CC BY
347
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ МЕТОДELISPOT ДЛЯ ОЦЕНКИ... 55
УДК 616-097:616-006-085.371:611.018.83 И.Н. Михайлова, К.Д. Никитин, Н.Н. Петенко, К А. Парсункова, И А. Утяшев, М.А. Рубцова, Г.З. Чкадуа, К А. Барышников, Л.В. Демидов, А Ю. Барышников МЕТОД ELISPOT ДЛЯ ОЦЕНКИ ИММУННОГО ОТВЕТА НА ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ ВАКЦИНЫ НА ОСНОВЕ АУТОЛОГИЧНЫХ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК, НАГРУЖЕННЫХ ОПУХОЛЕВЫМ ЛИЗАТОМ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва Контактная информация: Михайлова Ирина Николаевна, кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник отдела биотерапии опухолей НИИ клинической онкологии адрес: 115478, Москва, Каширское ш., 24; тел. +7(495)324-90-34; e-mail: irmikhavlova@gmail.com Статья поступила: 01.09.2010, принята к печати 16.09.2010. Резюме Иммунотерапия - перспективный метод лечения злокачественных новообразований. Для оценки эффективности иммунотерапевтических препаратов требуются точные методы оценки иммунного ответа. Мы провели исследование иммунного ответа на терапию противоопухолевыми вакцинами на основе аутологичных дендритных клеток, нагруженных опухолевым лизатом, с целью оценить применимость метода ELISpot в условиях клинического исследования. В открытое одноцентровое клиническое исследование I фазы для оценки безопасности и эффективности терапевтической противоопухолевой вакцины на основе аутологичных ДК, нагруженных лизатом опухолевых клеток in vitro, были включены 15 больных диссеминированной меланомой кожи. Иммунный ответ выявлен у трети (5) больных, получавших вакцинацию, развитие иммунного ответа не коррелировало с клиническими изменениями. Отмечена связь между иммунным ответом и реакцией гиперчувствительности замедленного типа и увеличение частоты иммунного ответа у больных с низким уровнем опухолевого маркера S-100 (т.е. с наименьшей опухолевой нагрузкой). Ключевые слова: иммунный ответ, противоопухолевая вакцина, аутологичные дендритные клетки.
I.N. Mikhailova, K.D. Nikitin, NN. Petenko, К А. Parsunkova, 1А. Utvashev, М.А. Rubtsova, G.Z. Chkadua, КА. Baryshnikov, L.V. Demidov, А.Уи. Baryshnikov IMMUNE RESPONSE IN PATIENTS TREATED WITH DENDRITIC CELLS-BASED ANTICANCER VACCINE ESTIMATED BY ELISPOT N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center of RAMS, Moscow Abstract Immunotherapy of tumor is considered to be a promising approach for cancer treatment. The precise methods of immune response efficacy assessment are not fully characterized. We have conducted phase I single center open study to assess applicability of ELISpot method for immune response assessment in 15 melanoma patients treated with dendritic cells-based anticancer vaccine. Immune response was detected in 33 % (5) of patients. Here we show that the activation of immune response did not correlate to clinical response but to delayed hypersensitivity reaction development. Our observations indicate that ELISpot-detected immune response was more common in patients who had initially low S-100 marker level. Key words: immune response, anticancer vaccine, dendritic cells. Введение клетками, и предоставляет как качественную (тип продуцируемого вещества), так и количественную (число Иммунотерапия - перспективный метод лече- активированных клеток) информацию. ния злокачественных новообразований. Клиническое Метод ELISpot широко применяется в разра-исследование методов иммунотерапии затрудняется ботке противовирусных вакцин, но также нашел при-недостаточной чувствительностью традиционных ме- менение и в онкоиммунологии. тодов оценки ответа на лечения, используемых в ис- Для оценки применимости метода ELISpot в следованиях противоопухолевых препаратов. клинических исследованиях мы провели исследова- Метод ELISpot (Enzyme-Linked ImmunoSpot ние иммунного ответа на терапию противоопухоле-- твердофазная модификация метода иммунофермент- выми вакцинами на основе аутологичных дендритного анализа). Изначально ELISpot был разработан ных клеток, нагруженных опухолевым лизатом. Czerkinsky и соавт. в 1983 г. [4] для подсчета В-лим- фоцитов, продуцирующих специфические антитела, а Материалы и методы затем был адаптирован для разных задач, в особенности для идентификации и подсчета цитокин- Больные получали противоопухолевую вак-продуцирующих клеток с точностью вплоть до отдель- цину на основе ДК в адъювантном и терапевтиче-ных клеток. ELISpot позволяет визуализировать веще- ском режиме внутрикожно в начальной (стартовой) ство, продуцируемое отдельными активированными дозе 1-5 х 106 ДК.
№ 4/том 9/2010 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
56 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ МЕТОД ELISPOT ДЛЯ ОЦЕНКИ...
Интервалы между введениями составляли 2 раз больше, чем до вакцинации, у 1 больной - в 5 недели. Вакцинация продолжалась вплоть до разви- раз (во 2-й точке), у 1 больного - в 6 раз (в 1-й точ-тия прогрессирования (рис. 1). Оценка иммунного ке). У больных с иммунным ответом, выявленным в ответа на вакцинацию осуществлялась с помощью соответствии с предложенным критерием, на про-определения числа лейкоцитов периферической кро- тяжении вакцинации отмечено нарастающее повы-ви, активирующихся в ответ на стимуляцию лизатом шение числа лейкоцитов, активирующихся на сти-аллогенных опухолевых клеток линии mel Kor, мето- муляцию лизатом (рис. 3). дом ELISpot. Для этого у больных перед 1-й, 3-й, 5-й У части больных наблюдалось развитие реи 10-й вакцинациями производился забор образцов акции гиперчувствительности замедленного типа периферической крови (4-10 мл) - точки 0; 1; 2 и 3 (ГЗТ), проявлявшейся преимущественно измене -(рис. 2). Образцы крови набирались в пробирку Vacu- ниями в месте введения вакцины - покраснение, tainer (Becton Dickinson, США) с антикоагулянтом и отек, зуд, жжение. В частности, ГЗТ наблюдалось у отправлялись в лабораторию, где в течение суток из 6 (40 %) из 15 больных, у которых был оценен им-них выделялись и замораживались лейкоциты. После мунный ответ по данным реакции ELISpot. Реакция завершения вакцинотерапии образцы лейкоцитов, ГЗТ наблюдалась достоверно чаще у больных с размораживались, и оценивалось число лейкоцитов, иммунным ответом (p=0,02; точный односторонний активирующихся в ответ на стимуляцию лизатом ал- критерий Фишера). Отмечено выраженное увели-логенных опухолевых клеток линии mel Kor. Актива- чение числа клеток, продуцирующих ИФН-у в от-ция оценивалась по продукции ИФН-у лейкоцитами с вет на стимуляцию опухолевым лизатом, у больных помощью метода ELISpot. Для стимуляции лимфоци- с ГЗТ на протяжении всей вакцинации, в то время тов в реакции ELISpot использовался лизат опухоле- как у больных без ГЗТ на фоне вакцинаций увели-вых клеток меланомы линии mel Kor. В качестве от- чения этого показателя не происходило. Число рицательного контроля оценивалась фоновая секре- ИФН-у-продуцирующих клеток у больных с реакция ИФН-у не стимулированными лейкоцитами. По- цией ГЗТ в точке 1 по сравнению с точкой 0 увели-ложительным контролем служили лейкоциты, акти- чилось в 6 раз, в точке 2 — более чем в 9 раз, в точ-вированные неспецифическим стимулятором фитоге- ке 3 - почти в 74 раза. магглютинином (ФГА). Использовалась методика, Прогрессирование заболевания у больных, описанная в литературных источниках, с незначи- которым была проведена оценка иммунного ответа, тельными модификациями. Учет результатов реакции наступило у 10 из 15 человек. Среднее время до проводили с помощью прибора AID EliSpot Reader прогрессирования среди больных, у которых был System Standard Resolution (AID Diagnostika GmbH, выявлен иммунный ответ, составило 9,6+6,2 мес Германия) и программного обеспечения Aid EliSpot (3+26 мес.; медиана 11 мес.; n = 5), у больных без software Version 5.0. Для повышения точности иссле- иммунного ответа - 6,7+3 мес (1+11 мес.; медиана 7 дования и исключения воздействия случайных факто- мес.; n = 10; рис. 4). ров анализ каждой пробы (не стимулированные лим- У 15 больных, которым удалось оценить иммунный фоциты, лимфоциты + лизат и лимфоциты + ФГА) в ответ, был исследован уровень опухолевого марке-каждой точке (0; 1; 2 или 3) повторялся по возможно- ра S-100. Известно, что данный маркер свидетельств 6 раз, но не менее 3 раз; в зависимости от доступ- ствует о прогрессировании заболевания и, в целом, ного количества лимфоцитов, максимальное число об опухолевой нагрузке у больных меланомой [5-7; повторов доходило у некоторых больных до 12. Ста- 9]. Уровень маркера исследовался 2 раза - до вак-тистический анализ результатов исследования прово- цинации и во время нее (3 точка во время вакцина-дили с помощью программы SPSS Statistics v.17.0. ции). В нашем исследовании средний уровень S- 100 у больных до начала вакцинации (n = 15) со-Результаты ставил 75,5+53,7 нг/л (0,1+208,9 нг/л; медиана 69,1 нг/л), в процессе вакцинации - 131,4+83,2 нг/л Всего в данный анализ включено 15 больных (4,1+308,1 нг/л; медиана 95,7 нг/л) при норме 54 - 8 (53 %) мужчин и 7 (47 %) женщин. Средний воз- нг/л. Таким образом, отмечена тенденция к увели-раст 53 года (23+89; медиана 53). чению уровня S-100, что согласуется с общей ха-Для исключения неспецифической (фоно- рактеристикой группы (больные поздними стадия-вой) активации, не связанной со стимуляцией кле- ми меланомы) и клиническими данными (прогрес-ток лизатом, была рассчитана разница (D) между сирование заболевания у 2/3 больных на протяже-средним числом клеток на 100 000 лейкоцитов, ак- нии периода наблюдения). Можно отметить, что у тивирующихся в ответ на стимуляцию лизатом больных с выявленным иммунным ответом уровень (Л/газ), и числом клеток, продуцирующих ИФН-у в S-100 изначально и в процессе вакцинации был отсутствие стимуляции (Лн/ст): ниже, то есть можно предположить, что вакцинотерапия более эффективна у больных с исходно низ-D — N — N кой активностью заболевания. У больных без им-лиз н/ст мунного ответа произошло статистически значимое увеличение уровня S-100 (рис. 5). Критерием наличия иммунного ответа на вакцинацию мы приняли увеличение разницы (D) ОбСуЖдение между средним числом клеток на 100 000 лейкоцитов, активирующихся в ответ на стимуляцию лиза- Наше исследование было посвящено воз-том (Ллиз), и числом клеток, продуцирующих ИФН- можностям метода ELISPot для оценки иммунного у в отсутствие стимуляции (Nн/ст), в пр°цессе вак- ответа на вакцинацию противоопухолевой вакци-цинации. Число больных с иммунным ответом (у ной на основе аутологичных ДК, нагруженных которых D хотя бы в одной из точек в процессе опухолевым лизатом. Метод ELISPot - удобный и вакцинации [Д; Д или Д] оказалось больше чем надежный способ оценки иммунного ответа. Метод D до вакцинации [D0]), составило 5 из 15 (33%). отличается высокой точностью (1 клетка на 100 000 При этом у 1 больного максимальное (в 3-й точке) и менее), что позволяет оценивать изменения в число ИФН-у-продуцирующих клеток оказалось в 8 уровне отдельных клеток.
№ 4/том 9/2010 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
Рис. 1. Схема клинического исследования I фазы для оценки безопасности и эффективности терапевтической противоопухолевой вакцины на основе аутологичных дендритных клеток (ДК), нагруженных лизатом опухолевых клеток in vitro, для адъювантной терапии диссеминированной меланомы кожи IV ст.
Опухолевые клетки линии MelKor
Выделение и заморозка лейкоцитов
Опухолевый лизат * (стимулятор)
\
Исследование иммунного ответа методом ELISpot
Рис. 2. Схема исследования иммунного ответа у больных меланомой кожи IV ст., получающих иммунотерапию вакциной на основе дендритных клеток.
58 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ МЕТОД ELISPOT ДЛЯ ОЦЕНКИ...
P>0,05 (тест Фридмана)
6ДЭ
Иммунного ответа нет Иммунный ответ есть
Точка 0 Точка 1 Точка 2 Точка 3
(перед 1-й (перед 3-й (перед 5- (перед 10-й вакц.) вакц.) вакц.) вакц.)
О = МЛИз- N/ст, где
•Млиз- среднее число ИФН-у-продуцирующих клеток на 100 000 лейкоцитов (опыт) • Мн/ст - среднее число ИФН-у-продуцирующих клеток на 100 000 лейкоцитов (фоновая секреция)
Рис. 3. Изменение числа лейкоцитов, активирующихся в ответ на стимуляцию опухолевым лизатом, у больных меланомой кожи, в процессе иммунотерапии вакциной на основе аутологичных дендритных клеток.
Рис. 4. Время до прогрессирования у больных меланомой кожи, получавших иммунотерапию вакциной на основе аутологичных дендритных клеток.
Рис. 5. Изменение уровня Б-100 у больных меланомой кожи, получавших иммунотерапию вакциной на основе аутологичных дендритных клеток.
Применение метода ELISpot дало ряд результатов, ценных для изучения дендритноклеточ-ных противоопухолевых вакцин.
Согласно литературным данным, иммунный ответ методом ELISpot выявляется у 30-70% больных, получающих иммунотерапию противоопухолевыми вакцинами на основе ДК [3; 8]. Такой значительный разброс связан с небольшим числом больных в большинстве исследований и различными, зачастую принципиально отличными вариантами противоопухолевых вакцин, оценивавшихся в исследованиях.
Результаты нашего исследования иммунного ответа у больных, получающих иммунотерапию, в общем и в целом сопоставимы с результатами других сходных исследований: увеличение числа клеток, активирующихся в ответ на стимуляцию опухолевыми антигенами в процессе иммунизации вакцинами на основе аутологичных ДК, наблюдалось у трети больных поздними стадиями мелано-мы (у 5 из 15 больных).
Корреляции между клинической эффективностью вакцины и иммунологическими реакциями выявлено не было, что, впрочем, неудивительно с учетом поздней стадии заболевания у включенных больных. Отсутствие связи между иммунологической эффективностью вакцинотерапии и клиническими изменениями отмечают и некоторые зарубежные исследователи [3]. Можно отметить, что у больных с выявленным иммунным ответом уровень маркера S100 изначально и в процессе вакцинации был ниже, то есть можно предположить, что вакцинотерапия более эффективна у больных с исходно низкой активностью заболевания.
Важным представляется вопрос выбора антигена для стимуляции иммунных клеток в реакции ELISpot. В нашем исследовании в качестве источника антигенов был выбран лизат опухолевых клеток линии mel Kor.
Линия mel Kor получена в РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН и отличается быстрым ростом, подвергается трансфекции различными генами [1]. Клетки линии mel Kor выбраны в качестве стимулятора в связи с тем, что они экспрессируют большее число меланомных опухолеассоциированных антигенов; таким образом, вероятность развития «перекрестной» реакции между Т-лимфоцитами больных, специфичных к ОАА опухоли больного, и ОАА, имеющимися в лизате клеток линии mel Kor, представляется наибольшей.
Отличительной особенностью клеток mel Kor является отсутствие на их поверхности молекул MHC I и II классов. Преимущество подобного подхода в том, что ДК, нагруженные цельным белком, могут быть более эффективны для индукции антиген-специфического иммунного ответа.
Этот иммунный ответ при этом может быть направлен против широкого спектра антигенов, независимо от HLA.
Исследования других авторов подтверждают развитие клинического ответа при использовании цельноклеточного лизата [8] и недостаточную эффективность применения HLA-рестрицированных пептидов, возможно, в связи с нехваткой активации CD4+ Т-лимфоцитов [2]. В будущих исследованиях представляет интерес использование для стимуляции иммунных клеток в реакции ELISpot отдельных антигенных пептидов.
60
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
МЕТОДELISPOT ДЛЯ ОЦЕНКИ..
Заключение
Метод ЕЫБро! - удобный способ оценки иммунного ответа у онкологических больных, получающих иммунотерапевтические препараты.
Даже у больных поздними стадиями злокачественных новообразований он позволяет выявить изменения в числе иммунореактивных клеток.
Результаты исследования согласуются с другими иммунологическими показателями, отражающими общую иммунореактивность организма и опухолевую нагрузку, но, в отличие от них, дают представление о развитии опухолеспецифиче-ских реакций.
Отличительной особенностью метода является его относительная простота и субъективность, позволяющая получать воспроизводимые результаты, и удобство применения в рамках клинических исследований, когда количество исследуемого материала ограничено. Значительной проблемой остается отсутствие единых стандартов проведения исследований с помощью метода ЕЫБро!:, не позволяющее сравнивать между собой результаты разных авторов. В клинических исследованиях противоопухолевых вакцин на основе дендритных клеток метод ЕЫБро! оказывается незаменимым инструментом оценки даже самых минимальных изменений в числе и функциональной активности опухолеспецифических иммунных клеток.
Работа выполнена при финансовой поддержке Правительства Москвы в рамках научно-технической программы «Разработка и внедрение в медицинскую практику новых методов и средств диагностики и лечения онкологических и других заболеваний».
Литература
1. Михайлова И.Н., Демидов Л.В, Барышников А.Ю. и др. Клинические испытания аутологичной вакцины на основе опухолевых клеток, модифицированных геном tag-7 // Сибирский онкологический журнал. - 2005. - № 1. - С. 23-7.
2. Butterfield L.H., Ribas A., Dissette V.B. et al. A phase I/II trial testing immunization of hepatocellular carcinoma patients with dendritic cells pulsed with four alpha-fetoprotein peptides // Clin Cancer Res. -2006. - 12. - P. 2817-25.
3. Butterfield L.H., Comin-Anduix B, Vujanovic L. et al. Adenovirus MART-1-engineered autologous dendritic cell vaccine for metastatic melanoma // J Immunother. - 2008. - 31(3). - P. 294-309.
4. Czerkinsky C, Nilsson L., Nygren H. et al. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells // J Immunol Methods. - 1983. - 65(1-2). - P. 109-21.
5. Guo H.B., Stoffel-Wagner B, Bierwirth T. et al. Clinical significance of serum S100 in metastatic malignant melanoma // Eur J Cancer. - 1995. - 31A. - P. 924-8.
6. Hauschild A. Predictive value of serum S100B for monitoring patients with metastatic melanoma during chemotherapy and/or immunotherapy // Br J Dermatol. - 1999. - 140. - P. 1065-71.
7. Kruijff S., Bastiaannet E., Kobold A.C. et al. S-100B concentrations predict disease-free survival in stage III melanoma patients // Ann Surg Oncol. - 2009. - 16(12). - P. 3455-62.
8. Palmer D.H., Midgley R.S., Mirza N. et al. A phase II study of adoptive immunotherapy using dendritic cells pulsed with tumor lysate in patients with hepatocellular carcinoma // Hepatology. - 2009. - 49(1). - P. 124-32.
9. Smit L.H., Korse C.M., Hart A.A. et al. Normal values of serum S-100B predict prolonged survival for stage IV melanoma patients // Eur J Cancer. - 2005. - 41. - P. 386-92.
НАУЧНЫЕ ЖУРНАЛЫ РОНЦ ИМ. Н.Н. БЛОХННА РАМН
