CC BY
54
Научни трудове на Съюза на учените в България - Пловдив. Серия В. Техника и технологии. Том XVII, ISSN 1311 -9419 (Print); ISSN 2534-9384 (Online), 2019. Scientific Works of the Union of Scientists in Bulgaria - Plovdiv. Series C. Technics and Technologies. Vol. XVII., ISSN 1311 -9419 (Print); ISSN 2534-9384 (Online), 2019
МЕТОДИ ЗА ИЗСЛЕДВАНЕ НА РАДИКАЛ-УЛАВЯЩАТА АКТИВНОСТ НА БЕНЗОТИАЗОЛОВИ СЪЕДИНЕНИЯ ДесиславаКирковаЗССтела Статкова-Абегхе1, Маргарита Дочева2,
Иордан Стремски1 1 Пховдивскиуниверситет „Пачсий Хилендарски" 2 Ин ститут по тютю на и тютюневите и зделия - с. Марково
METHOeS FOR SCREENING TFIFSDICAL SCAVENGCNGACTIVITY OFBAAZOTHkVZOLE bOMPOUADS Desislava Kirkova12, Stela HtaAkova-Abeghe1, Margarita Docheva2,
Yoadan Stramski1 1 University of Plo\^c^iv "Paisii Hkendarski", Plovdiv 2Tobacco and To baccoProduCs Institute,Markovo,Plovdiv
Abstract:
Various methods for screening of antioxidant activity of some synthetic compounds and natural extracts were evaluated. The radical scavenging activity of some 2-phenyl-benzothiazole compounds was examined via DPPH, ABTS methods and compared to radical scavenging activity of natural compounds - rutin, quercetin, pyrocatechol and pyrogallol defined under the same conditions. The benzothiazole compounds containing pyrogallol fragment demonstrated similar activity as natural antioxidant - quercetin. The results obtained using ABTS method showed possibility for studying of the relationship between structure-activity of the tested examples.
Keywords: Antioxidant activity, free radicals, benzothiazole derivatives, DPPH, ABTS, FRAP, ORAC
ВЪВТКТНИТ
Генерирането на свободните радикали е естествен процес, който не може да бъде спрян. Еволюционното развитие на организмите обаче е осигурило необходимите защитни механизми, които да предотвратяват неконтролируемото развитие на окислително-радикаловите процеси. Кислород-съдържащите частици (ROS) са високо реактивни молекули. Такива са както свободните радикали - хидроксиден радикал 0OH), супероксиден анион радикал (О2"), така и нерадикалови молекули - водороден пероксид (Н2О2), синглетен кислород (1О2), озон (O3), хидрохлорна киселина (HOCl-). Те могат да атакуват биологичните макромолекули, да увредят протеини, липиди и ДНК. Смята се, че играят съществена роля в развитието на над 100 различни заболявания - сърдечно-съдови, невродегенеративни, туморни и др. (Halliwell, Gutteridge,1989; Alam, 2013).
С термина антиоксидант се дефинира „всяко вещество, което присъства в сравнително ниски концентрации в сравнение с тези на окисляемия субстрат, значително забавя или инхибира окисляването на този субстрат" (Gutteridge 1994). С „антиоксидантната активност" се назовава способност на едно съединение да редуцира ROS. Съществуват както природни, така и синтетични производни, които притежават антиоксидантна активност. Един от най - известните начини за класификация на антиоксидантите е
представен от Gutteredge и Halliwell, които класифицират нивата на антиоксидантно действие на следните групи:
• Първично ниво - предотвратява се образуването на оксиданти;
• Вторично ниво - блокират се ROS;
• Третично ниво - възстановяване на окислените молекули (Gutteridge, Halliwell,
1994).
Фенолите и техните производни проявяват широк спектър от биологична активност, поради способността им да инхибират различни ензими. Те се използват широко в медицината като антиоксиданти и в хранителната промишленост като консерванти. Поради високата токсичност на някои съединения от групата на фенолите се търсят начини за тяхното модифициране с цел намаляването на тази токсичност. Това може да се осъществи чрез въвеждане на алкилови фрагменти като заместители в ароматния пръстен на фенола (Kancheva, Angelova, 2016; Gami, 2016; Michalowicz, 2007).
Бензотиазоловият пръстен влиза в структурата на много съединения използвани в медицинската практика за лечение на различни видове заболявания. Разработени са различни методи за получаването на структурни аналози на бензотиазол, показващи висока степен на структурно разнообразие и широк спектър на биологична активност (Keri, Patil, 2014; Rouf, Tanyel, 2015). Представлява интерес получаването на бензотиазолови производни съдържащи фенолни заместители на втора позиция. Въвеждането на липофилната бензотиазолова група би повишило оксидантната стабилност на фенолите и модифицицирало антиоксидантната им активност. Намирането на подходящ метод за установяване на тези модификации ще даде възможност за изследване на връзката структура-активност.
Целта на изследването е проучване на методите за определяне на антиоксидантна активност и изследване на активността на 2-арил-бензотиазолови съединения.
МЕТОДИ ЗА ИЗСЛЕДВАНЕ НА АНТИОКСИДАНТНА АКТИВНОСТ
Разработени са десетки методи за определяне на антиоксидантната активност в синтетични, хранителни и биологични проби. В зависимост от механизма на действие методите за определяне на антиоксидантна активност се делят на:
Методи за трансфер на водороден атом (НАТ-методи). HAT-анализа се базира на измерване способността на антиоксидантите за свързване на свободните радикали (обикновено, пероксидни радикали). Такива са: метод за кислород радикален адсорбционен капацитет - (ORAC метод), метод за радикал-улавяща активност спрямо ABTS радикал (ABTS метод), метод за радикал-улавяща активност спрямо DPPH радикал (DPPH метод), метод за улавяне на пероксидни радикали. Механизмът на тази група методи може да бъде обобщен в следната схема:
ROO^ + AH / АгОН ^ ROOH + A^ / АгО^ Водороден атом (Н) от антиоксидант (АН) или фенол (Аг-ОН) се прехвърля към ROO^ радикал. Тук новообразуваният радикал (АгО^) е резонансно по-стабилен (Huang, Ou, 2005; Prior, Wu, 2005).
Методи за трансфер на електрони (ЕТ-методи). В повечето ЕТ-базирани анализи, антиоксидантно действие се измерва с подходяща редокси-потенциалана сонда, а именно: антиоксиданта реагира с флуоресцентна или цветна проба (окисляващ агент) вместо пероксидни радикали. ЕТ-методи са: желязо редуцираща антиоксидантна активност (FRAP-метод), мед редуцираща антиоксидантна активност (CUPRAC-метод), антиоксидантна активност измерена чрез тролокс еквивалент (ТЕАС метод) и др. Чрез тези методи се измерва капацитета на силата на антиоксидантите по два начина: намаляване на окислението, посредством промяна на цвета и спектрофотометрично - измервайки изменението на абсорбцията на пробата при определена дължина на вълната (Bondet, BrandWilliams, 1997).
DPPH метод - (1,1-дифенил-2-пикрилхидразил) радикал Спектрофотометричен метод, при който се използва синтетично синтезирания (1,1-дифенил-2-пикрилхидразил) радикал (Схема 1). Характерно за този метод е промяната в oцветяването на радикала от лилавo към жълто при неговото редуциране от антиоксиданта. Максималната абсорбция, при която може да се измери тази промяна е 518 nm. Стойностите се представят чрез IC50 -концентрацията, при която се инхибира 50% от свободния радикал. Колкото по-ниска е стойността на IC50, толкова по-силни радикал-улавящи свойства притежава антиоксиданта. Методът е успешно приложим за анализ на антиоксидантна активност на храни и растителни лекарства (Nantz, Rowe, 2006; Brand-Williams 1995).
ABTS метод - (2,2'азино-бис(3-етилбензтиазолин-6-сулфонова киселина)) радикал катион (ABTS^+) Определянето на радикал-улавящата активност с ABTS метода се извършва с използването на (2,2'азино-бис(3-етилбензтиазолин-6-сулфонова киселина)) радикал катион. Свободният радикал се генерира с помощта на силен окислител като KMnO4 и K2S2O4. Отчита се спектрофотометрично промяната в концентрацията на радикал катиона. Като индикатор за намаляването на концентрацията се наблюдава обезцветяване на синьо-зелен разтвор на ABTS^+ при неговата редукция. Резултатите от изследването могат да се изразят спрямо Trolox стандарт като Trolox еквивалент антиоксидантен капацитет (TEAC). ABTS методът е бърз и лесно приложим. Може да се използва в широк диапазон от рН, освен това, радикалът ABTS^+ е стабилен и разтворим в вода и органични разтворители, което дава възможност за определяне на антиоксидантния капацитет на хидрофилни и липофилни съединения (Simonetti, Pietta, 1997)
ORAC метод - кислород-радикален абсорбционен капацитет Измерва се окислителното разграждане на флуоресцентна молекула (бета-фикоеритрин или флуоресцеин), след като е смесена с генератори на свободни радикали, (например азо-съединения, т.е измерване на AAPH радикали). Тези радикали декомпозират флуоресцентна молекула, което води до загуба на флуоресценция. Степента на защита на флуоресцентната молекула с антиоксиданта се определя количествено с помощта на флуориметър. Тук терминът "антиоксидант" се отнася главно за полифеноли, които имат антиоксидантен капацитет in vitro, така че се определя относителен индекс на антиоксидантната сила чрез ORAC измерването (Miller, Rice-Evans, 1997).
TPTZ (Fe2+)
Схема 1
FRAP метод - Желязо-редуцираща антиоксидантна способност Този метод изразява способността на антиоксиданта да редуцира железните йони. Спектрофотометрично се отчита редукцията на Fe2+ до Fe3+ в образуван комплекс с на 2,4,6 - трипиридин^-триазин (TPTZ). Този вид реакцията се осъществяват чрез електронен трансфер. Промяната в абсорбцията е пропорционална на концентрациям на антиоксиданта. Абсорбцията, при която се измерва поглъщането на светлината е при 593 nm. Методът е бърз и лесен за изпълнение. Приложението на метода в последствие е разширено върху растителни екстракти, храни и други видове проби (Alam, Brist, 2013; Wood, Gibson, 2006).
Не съществува единен метод за определяне на антиоксидантната активност, който да отразява „общия антиоксидантен капацитет" както на синтетични вещества, така и на природни екстракти. При всеки един от изброените методи се изследва само антиоксидантната активност спрямо специфичната реакция на различните методи, а не цялостната антиоксидантна активност.
МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ Материали
Изследвана е активността на шест 2-арил-бензотиазоли, получени по Схема 2. Структурата на две от съединенията (4а, 4b) е доказана чрез окислителна ароматизация с о-хлоранил по процедура за 2-пиролил-тиазолини, описана при по-ранни изследвания (Stremski, Statkova-Abeghe, 2017).
i- cicooRi
2а, b 1
2а R^ — -СН2СН3 2b R, = -CH3
k^1
—он
За-с
-HCl
За = Фенол ЗЬ = Катехол Зс = Пирогалол
Схема 2
4a-f
COORi
4а = -сн2сн3, Ar = 4-хидроксифенил; 4b R-, = -СН3, Ar = 4-хидроксифенил; 4с R, = -СН2СН3, Ar = дихидроксифенил; 4d R1 = -сн3, Ar = дихидроксифенил; 4e R1 = -сн2сн3, Ar = трихидроксифенил; 4f R! = -ch3, Ar = трихидроксифенил;
За изпълнение на целта са използвани следните реактиви: DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl), ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethyl-benzothiazoline-6-sulphonic acid)), Кверцетин, Рутин, Пирогалол, Катехол - чисти за анализ, закупени от Sigma Aldrich и синтетични съединения производни на бензотиазол, синтезирани в катедрата по Органична химия към Пловдивски университет „Паисий Хилендарски" по проект СП 17 ХФ 018, финансиран от Фонд научни изследвания при ПУ „Паисий Хилендарски".
Методи
Определяне на радикал-улавящата активност с използването на стабилен DPPH (1,1-дифенил-2-пикрилхидразил) радикал. Използван е DPPH - метод за определяне на антиоксиданта активност по процедура описана от Docheva и съавтори, 2014. Използвана бе работна концентрация на DPPH 0,12 mM и разтворител метанол. След престояване на сместа за време от 30 min при стайна температура на тъмно, се измерва абсорбцията на всеки разтвор със спектрофотометър при 515 nm. С получените стойности за Ab се изчислява RSA% за всяка проба. След което се построява графичната зависимост на RSA% от концентрацията на веществата в реакционната смес.
Определяне на радикал-улавящата активност с използването на ABTS^+ -(2,2'азино-бис(3-етилбензтиазолин-6-сулфонова киселина)) радикал катион.
Определянето на радикал-улавящата активност на бензотиазоловите съединение се извърши и с използването на ABTS - метод. Използвани са условията на метода описани от Re и съавтори, 1999 - 7 mM ABTS разтворени в дестилирана H2O + 2.45 mM K2S2O8 разтворени в дестилирана H2O. Смесването на реагентите е в съотношение 1:1 (v/v). Разтворът престоява 14-16 часа за стабилизиране. Разрежда се с чист метанол и се отчита абсорбцията им при 734 nm, до достигане на абсорбция 0.7. За протичането на реация между свободния радикал и антиоксиданта са необходими 10 минути при стайна температура на тъмно, след което се измерва абсорбцията на всеки разтвор със спектрофотометър при 734 nm.
Приготвени са изходни разтвори на веществата с концентрация 1 mg/ml. От тях чрез разреждания с метанол са приготвени разтвори с по-ниски концентрации.
Изследвана е радикал-улавящата активност на нови 2-арил-бензотиазолови съединения, чрез DPPH и ABTS метод. Резултатите за радикал-улавяща активност са съпоставени с тези на природните съединения рутин, кверцетин, катехол и пирогалол при едни и същ и условия. За всяко от изследваните вещества първоначално е проучен концентрационният интервал, при който настъпва пълно превръщане на радикала в неутрална молекула. Това е свързано с промяна на цвета - от виолетов до жълт (DPPH-метод) и от синьо-зелен до безцветен (ABTS-метод). Резултатите са изчислени по формула за % инхибиция:
Построена е графична зависимост на % инхибиция (RSA%) от концентрацията на всяко веществото и са намерени стойностите за 1С50 за всяко едно вещество в ^/т1 и цМ. Получените резултати от радикал-улавящата активност на 2-арил-бензотиазолови съединения са представени в Таблица 1.
При изследване на активността на веществата спрямо DPPH-метода е установена най-висока радикал-улавяща активност на природните флавоноиди рутин (1С50 = 5.02 цМ) и кверцетин (1С50 = 4.60 цМ), следвани от пирогалол и катехол (1С50 = 5.71 цМ). Получените резултати за 1С50 на рутин и кверцетин съвпадат с изследванията на Docheva. Съединение 4е показва най-висока радикал-улавяща активност (1С50 = 3.66 цМ). Останалите бензотиазоловите производни имат активност в порядък 1С50 = 13.58 цМ - 38.22 цМ.
Най-висока радикал-улавяща активност от природните съединения спрямо ABTS-метода проявява пирогалола (1С50 = 22.68 цМ), а най-ниска - катехол (1С50 = 100.42 цМ). При този метод разликата в стойностите е почти пет пъти, докато изследвани чрез DPPH-метода те проявяват еднаква активност. Стойностите за 1С50 на кверцетин (1С50 = 41.04цМ) и рутин (1С50 = 91.87 цМ) се различават с два порядъка, докато такава разлика не се наблюдава при DPPH-метода. Радикал-улавящята активност на бензотиазоловите синтетични производни е в по-широк порядък - от 1С50 = 45.94 цМ (4е) до 116.23 цМ (4d), което е свързано с броя и положението на фенолните групи в молекулите им. Съединения 4е и 4f показват активност близка до тази на кверцетина и много по-висока от останалите 2-арил-бензотиазолини. Резултатите са представени в Таблица 1. Това се обяснява от факта, че алкиловите заместители на фенола, на "о-" и "р-" позиция образуват резонансно по-стабилен феноксиден радикал (Kancheva, 2009). Направеният анализ на резултатите покава, че ABTS-метода в сравнение с DPPH-метода дава по-голяма възможност за изследване на връзката между структура-активност.
Изследването на активността на бензотиазоловите производни с фенолен фрагмент - 4а (ЭРРН-анализ) и 4Ь (ABTS-анализ), показаха най-ниски стойности за 1С50 и при двата метода за радикал-улавяща активност. Достигането на линеен интервал при тях бе трудно.
РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЯ
%инхибиция =
Таблица 1: Резултати за антиоксидантна активност спрямо DPPH и ABTS метод:
Ar | 4a-f Съединение coor. MW IC50 fag/ml) IC50 (дМ) IC50 (^g/ml) IC50 (дМ)
DPPH метод ABTS метод
№ Ri Ar
4a C2H5 4-хидроксифенил 301.36 11.52 38.22 - -
4b CH3 4-хидроксифенил 287.33 - - 488.27 1699.2
4c C2H5 дихидроксифенил 317.36 4.31 13.58 32.37 102
4d CH3 дихидроксифенил 303.33 4.12 13.58 35.22 116.23
4e C2H5 трихидроксифенил 333.36 1.22 3.66 15.31 45.94
4f CH3 трихидроксифенил 319.33 5.77 18.10 20.83 65.19
Кверцетин 302.24 1.36 4.60 12.4 41.04
Рутин 610.52 3.06 5.02 56.02 91.87
Катехол 110.11 0.63 5.72 11.06 100.42
Пирогалол 126.11 0.72 5.71 2.86 22.68
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Изследвана е активността на избрани 2-фенил-бензотиазолови съединения и сравнена с активността на био-антиоксидантите рутин и кверцетин, посредством DPPH-метод и ABTS-метод. Бензотиазоловите съединения съдържащи пирогалолов фрагмент проявяват радикал--улавяща активност сходна с тази на кверцетин. Направеният анализ на резултатите покава, че ABTS-метода дава възможност за изследване на връзката структура -активност.
Благодарност към Фонд научни изследвания при Пловдивски университет „Паисий Хилендарски", по проект СП 17 ХФ 018.
ЛИТЕРАТУРА
Alam, MN, Bristi, NJ, Rafiquzzaman, M., 2013 Review on in vivo and in vitro methods evaluation of antioxidant activity. Saudi Pharm J 21: 143-152;
Bondet, V., W. Brand-Williams, C. Berset. 1997 Kinetics and Mechanisms of Antioxidant Activity Using the DPPH Free Radical Method. Food Sci. Technol. 30, 609-615;
Brand-Williams, W., Cuvelier, ME., Berset, C., 1995 Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity. Lebensm Wiss Technol 28:25-30;
Docheva, M., Dagnon, S., Statkova-Abeghe, S., 2014 Flavonoid content and radical scavenging potential of extracts prepared from tobacco cultivars and waste. Nat. Prod. Res., 28, 17, 37-41;
Gami, А., Shukor, М., Khalil, К., Dahalan, F., Khalid, A., Ahmad, S., 2014 Phenol and its toxicity. Journal of Environmental Microbiology and Toxicology 2, 1, 11 -24
Gutteridge, J., 1994 Free radicals and aging. Rev. Clin. Gerontol. 4, 279;
Gutteridge, J., Halliwell, 1994 Antioxidants in Nutrition, Health and Disease, Oxford University Press, Oxford, UK;
Halliwell, B., Gutteridge, J., 1989 Free Radicals in Biology and Medicine, Oxford University Press,
Oxford;
Huang, D., Ou, B., Prior, R., Agric, J., 2005 The chemistry behind antioxidant capacity assays. Food Chem. 53, 1841-1856;
Kancheva, V.D., Angelova, S., 2016 Synergistic Effects of Antioxidant Compositions during Inhibited Lipid Autoxidation. Lipid Peroxidation: Inhibition, Effects and Mechanisms, 4, 49-81;
Kancheva, V.D., 2009 Phenolic antioxidants - radical-scavenging and chain-breaking activity: A comparative study. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 111, 1072-1089;
Keri, R., Patil, M., Patil, S., Budagumpi, S., 2014 A comprehensive review in current developments of benzothiazolebased molecules in medicinal chemistry. Eur. J. Med. Chem., 89, 207-251;
Mchalowicz, J., Duda W., 2007 Phenols - Sources and Toxicity. Polish J. of Environ. Stud. 16, 3
347-362
Miller, N., Rice-Evans, C., 1997 Factors influencing the antioxidant activity determined by the ABTS^+ radical cation assay. Free Radical Res. 26, 195-199;
Nantz, MP, Rowe, CA, Nieves, C. Jr., Percival SS 2006 Immunity and antioxidant capacity in humans is enhanced by consumption of a dried, encapsulated fruit and vegetable juice concentrate. J Nutr 136: 2606-2610;
Prior, R., Wu, X., Schaich, K. Agric, J., 2005 Standardized methods for the determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements. Food Chem. 53, 4290 - 4302;
Re, R., Pellegrini, N., Proteggente, A., Pannala, A., Yang, M., Rice-Evans, C. 1999 Antioxidant Activity Applying an Improved ABTS Radical Cation Decolorization Assay. Free Radical Biology and Medicine, 26, 9, 1231-1237;
Rouf, A., Tanyeli, C., 2015 Bioactive thiazole and benzothiazole derivatives. Eur. J. Med. Chem., 97, 911-927;
Stremski Y., Statkova-Abeghe, S., Ivanov I., Angelov P., 2017 A new method for the synthesis of 2-(1H-pyrrol-2-yl)benzo[d]thiazole. Scientific Works of the Union of Scientists in Bulgaria - Plovdiv, Series C. - Te^nics and technologies, XIV, 196-221;
Simonetti, P., Pietta, P., Testolin, G., 1997 Polyphenol Content and Total Antioxidant Potential of Selected Italian Wines. J. Agric. Food. Chem. 45: 1152-1155;
Wood, L., Gibson PG, Garg ML, 2006 A review of the methodology for assessing in vivo antioxidant capacity. J Sci Food Agric 86: 2057-2066.
