CC BY
85
ДИНАМИКА ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ОРГАНИЗМА ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ СУБЭКСТРЕМАЛЬНЫХ И ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ ФАКТОРОВ В НОРМЕ И ПАТОЛОГИИ
УДК 612.015
МЕТИЛАРГИНИНЫ У КРЫС В ГЛИЦЕРИНОВОЙ МОДЕЛИ ОСТРОЙ ПОЧЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ
Михаил Абрамович ГИЛИНСКИЙ1, Роман Иделевич АЙЗМАН2,
Галина Анатольевна КОРОЩЕНКО2, Татьяна Вячеславовна ЛАТЫШЕВА1, Татьяна Ивановна НОВОСЕЛОВА3, Галина Михайловна ПЕТРАКОВА1,
Роман Александрович СУХОВЕРШИН1, Михаил Альбертович СУБОТЯЛОВ2
1НИИ физиологии СО РАМН 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 4
2ГОУ ВПО Новосибирский государственный педагогический университет 630126, г. Новосибирск, ул. Вилюйская, 28
3ЗАО Научно-производственная фирма «Новь»
630005, г. Новосибирск, ул. Карамзина, 53
Метилированные формы Ь-аргинина играют важную роль в эндогенной регуляции биодоступности оксида азота (N0). Хроническая почечная недостаточность приводит к накоплению метиларгининов в крови и снижению синтеза N0. С этим связывают ускоренное развитие атеросклероза и сердечно-сосудистых патологий. Мы проанализировали содержание метиларгининов в крови и моче крыс при острой почечной недостаточности (ОПН), индуцированной внутримышечным введением 50%-ного раствора глицерина. Исходно весьма низкая концентрация асимметричного диметиларгинина (АОМА) в моче при ОПН многократно возрастала. Это не отразилось на уровне АОМА в крови. Напротив, концентрация симметричного диметиларгинина (8ОМА) в моче при ОПН снижалась, а в крови увеличивалась (на уровне отчетливой тенденции). Возросла и концентрация в крови моно-метиларгинина (ММА). Биологически активные добавки (БАД) цеолиты и «Теджас», применявшиеся до ОПН и на ее фоне, нормализовали уровень метиларгининов. Контраст в почечной реакции относительно одинаковых по составу и молекулярному весу веществ (АОМА и 8ОМА) может служить инструментом для расшифровки механизма избирательной экскреции.
Ключевые слова: острая почечная недостаточность, глицерин, оксид азота, диметиларгинины, моча, плазма, крысы.
Оксид азота (N0) играет чрезвычайно важную роль в функционировании почек. N0 возникает в результате ферментативного преобразования Ь-аргинина в Ь-цитруллин при помощи фермента N0-синтазы. Разрегулированность системы N0 может не оказывать деструктивного влияния в отсутствие других дестабилизирующих факторов. Так, одномоментное подавление активности N0-синтазы не меняет скорость гломерулярной фильтрации (ГФ) у нормальных крыс, но резко снижает последнюю у крыс-диабетиков [1]. Защитная функция N0 в отношении структуры почек подтверждается тем, что полиморфизм N0-синтазы,
определяющий снижение синтеза NO в экспериментах in vitro, проявляется необычно часто в некоторых популяциях пациентов с почечной недостаточностью в терминальной стадии [2].
Одной из важнейших характеристик функционирования системы NO является уровень метилированных производных L-аргинина — мономе-тиларгинина (MMA), асимметричного (ADMA) и симметричного (SDMA) диметиларгининов. ADMA и MMA являются конкурентными блокаторами NO-синтазы. SDMA, изомер ADMA, не влияет на активность фермента. По последним данным, он регулирует трансмембранный транспорт аргинина.
Гилинский М.А. — д.б.н., зав. лабораторией, e-mail: m.a.gilinsky@physiol.ru Айзман Р.И. — д.б.н., проф., зав. кафедрой, e-mail: roman.aizman@ngs.ru Корощенко Г.А. — к.б.н., доцент, e-mail: svyatashg@mail.ru Латышева Т.В. — н.с., e-mail: latsheva96@mail.ru Новоселова Т.И. — генеральный директор, e-mail: mobilti@mail.ru Петракова Г.М. — мл.н.с., e-mail: gpetrakova@hotmail.com Суховершин Р.А. — мл.н.с., e-mail: suhovershin@physiol.ru Cуботялов М.А. — к.б.н., доцент
Концентрация MMA в крови человека оказалась на порядок ниже, чем ADMA, и в большом числе работ MMA как регулятор синтеза NO во внимание не принимается, см. обзоры [З—5].
ADMA является сильным эндогенным регулятором синтеза NO. Он служит «одним из наиболее интригующих маркеров риска прогрессирования болезней сердечно-сосудистой и почечной систем» [6]. Установлено, что концентрация ADMA, 80 % которого элиминируется за счет фермента диметил аргинин - диметиламиногидролазы, воз -
растает у человека и животных при хронической почечной недостаточности (ХПН). Концентрация же SDMA, который выводится только с мочой, при ХПН, а особенно в ее терминальной стадии, нарастает многократно.
Что касается острой почечной недостаточности (ОПН), то работ по исследованию метилар-гининов почти нет. Основные наблюдения проведены на фоне экстирпации почек целиком или частично [7, 8]. Вместе с тем представляет интерес информация об изменении содержания метилар-гининов в моделях ОПН с сохранными почками и с применением средств, по данным литературы и клиническим наблюдениям, улучшающих функции почек. Одной из приемлемых моделей такого типа послужила глицериновая модель ОПН. Задачей настоящей работы было определить характер изменений метиларгининов в этой модели ОПН. Мы попытались также оценить влияние на уровень метиларгининов препаратов, в отношении которых есть опыт [9] позитивного влияния на функции почек в клинике и в эксперименте — цеолитов и БАДа «^джас».
Материал и методы
В работе использовано З0 взрослых крыс популяции Вистар массой 200—2З0 г. Содержание животных и процедуры эксперимента соответствовали принципам гуманности, изложенным в директивах Европейского Сообщества (86/609/ЕС) и одобренным Комитетом по биомедицинской этике НИИ физиологии СО РАМН. Животные были поделены на 4 группы: 1) интактные крысы (группа «контроль»); 2) крысы, у которых моделировалась ОПН (группа «ОПН»); З) крысы с ОПН, получавшие цеолиты (группа «ОПН + цеолиты»); 4) крысы с ОПН, получавшие «^джас» (группа «ОПН + ‘Тедж^”»). При формировании ОПН животные в течение 24 часов до инъекции глицерина лишались доступа к воде. Затем в бедренные мышцы обеих конечностей крыс экспериментальных групп вводили 50%-ный раствор глицерина на 0,9%-ном растворе NaCl из расчета 10 мл на 1 кг массы тела. Животным контрольной группы вводили раствор Рингера в том же объеме. После инъекции растворов крысы получали свободный доступ к воде и пище.
На третьи сутки эксперимента проводили исследование функций почек с анализом фоновых
проб мочи, собранных в метаболических клетках за 15 часов наблюдения. После этого под эфирным наркозом из нижней полой вены забирали кровь для последующего анализа физико-химических показателей. В работе проанализированы эффекты активированных цеолитов Холинского месторождения (фракция 80—150 мкм, поставка НПФ «Новь») и биодобавки «^джас» (растительный состав: кориандр, фенхель, кумин), поставленной Новосибирским государственным педагогическим университетом. Цеолиты давались с пищей в объеме 5 % от массы корма в течение З дней до и З дней после формирования ОПН, «^джас» — так же, в объеме 2 %.
Содержание L-аргинина и его метилированных производных определялось в плазме и моче по методике ^рлинка [10, 11]. Процедура выполнялась в З этапа: 1) выделение основных аминокислот путем твердофазной экстракции; 2) де-риватизация ортофталевым альдегидом; З) анализ при помощи высокоэффективной хроматографии с флуоресцентной детекцией. Детали работы приведены ниже.
Образец плазмы или мочи центрифугировали 6—8 мин при 8—10 тыс. g. 200 мкл супернатанта разбавляли до 1 мл 0,9%-ным раствором NaCl, за-буференным фосфатом натрия до pH 7,4, и пропускали через концентрирующий патрон с катионитом («Oasis MCX», З0 мг, 1 мл, «Waters», США), предварительно промытый 1 мл метанола и 1 мл 50 мМ фосфатного буфера (pH 7). После нанесения образца картридж мыли 1 мл метанола и 1 мл соляной кислоты. Вещества элюировали раствором, состоявшим из воды, метанола и аммиака в соотношении 5:4:1. К элюенту добавляли 50 мкл 1 М гидроокиси натрия. Элюат высушивали на водяной бане при температуре 60—70 °С в токе азота.
В день анализа сухой остаток растворяли в 200 мкл воды. К 50 мкл раствора добавляли 50 мкл рабочего раствора дериватизатора. Маточный раствор дериватизатора состоял из 5 мг ортофталево-го альдегида, 100 мкл метанола, 900 мкл борного буфера (pH 9,5) и 15 мкл меркаптопропионовой кислоты. Для приготовления рабочего раствора маточный разбавлялся борным буфером в 5 раз в день эксперимента. Через 8—10 мин реакции к смеси образца и дериватизатора добавляли 50 мкл 0,2 М фосфата калия для закисления раствора с целью сбережения колонки.
20 мкл дериватизированного образца инжектировали в хроматограф. Хроматограф состоял из 2 насосов «LC-10ADvp», аутоинжектора «SIL-10Advp», контроллера «SCL-10Avp» и флуоресцентного детектора «RF-10Axl» («Shimadzu», Япония). Длина волны возбуждения составляла в детекторе З40 нм, эмиссии — 455 нм. Для разделения пиков использовали колонку С18, 100 x 2 мм, З мкм («Phenomenex», США). В состав элюента входили фосфатный буфер (pH 7,0) и ацетони-
трил (6,4 %). Скорость подачи элюента составляла 200 мкл/мин. Второй насос подавал смесь воды и ацетонитрила (1:1) для быстрой промывки колонки после выхода исследуемых веществ. Время выхода последнего метиларгинина составляло 16— 18 мин. Полное время анализа — 27 мин. Сквозная чувствительность по концентрациям ADMA была на уровне 0,01—0,05 мкмоль/л. Хроматограммы накапливались и обрабатывались программой «LC solution» («Shimadzu»).
Содержание натрия и калия определялось методом пламенной фотометрии на фотометре «Flapho» (Германия), а концентрация креатини-на — спектрофотометрически на спектрофотоко-лориметре «Spekol» (Германия) при длине волны 495 ± 5 нм.
Результаты
Статистические расчеты для сопоставления результатов между группами животных проведены с использованием непараметрических критериев Колмогорова — Смирнова или Манна — Уитни для независимых выборок при уровне значимости
0,05. Расчет средних значений и ошибок средних производился из показателей средних и дисперсий по описательной статистике для непараметрических распределений. Объем экскретируемой мочи на 3 сутки после введения глицерина увеличился с 3,9б ± 0,55 в контроле до 9,24 ± 1,78 мл/15 ч при ОПН (р < 0,01). На фоне обоих препаратов экскреция мочи упала, но только на фоне БАДа «Теджас» — значимо (до 5,2 ± 0,8; р < 0,05). При ОПН существенно сократилась экскреция натрия (с 120 ± 40,14 ммоль/л в контроле до 25,6 ± 5,47 при ОПН, p < 0,05) и калия (соответственно, с 208,9 ± 28,5 до 87,9 ± 9,2 ммоль/л, р < 0,01).
В этой серии при ОПН значимо, хотя и не очень сильно, выросла концентрация креатинина плазмы (с 0,99 І 0,07 мг/100 мл в контроле до 1,27 І 0,09 мг/100 мл, p = 0,019). Основное внимание было уделено метиларгининам.
Распределения значений содержания аргинина и почти всех метиларгининов не были нормальными. В связи с этим в работе использовались приемы непараметрической статистики. Tем не менее, для удобства данные представлены в таблице как M І m, где M — среднее арифметическое, m — ошибка среднего. При анализе плазмы Kruskal — Wallis ANOVA продемонстрировала достоверный эффект группы для MMA, уровень которого у крыс, в отличие от людей, близок к уровням диметиларгининов H (3, N = 28) = 11,61; p = 0,0089. Апостериорный анализ показал, что этот эффект проявляется за счет снижения уровня MMA в крови при действии цеолита и БАДа <^ед-жас» (табл.). Достоверных различий в концентрациях L-аргинина, ADMA и SDMA между группами контроля и ОПН в плазме не обнаружено, и хотя численно уровень SDMA плазмы при ОПН оказался много выше контрольного, но различия были недостоверны.
ANOVA анализ выявил эффект группы для ADMA в моче H (3, N = 27) = 9,28; p = 0,0258. Как показывает таблица, уровень ADMA в моче контрольных животных чрезвычайно мал. При ОПН он достоверно возрастает более чем в 10 раз. Как цеолиты, так и «^джас» оказывают нормализующее влияние, но оно остается на уровне тенденции. Концентрация MMA в моче также сдвигается препаратами в сторону контрольных значений. Однако сдвиги содержания MMA до-
Таблица
Изменение содержания метиларгининов (мкмоль/л) при острой почечной недостаточности (ОПН) и под влиянием цеолитов и БАДа «Теджас» (M ± m)
Показатель Группа животных
Контроль ОПН ОПН + цеолит ОПН + «Теджас»
Плазма L-аргинин 161,437 + 6,458 161,626 + 17,406 169,457 + 21,545 154,434 + 16,152
MMA 0,763 + 0,079 0,874 + 0,0802 0,557 + 0,035## 0,563 + 0,035##
ADMA 0,603 + 0,034 0,663 + 0,0798 0,657 + 0,064 0,583 + 0,0350
SDMA 0,248 + 0,020 1,392 + 0,550 1,516 + 0,602 1,332 + 0,674
Моча L-аргинин 65,695 + 7,77 52,993 + 10,287 70,493 + 9,958 74,011 + 9,113
MMA 1,636 + 0,404 1,282 + 0,178 1,663 + 0,105# 1,785 + 0,311#
ADMA 0,135 + 0,036 1,880 + 0,79** 0,985 + 0,262 0,578 + 0,348
SDMA 11,981 + 4,272 6,898 + 2,290 18,029 + 2,974# 18,083 + 5,317#
Примечание: ** — различия с уровнем контроля достоверны при р < 0,01; различия с уровнем ОПН достоверны:
# — при р < 0,05, ## — при р < 0,01.
стоверны по отношению к уровню, выявленному для группы ОПН. Наконец, концентрация ББМЛ в моче крыс группы ОПН почти в 2 раза ниже, чем в контроле (различия недостоверны). Препараты оказывали на концентрацию ББМЛ нормализующий эффект, хотя она достоверно превышала уровень при ОПН. В этой работе не отмечалось изменений содержания Ь-аргинина по сравнению с контролем.
Следует отметить также, что одним из наиболее ярких следствий ОПН был резкий рост числа корреляций между содержанием аргинина и ме-тиларгининов (плазмы и мочи) с одной стороны и исследованными объемными и биохимическими показателями мочи. У контрольных животных обнаружены только значимые корреляции концентрации аргинина плазмы с показателями диуреза и экскреции солей, а также содержания ММА и калия плазмы. Всего в контроле найдено 5 корреляций (при уровне достоверности 0,05). При ОПН корреляций стало 18 (6 по метиларгининам плазмы и 12 — мочи). Корреляций содержания аргинина с другими показателями не наблюдалось ни в одном опыте с ОПН. В этой серии экспериментов применение цеолитов не снизило количество корреляций. Назначение «Теджаса» уменьшило их число до 12.
Обсуждение
Интересно, что аргинин, ЛОМЛ и ММЛ не выявили тенденции к накоплению в крови при ОПН. Такая яркая тенденция проявилась лишь в отношении ББМЛ. В этом свете понятно определение ББМЛ как маркера функциональной активности почек. Именно на ББМЛ значимо сказалось действие биодобавок, увеличивших его уровень в моче даже выше значений контроля (табл.). О влияниях ММЛ на синтез N0 известно мало. У человека его концентрация в крови на порядок ниже, чем диметиларгининов. Именно поэтому ММЛ иногда используется в качестве внутреннего стандарта [10, 11]. У крыс, как показывают наши измерения, концентрации моно- и диметиларгининов сходны. Биодобавки достоверно изменили и концентрацию ММЛ в плазме в сторону значений контроля.
Сегодня нет ясного ответа на вопрос, насколько реально воспроизводимы изменения в числе корреляций между физиолого-биохимическими параметрами организма при действии деструктивных факторов. Тем более нельзя охарактеризовать механизм, определяющий количество корреляций. Однако вопрос представляется интересным, поскольку подобные наблюдения повторяются. Одна из возможных причин — синхронное действие стрессирующего или патологического фактора на многие измеряемые параметры.
Проведенные эксперименты показали, что инъекция глицерина приводит к появлению признаков ОПН. И хотя в этой серии указанные признаки не были выражены ярко, ОПН сопровожда-
лась специфическими изменениями экскреторной функции почек и содержания метиларгининов. Для ADMA характерны весьма низкие величины экскреции у интактных крыс [12]. Экскретируемая фракция ADMA и SDMA, по данным литературы, составляет у крыс 1,1 и 71,2 %, у человека 68,2 и 71 %, наконец, у мышей 35,1 и 53,1 % соответственно. При удалении некоторого (даже значительного) объема почек выделение ADMA с мочой у крыс возрастает многократно [7].
Мы также наблюдали этот эффект в использованной модели ОПН. Здесь, однако, следует отметить следующее. Во-первых, наш опыт свидетельствует о том, что модель сама по себе обеспечивает обратимые изменения почти всех исследуемых функций на 5—7 сутки. Во-вторых, несравнимо более низкая, чем у человека, величина экскретируемой фракции ADMA, с одной стороны, ослабляет соответствие анимальной модели человеческой реальности, но с другой — открывает дополнительные возможности для анализа механизма почечной селекции. Действительно, ADMA и SDMA составлены из одних и тех же элементов и имеют одинаковый молекулярный вес. Различие структуры состоит только в положении одной из двух метильных групп. Но ADMA в норме у крыс почти не экскретируется, а весь SDMA элиминируется только с мочой. Возможно, эти факты помогут определить механизм, позволяющий производить столь контрастный отбор для экскреции диметиларгининов.
Заключение
В отличие от SDMA, лишь незначительное количество ADMA экскретируется в контроле у крыс с мочой. На фоне ОПН, индуцированной инъекцией глицерина, экскреция ADMA возрастает многократно.
Применение цеолитов и БАДа «^джас» способствует нормализации концентраций SDMA в моче и MMA в плазме, измененных при ОПН, что выражается в смещении их значений в сторону контроля.
ОПН существенно увеличивает количество корреляционных связей между содержанием ме-тиларгининов и биохимическими параметрами плазмы и мочи.
Благодарности
Работа поддержана грантом РФФИ 08-04-00951.
Список литературы
1. Thomson S.C., Deng A., Komine N. et al. Early diabetes as a model for testing the regulation of juxtaglomerular NOS I // Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 2004. 287. F732-F738.
2. Noiri E., Satoh H., Taguchi J. et al. Association of eNOS Glu298Asp polymorphism with end-stage renal disease // Hypertension. 2002. 40. 535—540.
3. Boger R.H. Asymmetric dimethylarginine, an endogenous inhibitor of nitric oxide synthase, explains the «L-arginine paradox» and acts as a novel cardio-
vascular risk factor // Nutrition. 2004. 134. 2842S— 2847S.
4. Гилинский М.А. Асимметричный диметиларги-нин: метаболизм, аргининовый парадокс, патофизиология // Успехи физиол. наук. 2007. 38. (3). 21-39.
Gilinsky M.A. Asymmetric dimethylarginine: metabolism, arginine paradox, pathophysiology // Us-pekhi physiol. nauk. 2007. 38. (3). 21-39.
5. Гилинский М.А., Брусенцев Е.Ю. Эндогенная регуляция биодоступности оксида азота. Клинические корреляты и подходы к анализу // Бюл. СО РАМН. 2007. (3). 109-115.
Gilinsky M.A., Brusentsev E. Yu. Endogenous regulation of nitric oxide bioavailability. Clinical correlates and analytical approaches // Byul. SO RAMN. 2007.
(3). 109-115.
6. Kielstein J.T., Zoccali C. A new perspective for the treatment of renal diseases? // J. Am. Soc. Nephrol. 2007. 18. 1365-1367.
7. Al Banchaabouchi M., Marescau B., Possemiers I. et al. NG,NG-Dimethylarginine and NG,N’G-dimethy-larginine in renal insufficiency // Pflugers Arch. Eur. J. Physiol. 2000. 439. 524-531.
8. Carello K. A., Whitesall S.E., Lloyd M.C. et al. Asymmetrical dimethylarginine plasma clearance persists after acute total nephrectomy in rats // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2006. 290. H209-H216.
9. Герасев А.Д., Луканина С.Н., Святаш Г.А., Айзман Р.И. Влияние природных цеолитов на функции почек крыс в условиях острой почечной недостаточности // Нефрология и диализ. 2000. 2.
(4). 21-24.
Gerasev A.D., Lukanina S.N., Sviatash G.A., Aisman R.I. Influence of natural ceolite on the renal functions in acute renal failure // Nephrology and dialysis. 2000. 2. (4). 21-24.
10. Teerlink T. Determination of the endogenous nitric oxide synthase inhibitor asymmetric dimethy-larginine in biological samples by HPLC // Meth. Mol. Med. 2002. 108. 263-274.
11. De Jong S., Teerlink T. Analysis of asymmetric dimethylarginine in plasma by HPLC using a monolithic column // Anal. Biochem. 2006. 353. 287-289.
12. Teerlink T. HPLC analysis of ADMA and other methylated l-arginine analogs in biological fluids // J. Chromatogr. B. 2007. 851. 21-29.
METHYLARGININES IN GLYCEROL INDUCED ACUTE RENAL FAILURE OF RAT
Mikhail Abramovich GILINSKY1, Roman Idelevich AISMAN2,
Galina Anatol’evna KOROSHCHENKO2, Tatyana Vyacheslavovna LATYSHEVA1,
Tatyana Ivanovna NOVOSELOVA3, Galina Mikhailovna PETRAKOVA1,
Roman Aleksandrovich SUKHOVERSHIN1, Mikhail Al’bertovich SUBOTYALOV2
institute of Physiology SB RAMS 630117, Novosibirsk, Timakov st., 4
2Novosibirsk State Pedagogical University 630126, Novosibirsk, Vilujskaya st., 28
3Scientific-industrial company «Nov’»
630005, Novosibirsk, Karamzin st., 53
Methylated L-arginine derivatives play a great role in an endogenous regulation of the bioavailability of nitric oxide (NO). Chronic renal failure leads to the accumulation of methylarginines in the blood, which is accompanied with the accelerated development of atherosclerosis and cardiovascular complications. We have analyzed methylarginine content in rat urine and blood during acute renal failure (ARF), induced by intramuscular injection of 50% glycerol solution. Initial urine concentration of asymmetric dimethylarginine (ADMA) in the control rat was very low. ARF increased urine ADMA level many times. This has not influenced blood ADMA level. In contrast ARF lowered urine concentration of the symmetric dimethylarginine (SDMA). Ceolites and biologically active substance «Tedjas» moved methylarginine levels to the control values. It is concluded that kidney reacts variously to the substances ADMA and SDMA identical in chemical composition and molecular weights. This could help to disclose the mechanism of renal excretion selectivity.
Key words: acute renal failure, glycerol, nitric oxide, dimethylarginines, urine, plasma, rats.
Gilinsky M.A. — doctor of biological sciences, head of the laboratory, e-mail: m.a.gilinsky@physiol.ru
Aisman R.I. — doctor of biological sciences, professor, head of the chair, e-mail: roman.aizman@ngs.ru
Koroshenko G.A. — candidate of biological sciences, associated professor, e-mail: svyatashg@mail.ru
Latysheva T.V. — researcher, e-mail: latsheva96@mail.ru
Novoselova T.I. — head, e-mail: mobilti@mail.ru
Petrakova G.M. — junior researcher, e-mail: gpetrakova@hotmail.com
Sukhovershin R.A. — junior researcher, e-mail: suhovershin@physiol.ru
Subotyalov M.A. — candidate of biological sciences, associated professor
