчивость и адгезивную способность лейкоцитов. От других способов определения поглотительной и переваривающей способности лейкоцитов (В. М. Берман и Е. М. Славская; А.И. Иванов и Б. А. Чухловин; Ф. М. Супоницкая) он отличается упрощением техники постановки реакции и позволяет комбинированно измерять количественные лейкоцитарные и функциональные фагоцитарные показатели.
Однако применение данного метода ограничено вследствие невозможности одновременного проведения исследований более чем у 7 человек. Это связано с тем, что кровь берется после приготовления микробной взвеси, которая пригодна для работы тотчас, поскольку время генерации используемого в реакции Staphylococcus aureus (№ 209 Р) не более 35—40 мин. Это время и определяет конкретные возможности лаборанта в отношении числа одновременно проводимых исследований.
Для увеличения числа одновременно выполняемых исследований, повышения надежности и точности методики мы изменили последовательность постановки реакции, конкретизировали способы оценки поглотительной и переваривающей активности микрофагов и привели расчетные формулы определения относительной потери фагоцитов и адгезивной способности лейкоцитов. Соотношения используемых в реакции ингредиентов и способы обработки полученных результатов нами не изменены.
С учетом того что в цитратной крови нейтрофиль-ные лейкоциты сохраняются лучше (Stockinger и Fresse), мы первоначально в должное число пробирок вносили по 0,01 мл свежеприготовленного раствора 9% лимоннокислого натрия1, а затем добавляли по 0,2 мл исследуемой крови и 0,01 мл стандартизированной микробной взвеси (1 млрд. микробных тел в I мл), приготовленной непосредственно перед инкубированием ингредиентов реакции. Все ингредиенты смешивали и помещали в термостат с температурой 37 "С.
При такой последовательности проведения реакции резерв времени, необходимой для взятия крови, увеличивался по сравнению с оригинальной методикой в 3—4 раза, что позволяло одновременно обследовать до 30 человек. Для определения функциональной активности лейкоцитов в мазках крови, приготовленных через 30, 90 и 120 мин термостатирования, подсчитывали лейкоцитарные формулы и одновременно отмечали число активных фагоцитов и количество поглощенных ими микробов. Учитывали комплекс объективных и субъективных признаков дегенерации и лизиса либо размножения поглощенных микробов.
Поглотительную способность фагоцитов (ПСФ) определяли по формуле:
где А — количество поглощенных на 30-й минуте микробов; Ь — число лейкоцитов в 1 мкл крови (в сотнях); 100 — число для уменьшения цифрового результата, используемое при исследовании крови с «фагоцитарным профилем»2.
Интенсивность поглощения фагоцитов (ИПФ) на 39, 90 и 120-й минутах вычисляли по отношению А к Р, где А — количество микробов, поглощенных на 30, 90 и 120-й минутах; Р — процент фагоцитов (сумма нентрофилов, эозинофилов и моноцитов) в лейкограмме на 30, 90 и 120-й минутах.
Отношением данных ИПФ 80 к ИПФ30 определялся тип реакции, который может быть завершенным (более 1), индифферентным (1) и незавершенным (менее 1) отношением данных ИПФ,20 к ИПФ30 уточнялся тип реакции и определялась ее степень.
1 При исследовании крови животных требуется 12% раствор.
2 У экспериментальных животных с «лимфоцитарным профилем» крови данное число не используется.
