CC BY
42
3. Б е з б о р о д к и н, Н.С. Определение экономической эффективности мероприятий в ветеринарной медицине: учеб.-метод. пособие / Н. С. Безбородкин, В. А. Машеро. - Витебск: ВГАВМ, 2009. - 40 с.
4. Б е л о в а, Н. Влияние пробиотиков и витамина С на использование питательных веществ корма / Н. Белова, О. Ежова, В. Корнилова // Птицеводство. - 2009. - № 5. - С. 16-17.
5. Б е л я е в а, С. Н. Профилактика стресса и иммунодефицитных состояний в промышленном птицеводстве биокорректором тимоген / С. Н. Беляева, Н. В. Безбородов // Ветеринарный вестник. - 2009. - С. 18-21.
6. П р у д ни к о в, А. В. Использование компьютерной программы ВЕТЭКОНОМ 2010» для определения экономической эффективности лечебных и профилактических мероприятий в ветеринарной медицине / А. В. Прудников, В. В. Максимович, В. С. Прудников - Витебск: ВГАВМ, 2012. - 20 с.
7. Сорбционные свойства хитозана и их применение при выращивании молодняка сельскохозяйственных животных и птиц / А. И. Абдулов [и др.]. // Основные проблемы ветеринарной медицины и стратегия борьбы с заболеваниями сельскохозяйственных животных в современных условиях: сб. науч. тр. / ГОУ Прикаспийского зонального науч.-исследов. вет. ин-та. - Махачкала, 2007. - С. 251-254.
УДК 636.5:611.4:619:616.98.578
МЕТОД МИКРОСКОПИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ЛАТЕНТНОГО ТЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИОННОЙ АНЕМИИ
ЦЫПЛЯТ
И. Н. ГРОМОВ, М. К. СЕЛИХАНОВА УО «Витебская ордена «Знак Почета» государственная академия ветеринарной медицины», г. Витебск, Республика Беларусь, 210026
А. С. АЛИЕВ
ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины», г. Санкт-Петербург, Российская Федерация, 196084
(Поступила в редакцию 31.01.2015)
Введение. Инфекционная анемия цыплят (ИАЦ) - контагиозная вирусная болезнь птиц раннего возраста, характеризующаяся поражением иммунной и сердечно-сосудистой систем [1, 2]. В настоящее время инфекционная анемия регистрируется во многих странах с развитым птицеводством, в том числе в Республике Беларусь, Российской Федерации и Украине [5]. В комплексе диагностических мероприятий особая роль отводится морфологическим методам исследования, результаты которых позволяют в предельно короткие сроки поставить предположительный диагноз на ИАЦ [7, 12]. Описанные в литературе морфологические признаки инфекционной анемии как при спонтанном
18
ее проявлении, так и при экспериментальном заражении цыплят, характеризуют острое течение данной болезни. Следует отметить, что в настоящее время практически во всех странах мира проводится перманентная вакцинация родительского поголовья против ИАЦ с целью создания напряженного трансовариального иммунитета у цыплят раннего возраста. На этом фоне у вакцинированных цыплят 20-30-дневного возраста очень часто регистрируется латентное (субклиническое течение ИАЦ). При этом характерные патологоанатомические и гистологические изменения не выявляются. Кроме того, инфекционная анемия очень часто протекает в ассоциации с другими вирусными болезнями с развитием тяжелого комбинированного иммунодефицита [1, 2].
Известно, что в патогенезе многих вирусных болезней большую роль играет вирусиндуцированный апоптоз клеток-мишеней. В работах B. M. Adair [7], J. A. Smyth et al. [9], S. H. Jeurissen et al. [8], H. M. Mathieu [11] показано, что вирус инфекционной анемии способен вызывать апоптоз тимоцитов (лимфоцитов тимуса) и гепатоцитов печени цыплят. Доказано, что явление вирусиндуцированного апоптоза ти-моцитов является значимым и достоверным морфологическим признаком ИАЦ. Известно, что специфические патогистологические изменения при ИАЦ развиваются сначала в костном мозге и крови, а лишь затем -в тимусе, бурсе Фабрициуса и других органах иммунитета.
Анализ источников. В исследованих отечественных и зарубежных авторов отсутствуют сведения по использованию световой микроскопии для выявления апоптозных телец при инфекционной анемии цыплят.
Цель работы - изучить морфологические изменения в костном мозге и крови цыплят при субклиническом течении инфекционной анемии цыплят.
Материал и методика исследований. Материалом для исследований служили цыплята, их трупы, кусочки органов, пробы крови, доставленные с диагностической целью в ФГОУ ВПО СПбГАВМ и УО ВГАВМ с птицефабрик мясного направления. Согласно анамнестическим данным, в хозяйствах наблюдается повышение заболеваемости и падежа птиц различных возрастных групп. Клинически у заболевших птиц отмечалось отставание в росте и развитии, взъерошен-ность перьевого покрова, апатия, общая анемия. Данные патологоана-томического вскрытия: постовариальная гипотрофия, дистрофия печени и почек, острая венозная гиперемия легких, признаки анемии. В хозяйствах, откуда поступила павшая птица, проводилась плановая профилактическая иммунизация против болезней Марека и Ньюкасла,
инфекционного бронхита и ИББ. Цыплята были получены от родителей, иммунизированных живой вакциной против ИАЦ.
Морфологическое исследование крови и костного мозга проводили в 5-, 7-, 9-, 14-, 20- и 30-дневном возрасте. Кровь получали из крыловой вены, а пунктат костного мозга - из верхней части диафиза плюс-невозаплюсневой кости с латеральной ее поверхности [6]. Мазки крови и костного мозга птиц готовили на тонких обезжиренных предметных стеклах, высушивали на воздухе, фиксировали в метаноле и окрашивали по Романовскому-Гимза [3]. Изучение мазков проводили в световом микроскопе с использованием иммерсионного объектива с большим увеличением.
Для гистологического исследования костного мозга отбирали кусочки трубчатых костей (по 20 проб в 5-, 7-, 9-, 14-, 20- и 30-дневном возрасте). Материал фиксировали 10 %-м раствором формалина в течение 24 часов, декальцинировали 1 н раствором уксусной кислоты (до размягчения кости), а затем обезвоживали в спирте и заливали в парафин общепринятым методом.
Срезы готовили на санном микротоме, депарафинировали в ксилоле и спирте, окрашивали гематоксилин-эозином, просветляли и заключали в бальзам [4]. Изучение препаратов костного мозга проводили в световом микроскопе с использованием иммерсионного объектива с большим увеличением. Устанавливали наличие апоптозных телец и патологических форм гемопоэтических клеток.
О наличии инфекции в птицехозяйствах оценивали по уровню специфических антител в сыворотке крови птицы в ИФА и выявлению генома вируса ИАЦ в ПЦР в реальном времени.
Цифровые данные обработаны статистически с использованием программы Microsoft Excel 2003.
Результаты исследований и их обсуждение. При проведении морфологического исследования крови и костного мозга цыплят нами установлен ряд специфических изменений, которые могут явиться достоверными критериями для постановки диагноза на ИАЦ. Так, уже в 5-дневном возрасте в гистологических срезах костного мозга цыплят отмечены признаки апоптоза гемопоэтических клеток, относящихся главным образом к эритроидному и гранулоцитарному росткам кроветворения. Вначале в пораженных клетках происходила конденсация и маргинация хроматина в ядре, которое становилось изрезанным или фрагментированным (рис. 1).
В последующем (в 7-14-дневном возрасте) отмечалось сморщивание клеток и образование апоптозных телец, состоящих из фрагментов цитоплазмы и ядра. При световой микроскопии сформированные апоптозные тельца имели вид округлых или овальных частиц с окси-фильной цитоплазмой и темно-синими фрагментами хроматина ядра (рис. 2, 3). В более поздние сроки отмечены деструкция и лизис апоптозных телец (рис. 4).
Рис. 1. Начало формирования Рис. 2. Костный мозг цыпленка
апоптозного тельца в костном мозге 9-дневного возраста. Наличие апоптозного
цыпленка 5-дневного возраста. тельца в группе клеток эритроидного
Биомед-6. Микрофото ростка. Гематоксилин-эозин
Рис. 3. Формирование апоптозных телец среди клеток эозинофильной группы в костном мозге цыпленка 9-дневного возраста. Гематоксилин-эозин. Биомед-6. Микрофото. Об. х 60, ок. х 10, бинок. х 1,25
Рис. 4. Деструкция и лизис апоптозных телец в костном мозге цыпленка 20-дневного возраста. Гематоксилин-эозин. Биомед-6. Микрофото. Об. х 40, ок. х 10, бинок. х 1,25
В костном мозге отдельных птиц 14-20-дневного возраста отмечались признаки атрофии миелоидной (кроветворной ткани). При этом кроветворные островки представлены лишь небольшими группами или диффузными скоплениями, которые локализуются вокруг синусоид-ных капилляров и артериол. Характерные полноценные кроветворные островки выявляются крайне редко. В таких случаях основные структурные изменения со стороны гемопоэтических элементов регистрировались чаще в центральной части органа и значительно реже -в пространствах под периостом. Наряду с процессами аплазии эритро-идного и гранулоцитарного кроветворения у 20- и 30-дневных птиц отмечалась выраженная гиперплазия клеток лимфоидного ряда. При этом крупноочаговые скопления лимфоцитов различной степени зрелости визуализировались в периферической части кости непосредственно под периостом.
При микроскопическом исследовании мазков, приготовленных из пунктатов костного мозга, нами были установлены сходные структурные изменения.
В мазках крови птиц апоптозные тельца в эритроцитах выявлялись в 7-14-дневном возрасте. Вначале они представляли собой сферические образования диаметром от 6 до 10 мкм. Цитоплазма просматривалась в виде тонкого неравномерного ободка, отличалась базофильно-стью, окрашиваясь в цвета от светло-голубого до темно-синего (рис. 5).
Рис. 5. Мазок крови цыпленка на Рис. 6. Мазок крови цыпленка
14-дневного возраста. Начальные этапы 20-дневного возраста. Дефинитивные формирования апоптозных телец. Окраска формы апоптозных телец. Окраска по
по Романовскому-Гимза. Биомед-6. Романовскому-Гимза. Биомед-6.
Микрофото. Об. х 100, ок. х 10, бинок. х 1,25 Микрофото. Об. х 100, ок. х 10, бинок. х 1,25
Большую часть таких образований занимало ядро с фрагментиро-ванным хроматином. Дефинитивные формы апоптозных телец представляли собой более крупные структуры округло-овальной формы. Цитоплазма таких телец была слабо базофильной. Фрагменты ядра отличались выраженной базофильностью, имели округлую форму, размеры варьировали от 0,4 до 2-3 мкм (рис. 6).
Наряду с появлением специфических апоптозных телец в крови цыплят нами также отмечены неспецифические изменения, свидетельствующие о развитии альтеративных и компенсаторно-приспособительных процессов в костном мозге. Некоторые из них (анизоцитоз; пойкилоцитоз; появление в мазках большого числа незрелых форм клеток эритроидного ряда - эритробластов, базофильных, полихрома-тофильных и оксифильных нормоцитов) описаны ранее [1]. Сведений о других изменениях морфологического состава крови в доступной отечественной и зарубежной литературе мы не нашли. Так, заражение цыплят цирковирусом, вызывающим ИАЦ, приводило к появлению патологических форм эритроцитов, имеющих перинуклеарные зоны просветления и оксифильные цитоплазматические включения. Изменения со стороны клеток тромбоцитарного ряда характеризовались появлением крупных экземпляров округлой формы, имеющих выраженную вакуолизацию цитоплазмы и мелкие оксифильные гранулы вокруг ядра. Инокуляция цыплятам цирковируса приводила также к появлению в крови больших зернистых лимфоцитов, имеющих морфологические признаки естественных киллерных клеток.
Выявление в мазках крови птиц и костного мозга апоптозных телец позволило поставить гистологический диагноз на латентное течение ИАЦ, который был подтвержден результатами других лабораторных исследований. Установлено, что при обнаружении в мазках крови и костного мозга цыплят 3-5 и более апоптозных телец было подтверждено наличие вируса ИАЦ в ПЦР.
Заключение. Результаты исследований свидетельствуют о том, что наличие специфических апоптозных телец в костном мозге и крови цыплят позволяет с высокой степенью достоверности выявить болезнь на ранних стадиях ее развития. Это позволяет диагностировать латентное течение инфекционной анемии, которое отличается отсутствием или слабым проявлением клинических признаков и патологоанатоми-ческих изменений и дифференцировать инфекционную анемию от болезней, протекающих с явлениями апластической анемии и иммунодефицита. Кроме того, процедура подготовки материала для световой
23
микроскопии менее затратная как во временном, так и материальном отношении, по сравнению с проведением электронномикроскопичес-кого и иммуногистохимического исследования.
ЛИТЕРАТУРА
1. Болезни домашних и сельскохозяйственных птиц / Б. У. Кэлнек [и др.]; под ред. Б. У. Кэлнека; пер. с англ. И. Григорьева. М.: АКВАРИУМ БУК, - 2003. - С. 850-870.
2. Инфекционная анемия цыплят / А. С. Алиев [и др.] // Ветеринарная медицина. -2011. - № 1. - С. 49-53.
3. К а р п у т ь, И. М. Гематологический атлас сельскохозяйственных животных / И. М. Карпуть. - Минск: Ураджай, 1986. - 183 с.
4. Микроскопическая техника: Руководство / Д. С. Саркисов [и др.]; под ред. Д. С. Саркисова, Ю. Л. Петрова. М.: Медицина, - 1996. - С. 453-473.
5. Серологический мониторинг инфекционной анемии цыплят и молекулярно-биологическая характеристика изолятов вируса / В. А. Лобанов [и др.] // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2003. - N° 2. - С. 66-69.
6. Способ получения пунктата костного мозга у птиц и изучение миелограммы при вакцинациях / В. С. Прудников [и др.] // Ученые записки УО ВГАВМ. Витебск, 2006. -Т. 42. - Вып.1. - Ч. 1. - С. 82-85.
7. A d a i r, B. M. Immunopathogenesis of chicken anemia virus infection / B. M. Adair // Dev. Comp. Immunol. - 2000. - Vol. 24 (2-3). - P. 247-255.
8. Chicken anemia virus causes apoptosis of thymocytes after in vivo infection and of cell lines after in vitro infection / S. H. Jeurissen // J. Virol. - 1992. - Vol. 66. - № 12. - P. 7383-7388.
9. Chicken anemia virus inoculated by the oral route causes lymphocyte depletion in the thymus in 3-week-old and 6-week-old chickens / J. A. Smyth [et al.] // Avian Pathology. -2006. - Vol. 35(3). - P. 254-259.
10. C h o m c z y n s k i, P. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thi-ocyanate-phenol-chloroform extraction / P. Chomczynski, N. Sacchi // Anal. Biochem. 1987. -Vol. 162. - № 1. - P. 156-159.
11. M a t h i e u, H. M. Chicken anemia virus induced apoptosis: underlying molecular mechanisms / H. M. Mathieu // Vet. Microbiology. - 2004. - Vol. 98, Issue 2. - P. 89-94.
12. Pathological and immunohistochemical study of chickens with co-infection of Marek's disease virus and chicken anaemia virus / Mohie Haridy [et al.] // Avian Pathology. - 2009. -Vol. 38(6). - P. 469-483.
УДК 636.2:612-014:578.08
ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ КЛЕТОЧНЫХ ФАКТОРОВ ЛОКАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ КОРОВ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ЛАКТАЦИИ
Н. Н. ЖЕЛАВСКИЙ Подольский государственный аграрно-технический университет, г. Каменец-Подольский, Хмельницкая обл., Украина, 32300
(Поступила в редакцию 29.01.2015) 24
