Метаболом сыворотки крови по данным газовой хроматографии - масс-спектрометрии (ГХ-МС) у пациентов с язвенным колитом и больных целиакией Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

МЕТАБОЛОМ СЫВОРОТКИ КРОВИ ПО ДАННЫМ ГАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИИ — МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ (ГХ-МС) У ПАЦИЕНТОВ С ЯЗВЕННЫМ КОЛИТОМ И БОЛЬНЫХ ЦЕЛИАКИЕЙ

С. И. Ситкин12, Е. И. Ткаченко1, Т. Я. Вахитов2, Л. С. Орешко1, Т. Н. Жигалова1

'СЗГМУ им. И. И. Мечникова, 2Гос. НИИ ОЧБ ФМБА России e-mail: [email protected]

РЕЗЮМЕ

Метаболомика — развивающаяся наука, занимающаяся изучением и анализом метаболома — совокупности всех низкомолекулярных метаболитов клетки, ткани, органа или организма в целом. Одной из целей метаболомики является изучение ответных реакций организма на патофизиологические воздействия путем оценки уровней низкомолекулярных метаболитов в биологических жидкостях и тканях, а также их динамики. Микробиота кишечника вовлечена в развитие аутоиммунного воспаления при язвенном колите и целиакии. Газовая хроматография — масс-спектрометрия (ГХ-МС) сыворотки крови позволяет оценить совокупный метаболизм организма (эндогенный и микробный), который может быть нарушен при обоих состояниях. Целью исследования явилось изучение методом ГХ-МС метаболома сыворотки крови у пациентов с язвенным колитом и целиакией. В образцах сыворотки крови, полученных от 75 пациентов (20 пациентов с легкими и среднетяжелыми формами язвенного колита, 35 пациентов с целиакией и 20 практически здоровых добровольцев), было идентифицировано 84 метаболита, по крайней мере, 18 из которых имели комбинированное происхождение (эндогенное + микробное). В сыворотке крови пациентов с язвенным колитом выявлено значимое повышение уровня фенилуксусной, парагидроксифе-нилуксусной, индолуксусной, янтарной и фумаровой кислот, а также снижение уровня фенилпропионовой кислоты. У пациентов с целиакией отмечалось достоверное повышение индолуксусной, индолпропионо-вой, янтарной и фумаровой кислот. Повышенный уровень янтарной кислоты подтверждал гипотезу о ее возможном повреждающем действии на слизистую оболочку кишечника, особенно при язвенном колите. Пероральное применение метабиотика (масляной кислоты в комбинации с инулином) на фоне базисной терапии месалазином у больных язвенным колитом и на фоне безглютеновой диеты у пациентов с целиакией улучшало клиническую симптоматику, метаболомический профиль сыворотки крови и показатели микробиоценоза, достоверно устраняя анаэробный дисбаланс, повышая долю бутират-продуцирующих бактерий и нормализуя патологически повышенный уровень янтарной кислоты.

Ключевые слова: бутират, инулин, метабиотики, метаболом, метаболомика, целиакия, язвенный колит.

SUMMARY

Metabolomics is the emerging science of measurement and analysis of metabolome — the complete set of low molecular weight compounds in a cell, tissue, organ or whole organism. One of the aims of metabolomics is to research the response of an organism to a pathophysiological insult by measuring the concentrations of small molecule metabolites in biofluids and tissues and its dynamics. Intestinal microbiota is most probably involved in the development and maintenance of autoimmune inflammation in ulcerative colitis and celiac disease. Gas chromatography-mass spectrometry (GC - MS) of serum generates comprehensive metabolic profiles, reflecting integrated human (systemic) and gut microbial metabolism which may be altered in disease states. The aim of this study was to investigate GC - MS-based serum metabolomic profiles in UC and CD patients. Serum metabolic profiles were collected from 75 individuals: 20 patients with mild-moderate active UC, 35 CD patients, and 20 healthy controls (HC). We characterized 84 serum metabolites by use GC - MS. 18 metabolites at least have a combined (human + microbial) origin. In serum of UC patients, phenylacetic acid (PAA), 4-hydroxyphenylace-tic acid (4-HPAA), 3-indolylacetic acid (IAA), succinic acid (SA) and fumaric acid (FA) were the metabolites most prominently increased, whereas 3-phenylpropionic acid (PPA) was significantly decreased. Serum of CD patients showed significant increases in IAA, 3-indolepropionic acid (IPA), SA and FA. Increased serum levels of succinic acid suggest its possible damaging effect on intestinal mucosa especially in ulcerative colitis. Orally administered butyrate + inulin as supplement to mesalazine in UC or gluten free diet in CD was effective in reducing disease activity with a marked improvement of serum metabolomic profiles (including SA reduction) and gut microbiota in both diseases. There were no any adverse events.

Keywords: butyrate, celiac disease, inulin, metabiotics, metabolome, metabolomics, ulcerative colitis.

ВВЕДЕНИЕ

Метаболомика, наряду с другими omics-технологи-ями (геномикой, транскриптомикой и протеомикой), является неотъемлемой частью современной молекулярной биологии и одним из наиболее развивающихся научных направлений, как в фундаментальной, так и в клинической медицине. Метаболомика занимается изучением низкомолекулярных соединений (НМС), входящих в состав метаболома, представляющего собой комплекс всех низкомолекулярных (как правило, не более 1 - 1,5 кДа) метаболитов в клетке, ткани, органе, биологической жидкости, являющихся промежуточными или конечными продуктами обмена веществ.

В 1971 г. Linus Pauling с соавт. впервые высказали идею о том, что вся информация о функциональном состоянии организма отражена в качественном и количественном составе биологических жидкостей организма. Позже Nicholson J. K. с соавт. (1999) ввел понятие «метабономика», означающее динамический метаболический ответ живых систем на биологические стимулы, в то время как под термином «метаболомика» понималась наука, изучающая метаболические профили на клеточном и органном уровне и связанная преимущественно с нормальным эндогенным метаболизмом. В настоящее время разница между двумя этими понятиями практически упразднилась, и в мировой литературе чаще используется термин «метаболомика».

Целью метаболомики является изучение ответной реакции организма на какое-либо патофизиологическое воздействие, например болезнь, воздействие лекарственных препаратов или окружающей среды. В результате любого воздействия на организм происходят множественные изменения концентраций различных метаболитов с целью поддержания гомеостаза. Внутриклеточные метаболиты находятся в динамическом равновесии с метаболитами биологических жидкостей, омывающих клетки. Таким образом, любой клеточный ответ будет отражен в изменяющемся составе биологических жидкостей организма, таких как кровь, моча, семенная, фолликулярная или церебральная жидкости. Анализируя полученные метаболические профили можно получить своеобразный «отпечаток» (fingerprint), отражающий физиологическое состояние организма. Для изучения метаболических профилей в качестве исследуемых образцов чаще всего используются биологические жидкости, такие как сыворотка (плазма) крови, моча, асцитиче-ская жидкость, слюна, бронхиальные смывы и т. д., поскольку они наиболее просты для забора и про-боподготовки. Однако наибольшее количество исследований до настоящего времени проводилось с сывороткой крови и мочой.

Для проведения метаболических исследований чаще всего используются ЯМР-спектроскопия и масс-спектрометрия (в виде прямого масс-спектрометрического анализа или в сочетании с газовой хроматографией, высокоэффективной

жидкостной хроматографией, капиллярным электрофорезом). Оба метода имеют свои преимущества и недостатки. Прямой масс-спектрометрический анализ не требует предварительной обработки образцов, однако при использовании данной методики происходит подавление сигнала отдельных метаболитов, приводящее к искажению полученных результатов. В сочетании с жидкостной хроматографией масс-спектрометрия обладает более высокой чувствительностью и позволяет идентифицировать метаболиты, имеющие очень низкие концентрации. Однако ее чувствительность зависит от уровня pH и гидрофобности метаболитов. Методы предварительной обработки, необходимые для исследования образцов с помощью данной методики, такие как быстрая заморозка, экстрагирование, могут изменить структуру метаболитов и дать, в итоге, искаженные результаты. Перспективным является применение высокоэффективной жидкостной хроматографии, сопряженной с масс-спектрометрией, при которой в сыворотке крови измеряется до 2000 метаболитов.

По сравнению с масс-спектрометрией ЯМР-спектроскопия менее чувствительна и требует наличия более дорогого оборудования. Однако ЯМР-спектроскопию можно использовать для исследования как биологических жидкостей, так и биологических тканей в нативном состоянии (или же с минимальной обработкой образцов). Другое значительное преимущество ЯМР-спектроскопии заключается в том, что метаболиты, обнаруженные и проанализированные in vitro, могут быть исследованы и in vivo. Используя сочетание ЯМР-спектроскопии и МРТ можно визуализировать специфические метаболиты in vivo и подтвердить достоверность данных, полученных при исследовании in vitro.

Отличительной особенностью метаболомиче-ских исследований в гастроэнтерологии является то, что один из акцентов в них, а иногда и основной акцент, делается на изучение метаболитов микробного происхождения. Кишечник (прежде всего, толстая кишка) в «суперорганизме» человека и микробио-ты представляет собой своеобразный биореактор с практически неограниченным метаболическим потенциалом, определяемым возможностями именно микробиома. Организм человека при этом «сотрудничает» с микробиотой благодаря так называемому явлению метаболической интеграции, существование которого недавно было постулировано отечественными учеными (Белобородова Н. В., 2012). При этом человек получает от микроорганизмов целый ряд ключевых метаболитов, не только поддерживающих его энергетический баланс (короткоцепо-чечные жирные кислоты и др.), но и активно участвующих в регуляции экспрессии его генов, ней-ротрансмиссии и иммуномодуляции (Tremaroli V. & Backhed F., 2012).

По мнению ряда исследователей, уровень ряда низкомолекулярных метаболитов в крови, например, некоторых карбоновых кислот, во многом определяется именно метаболической активностью

Б >■

о

So

1_ ° ОД

<s ое

и о НУ

№ о

а е

¡Г5

и га

L Б

га

ü ш

J S I-0 ш с га а ш i-

микробиоты кишечника (Белобородова Н. В. и соавт., 2009, 2011; Beloborodova N. et al., 2012; Osipov G. A. & Verkhovtseva N. V., 2011). В связи с этим особый интерес представляют метаболомические исследования при таких заболеваниях органов пищеварения, как воспалительные заболевания кишечника (язвенный колит и болезнь Крона), синдром раздраженного кишечника (СРК), целиакия (глютено-вая энтеропатия), кишечные инфекции (Clostridium difficile, Salmonella spp., Campylobacter jejuni) и др.), где роль нарушений микробиоценоза кишечника весьма велика (DuPont A. W. & DuPont H. L., 2011).

Дифференциально-диагностические возможности метаболомических исследований были продемонстрированы в исследовании Schicho R. и соавт. (2012), показавшем, что количественное метабо-ломическое профилирование сыворотки, плазмы и мочи позволяет достоверно разделить группы пациентов с ВЗК и здоровых лиц. При этом у пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника уровень метанола, маннозы, изолейцина, муравьиной и 3-метил-2-оксовалериановой кислот в крови был значимо повышен, а уровень мочевины и лимонной кислоты понижен. Изменение уровня некоторых метаболитов у больных ВЗК (повышение уровня креатина в плазме, снижение уровня гип-пуровой кислоты в моче), по мнению авторов, могло быть связано с нарушениями микробиоценоза кишечника. В другом исследовании были показаны возможности многомерного индекса на основе технологии Aminolndex™, отражающего метаболо-мический аминокислотный профиль плазмы крови («аминограмму») и позволяющего проводить дифференциальную диагностику как между пациентами с язвенным колитом и болезнью Крона, так и между больными ВЗК и здоровыми лицами (Hisamatsu T. et al., 2012).

Интенсивно ведутся исследования и в области метаболомической диагностики колоректального рака. Так, Nishiumi S. и соавт. (2012) представили новую модель ранней диагностики колоректального рака, основанную на определении метабо-ломического профиля сыворотки крови методом хромато-масс-спектрометрии. Показатели чувствительности, специфичности и точности модели, основанной на определении нескольких сывороточных биомаркеров, в том числе альфа-оксимасляной (2-оксибутановой) кислоты, аспарагиновой кислоты, кинуренина и цистамина, составили 85,0%, 85,0% и 85,0% соответственно и были сопоставимыми или даже более высокими, чем показатели чувствительности, специфичности и точности стандартных онкомаркеров — раково-эмбрионального (карци-ноэмбрионального) антигена (РЭА [КЭА]) (35,0%, 96,7% и 65,8% соответственно) и CA19-9 (16,7%, 100,0% и 58,3% соответственно). Оценка метабо-ломического профиля сыворотки крови позволит, вероятно, не только выявлять колоректальный рак на ранних стадиях, но и дифференцировать его стадии (Farshidfar F. et al., 2012). В исследовании

Qiu Y. и соавт. (2010) было показано, что при коло-ректальном раке существенно повышается уровень фенилуксусной и парагидроксифенилуксусной кислот в моче. В свою очередь, в другом исследовании Cheng Y. и соавт. (2012) показали хорошие диагностические возможности панели, включающей такие метаболиты мочи, как лимонная, гиппуровая, 2-аминомасляная, миристиновая и кинуреновая кислоты, паракрезол и путресцин, являющиеся продуктами совместного метаболизма организма-хозяина и микробиоты кишечника.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящего исследования явилось изучение методом газовой хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС) метаболома сыворотки крови у пациентов с язвенным колитом и целиакией, а также оценка динамики изменений метаболомического профиля и показателей микробиоценоза кишечника на фоне приема метабиотика — комбинированного препарата масляной кислоты (бутирата кальция) и инулина.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В открытое сравнительное рандомизированное исследование включались обследованные практически здоровые лица (добровольцы) обоего пола в возрасте от 18 до 60 лет и соответствующие им по полу и возрасту пациенты с легкими/среднетяжелыми формами язвенного колита в фазе обострения и больные целиакией, подписавшие добровольное информированное согласие на участие в исследовании. Всего в исследование было включено 75 пациентов: 20 пациентов с легкими и среднетяжелыми формами язвенного колита, 35 пациентов с целиакией и 20 практически здоровых добровольцев.

Диагноз язвенного колита устанавливался на основании данных анамнеза, эндоскопического (ко-лоноскопия), гистоморфологического (гистологическое исследование биоптатов слизистой оболочки толстой кишки) и биохимического исследований. Клиническая и эндоскопическая активность воспалительного процесса оценивались с помощью индексов Мейо и Рахмилевича (Schroeder K. W. et al., 1987; Sutherland L. R. et al., 1987; Rachmilewitz D., 1989).

Диагноз целиакии устанавливали на основании данных анамнеза, эндоскопического, гистоморфологического и биохимического исследований (морфометрия слизистой оболочки ретро-бульбарного отдела двенадцатиперстной кишки, HLA-типирование, иммунологическое исследование крови) (Орешко Л. С., 2008).

В исследование не включались пациенты с тяжелыми и осложненными формами язвенного колита (в том числе пациенты с внекишечными осложнениями и проявлениями), требующими назначения кор-тикостероидов и/или иммуносупрессантов, пациенты с хроническими диффузными заболеваниями печени различной этиологии, пациенты с тяжелыми

сопутствующими заболеваниями системного характера, в том числе пациенты с сердечно-сосудистой, дыхательной, печеночной и почечной недостаточностью, пациенты с эндокринной патологией, а также женщины в период беременности и лактации.

Здоровые добровольцы (группа 1) в течение 28 дней получали метабиотик — комбинированный препарат масляной кислоты и инулина по 3 табл. в день.

Больные язвенным колитом (группа 2) и больные целиакией (группа 3) были рандомизированы внутри своих групп в 2 подгруппы (2а и 2Ь, 3а и 3Ь соответственно). Пациенты, вошедшие в подгруппы 2а и 3а, в течение 28 дней получали только стандартную терапию — пероральный месалазин (сало-фальк в таблетках или гранулах) в дозе 3,0 г в сутки при язвенном колите (при необходимости — в комбинации с ректальным месалазином в форме свечей, суспензии или пены в дозе 7,0 - 14,0 г в неделю и средствами симптоматической терапии) и без-глютеновую диету при целиакии.

Пациенты, вошедшие в подгруппы 2Ь и 3Ь, получали в течение 28 дней в дополнение к стандартной терапии метабиотик — комбинированный препарат масляной кислоты (бутирата) и инулина по 3 табл. в день.

Прием любых антибактериальных, противовирусных, противогрибковых и противопротозойных средств, пробиотиков, пребиотиков и препаратов (БАД к пище), содержащих бактериальные метаболиты, в течение всего периода исследования исключался. При условии приема таких препаратов в прошлом, пациенты (в том числе и практически здоровые лица) для включения в исследования должны были прекратить их прием, по крайней мере, за 30 дней до начала исследования.

Забор венозной крови, получение и хранение сыворотки для целей исследований проводили в соответствии с действующими стандартами: ГОСТ Р 53079.4 - 2008 «Технологии лабораторные клинические. Обеспечение качества клинических лабораторных исследований. Часть 4. Правила ведения преаналитического этапа» (введен с 01.01.2010 г.); ГОСТ Р ИСО 6710 - 2009 и другими нормативными документами. Забор крови у пациентов производили утром натощак с помощью вакуумных системы для взятия венозной крови RusTech. После забора образцы крови для получения сыворотки подвергали центрифугированию в течение 15 мин. при скорости вращения 3000 оборотов. Далее полученную сыворотку с помощью одноразовых пластмассовых пипеток (емкостью до 3 мл) распределяли в 2 стерильные пробирки с герметично закручивающимися крышками (не менее 0,5 мл сыворотки в каждую пробирку). После маркировки пробирки помещали в специальный биомедицинский морозильник, предназначенный для хранения компонентов крови и вакцин, диагностических образцов и проб при температурах от -20 °С до -35 °С. Хранение образцов сыворотки крови осуществляли при температуре

-20 °C. В рамках исследования было организовано хранение сывороток крови всех принимавших участие в исследовании здоровых добровольцев и больных — создан банк сывороток крови. При этом сыворотку крови из одной пробирки (2 пробирки на каждого пациента) использовали для определения метаболомического профиля крови методом ГХ-МС, а из второй пробирки — для формирования банка.

Образцы сывороток крови непосредственно перед анализом размораживали при комнатной температуре, в виалу помещали от 0,5 до 1 мл сыворотки крови, 50 мкл 5% раствора муравьиной кислоты и 2 мл метил-трет-бутилового эфира. Полученную смесь активно перемешивали в течение 5 минут с использованием встряхивателя. Образовавшуюся эмульсию количественно переносили в пластмассовые пробирки типа Eppendorf и центрифугировали при 8000 оборотов в течение 10 минут. Верхний эфирный слой переносили в сухую чистую посуду и отдували в токе азота досуха. Полученный твердый остаток обрабатывали 10 мкл традиционного дериватизирующего агента N, O-бис (триметил-силил) трифторацетамида в течение 5 минут при температуре 60 °C. Разделение проводили на газовом хроматографе c масс-спектрометром GCMS-QP2010 Plus (Shimadzu Corporation, Япония) в режиме программирования температуры, начиная с температуры +50 °C (3 мин). Дальнейшая скорость нагрева составляла 10 °C в мин, конечная температура — +290 °C, время при конечной температуре — 13 мин. Температура испарителя — +280 °C, газ-носитель — гелий (1 мл/мин). Для разделения использовали универсальную хроматографическую капиллярную колонку Equity-5 длиной 30 м с внутренним диаметром 0,25 мм и неподвижной фазой на основе сополимера диметилсилоксана (95%) и ди-фенилсилоксана (5%) (Supelco, Sigma-Aldrich Group, США). Объем вводимой пробы — 1 мкл.

Во всех группах оценивали состояние микробиоценоза толстой кишки до и после назначения метабиотика (в 0 - 1-й и 29 - 30-й дни). Для количественного определения микроорганизмов ДНК, выделенную из образцов кала, подвергали полимераз-ной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени согласно методикам Penders J. et al. (2006, 2007) и Sokol H. et al. (2009). Для идентификации группы бутират-продуцирующих бактерий методом ПЦР в реальном времени использовали соответствующие праймеры: Butyryl-CoA CoA transferases (R. hom., R. hominis A2-183; E. hal., E. hallii L2-7; A. cac. I, A. caccae L1-92; F. prau., F. prausnitzii A2-165), Acetyl-CoA hydrolase (D. haf., D. hafniense), 4-Hydroxybutyrate CoA transferases (C. klu., C. kluyveri; C. tet., C. tetani; A. cac. II, A. caccae L1-92; C. am., C. aminobutyricum) (Louis P. & Flint H. J., 2007, 2009).

Статистическую обработку данных проводили стандартными методами с использованием программ Microsoft Excel 2010, SPSS и PAST (Hammer 0. et al., 2011).

Б >■

о

So

1_ о OS

<s ое

и о НУ

№ о О Е

¡Г5

и га

L Б

га

ü ш

J

s

H

о <u с га а ш н

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В ходе исследования метаболома крови человека методом ГХ-МС в сыворотке крови было идентифицировано 84 низкомолекулярных соединения. По количеству метаболитов этот результат хорошо согласуется с данными, полученными в других лабораториях, и даже превосходит некоторые из них. Так, например, международной группе зарубежных ученых — авторов базы данных Serum Metabolome database (SMDB) (http://www.serummetabolome.ca) — аналогичным методом удалось идентифицировать 74 метаболита (Psychogios N. et al., 2011), среди которых 21 составляли аминокислоты (АК), а 10 — сахара.

Из идентифицированных 84 соединений 18 входили и в состав выделенных нами ранее экзомета-болитов бактерий. Еще, как минимум, 7 метаболитов, по данным литературы, могли иметь двойное (эндогенное + микробное) или же преимущественно микробное происхождение. Средние показатели по содержанию этих метаболитов были различны для здоровых людей, больных целиакией и язвенным колитом.

В настоящей статье приведены данные лишь по некоторым группам идентифицированных метаболитов, играющих, с нашей точки зрения, значимую роль в системе взаимоотношений микро-биоты кишечника и организма человека.

Фенилкарбоновые кислоты. Основным источником фенилкарбоновых кислот (ФКК) в организме человека служат ароматические аминокислоты — фенилаланин и тирозин (Smith E. A. & Macfarlane G. T., 1996). В сыворотке крови здоровых добровольцев и пациентов с целиакией и язвенным колитом методом ГХ-МС нами были идентифицированы такие ФКК, как бензойная кислота (БК), фени-луксусная кислота (ФУК), фенилмасляная кислота (ФМК), фенилпропионовая кислота (ФПК), параги-дроксифенилуксусная (4-оксифенилуксусная) кислота (ПГФУК) и 2-метилбензойная кислота (2-МБК).

С точки зрения изучения метаболической активности микробиоты кишечника наибольший интерес из идентифицированных нами ФКК представляют фенилуксусная, парагидроксифенилук-сусная, фенилпропионовая и бензойная кислоты. Из постоянных представителей анаэробной флоры организма человека в метаболизме ароматических аминокислот принимают участие в основном представители двух родов — Clostridia (тип Firmicutes) и Bacteroides (тип Bacteroidetes). Так, например, Clostridium botulinum тип G и Clostridium subterminale метаболизируют фенилаланин и тирозин в фенилуксусную и парагидроксифенилук-сусную кислоты (Elsden S. R. & Hilton M. G., 1979). Subdoligranulum variabile (кластер Clostridium leptum), не так давно выделенный из фекалий человека, также может вырабатывать парагидроксифенилуксус-ную кислоту (Li M. et al., 2008). Из числа клостри-дий, наиболее часто встречающихся в кишечнике, такие виды, как Clostridium bifermentans, Clostridium difficile, Clostridiumperfringens и Clostridium sordellii

активно продуцируют фенилуксусную кислоту (Mayrand D. & Bourgeau G., 1982), а Clostridium sporogenes — фенилпропионовую и парагидроксифе-нилпропионовую кислоты (Белобородова Н. В. и со-авт., 2011). В свою очередь в результате ^-окисления фенилпропионовой и парагидроксифенилпропио-новой кислот в печени образуется бензойная кислота (Mao L. F. et al., 1994).

Из бактероидов, характерных для микробиоты кишечника человека, фенилуксусную кислоту продуцируют Bacteroides fragilis, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides ovatus и Bacteroides distasonis (Mayrand D. & Bourgeau G., 1982; Белобородова Н. В. и соавт., 2011). Из представителей других родов можно упомянуть Peptostreptococcus anaerobius (семейство Clostridiaceae, тип Firmicutes), способный метаболизировать тирозин в фенил-пропионовую и парагидроксифенилпропионо-вую кислоты (Lambert M. A. & Moss C. W., 1980). Способность к продукции фенилмолочной и па-рагидроксифенилмолочной кислот обнаружена у Klebsiella pneumonia и Escherichia coli (оба микроорганизма относятся к семейству Enterobacteriaceae, тип Proteobacteria) и Staphylococcus aureus (семейство Staphylococcaceae, тип Firmicutes) (Белобородова Н. В. и соавт., 2009).

Стоит отметить и тот факт, что некоторые микроорганизмы могут продуцировать фенилкарбо-новые кислоты и из других субстратов. Например, Clostridium bartlettii sp. nov. (Clostridium cluster XI) способна вырабатывать фенилуксусную кислоту, утилизируя глюкозу (Song Y. L. et al., 2004). Отруби (ржаные, пшеничные, овсяные и др.) также могут служить источником ФКК. Основным фенольным бактериальным метаболитом при этом является фе-нилпропионовая кислота, образующаяся, по всей видимости, из феруловой кислоты (Nordlund E. et al., 2012).

В норме фенилкарбоновые кислоты присутствуют в крови человека. По данным Белобородовой Н. В. и соавт. (2006), средние концентрации ФУК и ФПК в сыворотке крови здорового человека составили соответственно 226 и 147 нг/мл (с интерквартиль-ным размахом в 0 - 512 и 0 - 220 соответственно). При генетически обусловленных нарушениях эндогенных путей метаболизма фенилаланина и тирозина, например, при фенилкетонурии и тирозинемии, уровень ФКК в сыворотке крови и в моче может существенно повышаться. Снижение уровня ФУК в крови и в моче, обусловленное возможными нарушениями метаболизма фенилаланина, тирозина и дофамина, описано у пациентов с большими депрессивными расстройствами и некоторыми формами шизофрении (Karoum F. et al., 1984).

Изменение содержания ФКК в крови и моче встречается и при других заболеваниях. Так, Jankowski J. et al. (2003) выявили повышенный уровень ФУК у пациентов в терминальной стадии хронической почечной недостаточности. Kopple J. D. (2007) в статье, посвященной метаболизму фенилаланина и тирозина,

приводит данные о повышении концентраций фе-нилмолочной, парагидроксифенилуксусной кислоты, парагидроксибензойной и других кислот у пациентов с хронической почечной недостаточностью. Mutsaers H. A. et al. (2011) также сообщает о повышении уровня фенилуксусной кислоты у пациентов, находящихся на терминальной стадии хронической почечной недостаточности, а Schmidt S. et al. (2008) рассматривает ФУК как один из уремических токсинов, обладающий ингибирующим эффектом в отношении экспрессии индуцибельной синтазы оксида азота (iNOS). Ингибирование iNOS, в свою очередь, угнетает функцию макрофагов и может привести к развитию иммунодефицитных состояний у таких пациентов. Повышенное содержание некоторых ФКК (например, фенилмолочной и па-рагидроксифенилмолочной) в крови наблюдается у септических больных и, скорее всего, связано с микробной деградацией фенилаланина и тирозина (Белобородова Н. В. и соавт., 2009).

Изменения в уровне парагидроксифенилуксус-ной кислоты в моче, обусловленные нарушением микробиоценоза кишечника, наблюдаются при раннем половом созревании (Qi Y. et al., 2012).

В доступной нам литературе мы не нашли сведений о содержании в крови фенилкарбоновых кислот при воспалительных заболеваниях кишечника (ВЗК), таких как язвенный колит (ЯК) и болезнь Крона (БК), а также при целиакии. Практически единственное упоминание о возможной связи ФКК с фенотипами ВЗК имеется в исследовании Jansson J. et al. (2009), показавшей, что содержание парагидроксифенил-пропионовой кислоты в фекалиях пациентов с болезнью Крона существенно выше (в 6 - 7 раз), чем у здоровых индивидуумов. Кроме того, в одном исследовании было показано, что при колоректальном раке, частота развития которого при ВЗК (особенно при язвенном колите) достоверно увеличена, уровень ФУК и ПГФУК в моче повышается (Qiu Y. et al., 2010).

Данные об уровне 5 идентифицированных фенилкарбоновых кислот в сыворотке крови больных целиакией, язвенным колитом и здоровых добровольцев представлены на рис. 1.

При анализе данных обращает на себя внимание значимое повышение уровня фенилуксусной и парагидроксифенилуксусной кислот и снижение уровня фенилпропионовой кислоты в крови у больных язвенным колитом по сравнению, как со здоровыми лицами, так и с больными целиакией (0,19 усл. ед. vs. 0,10 усл. ед. и 0,13 усл. ед.; 0,41 усл. ед. vs. 0,19 усл. ед. и 0,29 усл. ед.; 0,18 усл. ед. vs. 0,33 усл. ед. и 0,29 усл. ед.; во всех случаях различия достоверны). У больных целиакией также имелась небольшая тенденция к повышению уровня фенилуксусной и парагидроксифенилуксусной кислот в крови по сравнению со здоровыми добровольцами, однако различия в концентрациях были недостоверными. Эти данные могут свидетельствовать о возможном повышении метаболической активности некоторых видов родов Clostridia и Bacteroides, метаболизирую-щих фенилаланин и тирозин в фенилуксусную и па-рагидроксифенилуксусную кислоты, а также о вероятном снижении продукции фенилпропионовой кислоты бактерией Clostridium sporogenes у больных язвенным колитом. Изменение метаболической активности бактериальной флоры кишечника, в свою очередь, может являться следствием серьезных нарушений микробиоценоза (дисбиоз толстой кишки, синдром избыточного бактериального роста в тонкой кишке), сопровождающих как воспалительные заболевания кишечника (Fava F. & Danese S., 2011; De Cruz P. et al., 2012), так и целиакию (Rubio-Tapia A. et al., 2009; De Palma G. et al., 2010; Nistal E. et al., 2012). Кроме того, с учетом данных Qiu Y. et al. (2010), повышенный уровень ФУК и ПГФУК при язвенном колите может свидетельствовать и о более высоком риске развития колоректального рака у этой группы пациентов.

Полученные нами данные о более чем двукратном повышении уровня ПГФУК у больных язвенным колитом представляют несомненный интерес еще с одной точки зрения. Не так давно было показано, что добавление парагидроксифенилуксусной кислоты в культуру Clostridium difficile приводит к активной продукции паракрезола (токсического фенольного соединения с выраженной бактериостатической

Б >■

о

So

1_ о OS

<s ое

и о НУ

№ о О Е

¡Г5

и га

L Б

га

ü ш

J

s

H

о <u с га а ш н

Язвенный колит Целиакия Здоровые лица

БК

2-МБК

ФУК

ПГФУК

ФПК

Рис. 1. Концентрации фенилкарбоновых в сыворотке крови больных язвенным колитом, целиакией и здоровых добровольцев по данным ГХ-МС (в усл. ед.).

CD LH

активностью в отношении нормофлоры) в результате декарбоксилирования ПГФУК ферментом C. difficile. Этот феномен является уникальным свойством вида C. difficile (среди других представителей рода кло-стридий), фактически ответственным за развитие C. dfficile-ассоциированных заболеваний в условиях гиперпродукции парагидроксифенилуксусной кислоты (Selmer T. & Andrei P. I., 2001). Возможно, что данные о существенном повышении уровня ПГФУК у пациентов с ЯК помогут (хотя бы частично) объяснить повышенную частоту инфекции C. difficile при язвенном колите, подтвержденную многочисленными эпидемиологическими исследованиями, а также возможную патогенетическую связь между инфекцией C. difficile и ВЗК (Walk S. T. & Young V. B., 2008; Surawicz C. M., 2010; Bien J. et al., 2013).

Следует отметить факт 1,5 - 2-кратного повышения концентрации бензойной кислоты и 2-ме-тилбензойной кислот в сыворотке крови у больных обеих групп по сравнению со здоровыми лицами. Причина этого явления не вполне ясна, однако имеются данные о повышении уровня экскреции бен-зоата и других ФКК (ФУК и ПГФУК) с мочой при синдроме избыточного бактериального роста, сопровождающего различные заболевания желудочно-кишечного тракта, в том числе, целиакию, синдром короткой кишки и др. (van der Heiden C. et al., 1971; Lord R. S. & Bralley J. A., 2008).

Индолкарбоновые кислоты. Предшественником индолкарбоновых кислот является триптофан — незаменимая аминокислота, играющая важную роль в биосинтезе белка и являющаяся также биохимическим прекурсором таких соединений, как серото-нин и никотиновая кислота. Кроме того, получены доказательства того, что повышенный катаболизм триптофана является ключевым метаболическим процессом, поддерживающим феномен индуцированных иммунных привилегий, а управление метаболизмом триптофана в перспективе может дать новый терапевтический инструмент для коррекции гипоиммунных, гипериммунных и аутоиммунных состояний (Li L. et al., 2012). В ряде исследований было показано, что индолкарбоновые кислоты могут принимать участие в регуляции экспрессии некоторых бактериальных генов (Kline E. L. et al., 1980).

В настоящем исследовании нами были идентифицированы 2 индолкарбоновые кислоты — ин-долуксусная кислота и индолпропионовая кислота (рис. 2).

Индолуксусная кислота (ИУК) является одним из основных метаболитов триптофана, наряду с 3-индолпропионовой кислотой, индолила-крилоилглицином (indolylacryloylglycine), 5-окси-индолилуксусной кислотой (5-hydroxyindolylacetic [5-HIAA]) и 3-оксиантраниловой кислотой (3-hydro-xyanthranilic acids), а также индолом и скатолом. В невысоких концентрациях ИУК обнаруживается в моче здорового человека, причем ее содержание коррелирует с содержанием индолилакрилоилгли-цина (Marklova E. et al., 1992).

Продуцентами индолуксусной кислоты являются некоторые виды клостридий, в частности, Clostridium botulinum тип G, Clostridium difficile, Clostridium lituseburense, Clostridium putrefaciens, Clostridium subterminale и др., метаболизирующие триптофан и другие ароматические аминокислоты (Elsden S. R. & Hilton M. G., 1979; Yokoyama M. T. & Carlson J. R., 1979). Из представителей других родов ее способны вырабатывать Bacteroides thetaiotaomicron, Citrobacter sp. (семейство Enterobacteriaceae, тип Proteobacteria) и Escherichia coli (Chung K. T. et al., 1975).

При экспериментальном колите у мышей уровень ИУК в сыворотке крови и колоректальной ткани понижается, а ее содержание (наряду с содержанием янтарной и глютаминовой кислот, а также глютами-на) тесно связано с активностью воспалительного процесса (Shiomi Y. et al., 2011). Как и фенилуксус-ная кислота, индолуксусная кислота вследствие ее цитотоксичности также рассматривается как один из уремических токсинов (Vanholder R. et al., 2012).

Известно также, что индолуксусная кислота токсична для некоторых опухолевых клеток человека, в связи с чем рассматриваются возможности использования ИУК растительного происхождения (ауксина) для прицельной терапии злокачественных новообразований, например, меланомы, рака поджелудочной железы и рака мочевого пузыря (Rossiter S. et al., 2002; De Melo M. P. 2004; Jeong Y. M. et al., 2010).

В недавнем исследовании Qi Y. et al. (2012) показали, что при раннем половом созревании наблюдаются значимые изменения в уровне ИУК и ПГФУК в моче, и на этом основании сделали вывод, что раннее половое созревание может быть тесно связано с изменениями симбиотической микробиоты кишечника.

Индолпропионовая кислота (ИПК), так же как и индолуксусная кислота, является метаболитом триптофана. Физиологические функции ее до сих пор не выяснены, однако в ряде работ сообщается о ее возможности предотвращать окислительный стресс, а также о потенциальном нейропротектив-ном действии (Chyan Y. J. et al., 1999; Bendheim P. E. et al., 2002; Cheng X. et al., 2005; Karbownik M. et al., 2005, 2006; Hwang I. K. et al., 2009). Известна также способность ИПК подавлять рост Legionella pneumophila, микроорганизма, этиологически связанного с болезнью легионеров (Mandelbaum-Shavit F. et al., 1991).

Спектр микроорганизмов, способных продуцировать ИПК, по всей видимости, ограничен представителями рода Clostridia, в том числе Clostridium sporogenes и Clostridium cylindrosporum (Elsden S. R. et al., 1976; Jellet J. J. et al., 1980; Wikoff W. R. et al., 2009). Косвенным подтверждением бактериального происхождения 3-индолпропионовой кислоты могут служить данные о снижении уровня ИПК у животных после назначения антибиотиков (Young S. N. et al., 1980). Прямое подтверждение микробного происхождения ИПК было получено

в экспериментальном исследовании на мышах (обычных и безмикробных линий), результаты которого показали, что продукция индолпропионо-вой кислоты полностью зависит от микрофлоры кишечника и, в частности, от колонизации Clostridium sporogenes. ИПК обнаруживалась только в сыворотке крови обычных мышей и полностью отсутствовала в крови безмикробных мышей. Из 24 видов микроорганизмов, принадлежащих к различным типам бактерий (Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, Proteobacteria) и архей (Methanobrevibacter smithii), только Clostridium sporogenes был способен продуцировать ИПА в культуре (Wikoff W. R. et al., 2009).

В доступной нам литературе мы не нашли данных о содержании 3-индолпропионовой кислоты в крови пациентов с язвенным колитом и целиакией.

Анализ полученных нами данных показал достоверное повышение концентраций индолуксус-ной кислоты, как у больных язвенным колитом, так и у больных целиакией (1,86 усл. ед. и 1,33 усл. ед. соответственно vs. 0,51 усл. ед. у здоровых добровольцев; различия достоверны), что может быть обусловлено повышенной активностью клостридий, метаболизирующих ароматические аминокислоты, и согласуется с сопутствующим повышением уровня фенилуксусной и парагидроксифенилуксусной кислот в обеих группах больных (см. выше).

Выявленное значимое повышение уровня ин-долпропионовой кислоты у больных целиакией по сравнению с больными язвенным колитом и здоровыми лицами (1,93 усл. ед. vs. 0,46 усл. ед. и 0,70 усл. ед. соответственно; различия достоверны) может быть обусловлено возможной разницей в количестве/метаболической активности Clostridium sporogenes у больных целиакией и язвенным колитом и полностью согласуется с описанным выше снижением концентрации ФПК у пациентов с язвенным колитом.

Дикарбоновые кислоты. Из дикарбоновых кислот мы идентифицировали в сыворотке крови янтарную и фумаровую кислоты. Янтарная и фумаро-вая кислоты, наряду с щавелевоуксусной, лимонной и другими кислотами, являются интермедиатами в цикле трикарбоновых кислот (цикле Кребса), который служит универсальным конечным путем

2,50

2,00 1,50 1,00 0,50 0,00

I Язвенный колит I Целиакия I Здоровые лица

ИУК

ИПК

Рис. 2. Концентрации индолкарбоновых кислот в сыворотке крови больных целиакией, язвенным колитом и здоровых добровольцев по данным газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (в усл. ед.).

окисления углеводов, липидов и белков и играет ключевую роль в процессах глюконеогенеза, ли-погенеза и катаболизма азота. Фумаровая кислота также является одним из побочных продуктов цикла мочевины (цикла Кребса-Хензелейта), реакции которого протекают в клетках печени и обеспечивают преобразование азотосодержащих продуктов распада в мочевину.

Янтарная кислота. Основными бактериальными продуцентами янтарной кислоты в организме человека являются Bacteroides spp. (B. fragilis, B. ovatus, B. thetaiotaomicron, B. cellulosilyticus, B. caccae, B. merdae, B. stercoris и др.) (Robert C. et al., 2007; Shah H. N. et al., 2009), а также Eggerthella lenta (семейство Coriobacteriaceae, тип Actinobacteria), ранее известная как Eubacterium lentum (Белобородова Н. В. и соавт., 2011), которая в ряде случаев может быть причиной клинически выраженной бактериемии, в том числе у пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника (Thota V. R. et al., 2011; Venugopal A. A. et al., 2012). Из других представителей микробиоценоза кишечника человека янтарную кислоту способны производить Paraprevotella clara и Paraprevotella xylaniphila (семейство Prevotellaceae, тип Bacteroidetes) (Morotomi M. et al., 2009), аце-тогенная бактерия Marvinbryantia formatexigens (семейство Lachnospiraceae, тип Firmicutes), ранее известная, как Bryantella Formatexigens (Rey F. E. et al., 2010), Ruminococcus champanellensis (семейство Ruminococcaceae, тип Firmicutes) (Chassard C. et al., 2012). Некоторые микроорганизмы, например, Phascolarctobacterium succinatutens, недавно выделенная из фекалий здорового человека (семейство Acidaminococcaceae, тип Firmicutes), могут, в свою очередь, утилизировать янтарную кислоту, производимую другими кишечными бактериями, конвертируя ее в пропионовую кислоту путем де-карбоксилирования (Watanabe Y. et al., 2012).

Определение концентрации янтарной кислоты в крови и других биологических жидкостях может иметь клиническое значение. Так, уровень янтарной кислоты (как и уровень молочной кислоты) в крови повышается при гипоксических состояниях, что дает возможность рассматривать этот показатель как один из возможных маркеров гипоксии (Komaromy-Hiller G. et al., 1997). При болезни Крона концентрация янтарной кислоты в сыворотке крови повышается, при язвенном колите повышается ее количество в просвете толстой кишки (Tamura K. et al, 1995; Inagaki A. et al., 2007), однако при этом может снижаться ее содержание в колоректальной ткани (Ooi M. et al., 2011). При экспериментальном колите у мышей уровень янтарной кислоты в сыворотке крови и колоректальной ткани (наряду с уровнем индолуксусной и глютаминовой кислот, а также глютамина) тесно связан с активностью воспалительного процесса (Shiomi Y. et al., 2011). При колоректальном раке выявлено снижение концентрации янтарной кислоты в моче (Qiu Y. et al., 2010).

Б >■

о

So

1_ о OS

<s ое

и о НУ

№ о О Е

¡Г5

и га

L Б

га

ü ш

J

s

H

о <u с га а ш н

Фумаровая кислота. Из бактерий кишечной микрофлоры фумаровую кислоту, так же как и янтарную, производят представители рода Bacteroides (Bacteroides fragilis, Bacteroides thetaiotaomicron) и вышеупомянутая Eggerthella lenta, однако в гораздо меньших (в десятки раз) количествах (Белобородова Н. В. и соавт., 2011), поэтому, скорее всего, основным источником фумаровой кислоты в тканях и жидкостях организма являются не микроорганизмы, а эндогенные метаболические процессы (цикл Кребса и цикл Кребса-Хензелейта).

При воспалительных заболеваниях кишечника (как при язвенном колите, так и при болезни Крона) уровень фумаровой кислоты в сыворотке крови повышается, а содержание ее в ткани толстой кишки у пациентов с язвенным колитом и колоректаль-ным раком может снижаться (Ooi M. et al., 2011; Chan E. C. et al., 2009).

В настоящем исследовании было выявлено достоверное повышение уровня янтарной кислоты в сыворотке крови, как при язвенном колите, так и при целиакии, по сравнению со здоровыми добровольцами (в 2,8 и 1,5 раза соответственно; в обоих случаях различия достоверны) (рис. 3). Уровень фумаровой кислоты у больных обеих групп также повышался (в 2,1 и 2,6 раза соответственно; различия достоверны). Интересно, что соотношение концентраций янтарной и фумаровой кислот у больных язвенным колитом, целиакией и здоровых добровольцев значимо различалось (11,3, 4,9, и 8,4 соответственно), что может быть обусловлено различной направленностью метаболических процессов в каждой из групп. Поскольку в цикле трикарбоно-вых кислот фумаровая кислота образуется из янтарной, то повышенная утилизация янтарной кислоты, сопровождающаяся снижением ее концентрации, может приводить к повышению концентрации фу-маровой кислоты и наоборот.

(в обоих случаях различия достоверны). Уровень янтарной кислоты в сыворотке крови у здоровых лиц на фоне приема масляной кислоты и инулина не изменялся (рис. 4). Побочных эффектов при применении масляной кислоты и инулина не наблюдалось.

До лечения После лечения

Язвенный колит Целиакия Здоровые лица

Рис. 4. Динамика концентрации янтарной кислоты в сыворотке крови у больных и здоровых лиц на фоне приема масляной кислоты (бутирата) и инулина (в усл. ед.).

Количественная оценка состояния микробиоценоза выявила достоверное устранение анаэробного дисбаланса (снижение доли бактероидов, связанных с хроническим воспалением, что отражалось в уменьшении соотношения Bacteroides fragilis/ Faecalibacterium prausnitzii до нормальных значений (< 80), повышение доли некультивируемых бу-тират-продуцирующих бактерий (примерно в 1,5 раза) и уменьшение количества условно-патогенных микроорганизмов (Escherichia coli, Clostridium difficile, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis/ vulgaris, Staphylococcus aureus) в подгруппах пациентов с язвенным колитом и целиакией (2b и 3b), дополнительно получавших метабиотик (бутират + инулин). Стоит отметить, что повышение доли бу-тират-продуцирующих бактерий, играющих ключевую роль в энергетическом обеспечении кишечного эпителия, а также положительная динамика соотношения Bacteroides fragilis/Faecalibacterium prausnitzii на фоне приема масляной кислоты и инулина наблюдались и в группе практических здоровых лиц (рис. 5).

OJ LO

Язвенный колит Целиакия Здоровые лица

Янтарная кислота Фумаровая кислота

Рис. 3. Концентрации янтарной и фумаровой кислот в сыворотке крови больных целиакией, язвенным колитом и здоровых добровольцев по данным ГХ-МС (в усл. ед.).

Дополнительное применение метабиотика (масляной кислоты в комбинации с инулином) в течение 4 недель на фоне базисной терапии приводило, наряду с улучшением клинической симптоматики и показателей микробиоценоза, к достоверной нормализации уровня янтарной кислоты, как у больных язвенным колитом, так и у пациентов с целиакией

40

20

До лечения После лечения

Язвенный колит Целиакия Здоровые лица

Рис. 5. Динамика соотношения Вас1его1йе$/га§Шз/ ¥аесаНЪас1егшт ртаытНхп на фоне приема бутирата и инулина (во всех случаях различия достоверны).

Обсуждая полученные данные, следует подчеркнуть, что продукция янтарной кислоты представителями микробиоты кишечника в настоящее

140

120

100

80

60

0

время рассматривается как потенциальный фактор их вирулентности. Так, например, было показано, что Bacteroides fragiHs могут вырабатывать янтарную кислоту в количествах, способных ингибировать так называемый респираторный (окислительный) взрыв в нейтрофильных лейкоцитах за счет снижения внутриклеточного рН ^с^ет О. Б. е! а1., 1987). В исследовании АЬаиШаДа К. В. е! а1. (1997) янтарная кислота бактериального происхождения подавляла бактерицидную активность нейтрофи-лов. Роль янтарной кислоты в повреждении слизистой оболочки при экспериментальном колите у крыс была показана Fukui 8. е! а1. (1997). Введение янтарной кислоты при этом сопровождалось снижением кровотока в слизистой оболочке толстой кишки и инфильтрацией полиморфноядерных клеток, способных генерировать свободные радикалы кислорода (супероксидные радикалы), играющие значимую роль в развитии воспалительного процесса. В другом исследовании Апаке К. е! а1. (2000) подтвердили, что янтарная кислота, продуцируемая представителями рода Bacteroides (особенно В. сассае), может выступать в роли ульцерогенного фактора при экспериментальном колите у мышей. Уровень янтарной кислоты в фекалиях мышей с колитом при этом был повышен. Shiсmi У е! а1. (2011), в свою очередь, выявили достоверное снижение уровня янтарной кислоты в ткани толстой кишки у мышей с экспериментальным колитом, вызванным декстраном сульфата натрия (Б88-колит), что, по мнению авторов, может быть связано с повреждением слизистой оболочки кишечника янтарной кислотой. В сыворотке крови мышей с Б88-колитом уровень янтарной кислоты незначительно снижался (на 7-й день исследования), восстанавливаясь при этом к 10-му дню до нормальных значений.

В японском экспериментальном исследовании было показано, что в отличие от короткоцепочечных жирных кислот (КЖК), стимулирующих пролиферацию эпителиальных клеток кишечника, янтарная кислота достоверно ингибирует пролиферацию ко-лоноцитов и уменьшает размер крипт (Inagaki А. е! а1., 2007). С учетом имеющихся данных о накоплении янтарной кислоты в толстой кишке у больных язвенным колитом (Татига К. е! а1, 1995), авторы предположили, что ингибирующий эффект янтарной кислоты в отношении пролиферации эпителия толстой кишки может быть непосредственно связан как с развитием язвенного колита, так и с ухудшением течения этого заболевания.

Назначение пребиотических продуктов на основе проросшего ячменя в экспериментальных исследованиях на животных (на модели рака толстой кишки и при экспериментальном колите) приводит к достоверному снижению продукции янтарной кислоты и повышению продукции таких КЖК, как масляная. По мнению авторов, снижение продукции сукцината связано с изменениями микробиоценоза толстой кишки под действием пребиотика, в частности, с уменьшением количества Bacteroides эрр.,

вырабатывающих янтарную кислоту (Kanauchi O. et al., 2008; Komiyama Y. et al., 2011). Ранее проведенные клинические исследования показали, что назначение пребиотиков на основе проросшего ячменя достоверно снижает индекс клинической активности у пациентов с активным язвенным колитом и пролонгирует ремиссию при язвенном колите (Kanauchi O. et al., 2003; Hanai H. et al., 2004).

И наконец, в одном из последних экспериментальных исследований было установлено, что янтарная кислота микробного происхождения (источником ее могут служить грамотрицательные кишечные бактерии, например, бактероиды, Escherichia coli, Salmonella) является не чем иным, как про-воспалительной сигнальной молекулой, индуцирующей интерлейкин-ф через протеин HIF-1a (Tannahill G. M. et al., 2013).

Полиненасыщенные и насыщенные жирные кислоты. Из группы полиненасыщенных жирных кислот нами были идентифицированы линолевая и арахидоновая кислоты, из группы насыщенных — пальмитиновая кислота.

Линолевая кислота является одной из незаменимых (эссенциальных) жирных кислот и относится к классу омега-6-полиненасыщенных жирных кислот. Основной источник линолевой кислоты — жиры (как животные жиры, так и растительные масла), поступающие с пищей. Косвенно это подтверждается тем фактом, что уровень таких жирных кислот, как линолевая и пальмитиновая, коррелирует с содержанием животных и растительных жиров в пище (Uusitalo L. et al., 2011).

Биомедицинское значение линолевой кислоты заключается в том, что она участвует в синтезе арахидоновой кислоты (и, таким образом, некоторых простагландинов), а также в формировании фосфолипидов клеточных мембран. Повышенное потребление линолевой кислоты, связанное с диетическими рекомендациями, возможно, уменьшает риск сердечно-сосудистых заболеваний.

С другой стороны, линолевая кислота является прекурсором ряда окисленных биологически активных метаболитов, 9- и 13- гидроксиоктадека-диеновых кислот и 9- и 13-оксооктадекадиеновых кислот (9- и 13-HODE и 9- и 13-oxoODE), с которыми связывают некоторые патологические состояния, например, болезнь Альцгеймера и неалкогольный стеатогепатит (Ramsden C. E. et al., 2012). Кроме того, ряд авторов указывают на роль линолевой кислоты в развитии системного воспаления (опосредованно через синтез провоспалительных эйкозано-идов из арахидоновой кислоты и/или ингибирова-ние синтеза противовоспалительных эйкозаноидов из эйкозапентаеновой кислоты и/или докозагек-саеновой кислоты). Так, например, в европейском исследовании «случай — контроль», включавшем оценку характера питания у 203193 человек в возрасте 30 - 74 из Великобритании, Швеции, Дании, Германии и Италии, было показано, что повышенное потребление линолевой кислоты с пищей более

Б >■

о

So

1_ о OS

<s ое

и о НУ

№ о О Е

¡Г5

и га

L Б

га

й <и J S н и <и с га а ш н

m

1-Л

чем в 2 раза повышает риск развития язвенного колита (Tjonneland A. et al., 2009). Однако среди здоровых лиц систематический анализ результатов рандомизированных клинических исследований не выявил повышения уровня маркеров воспаления в связи с повышенным употреблением лино-левой кислоты (Johnson G. H. & Fritsche K., 2012), а исследование, проведенное в Японии, показало, что повышенное потребление линолевой кислоты (а не только альфа-линолевой кислоты, относящейся к классу омега-3-полиненасыщенных жирных кислот), напротив, связано с уменьшением уровня маркеров воспаления, таких как C-реактивный белок (Poudel-Tandukar K. et al., 2009).

Кроме линолевой кислоты вместе с молочной и мясной пищей в организм человека поступает и конъюгированная линолевая кислота (КЛА), являющаяся продуктом процессов биогидрогенизации, протекающих в рубце жвачных животных (Banni S., 2002). Кроме того, КЛА содержится в яйцах, некоторых видах грибов и растительных маслах (в минимальных количествах). Некоторые представители микробиоты кишечника человека (например, молочнокислые бактерии, такие как Lactobacillus plantarum), а также пробиотические штаммы (например, VSL#3, содержащий Lactobacillus casei, L. plantarum, L. bulgaricus, L. acidophilus, Bifidobacterium longum, B. breve, B. infantis и Streptococcus thermophilus) способны производить КЛА из линолевой кислоты (Ogawa J. et al., 2005; Bassaganya-Riera J. et al., 2012). Стоит отметить, что продукция КЛА и бактери-оцинов пробиотическими штаммами рассматривается сегодня как один из основных механизмов их терапевтического и профилактического действия (O'Shea E. F. et al., 2012). В экспериментальных исследованиях было показано, что конъюгированная линолевая кислота обладает потенциальным антиканцерогенным, антиатерогенным и, возможно, иммуномодулирующим действием (Aydin R., 2005), а также рядом других положительных эффектов, затрагивающих функции печени, метаболизм глюкозы и окислительный стресс (Dilzer A. & Park Y., 2012).

Арахидоновая кислота также относится к классу омега-6-полиненасыщенных жирных кислот, но не является незаменимой, поскольку может синтезироваться в организме из линолевой кислоты. Арахидоновая кислота входит в состав фосфоли-пидов клеточных мембран (например, клеток печени, мозга, мышечных волокон), а также является прекурсором эйкозаноидов (простагландинов, лейкотриенов и тромбоксанов) и одним из ключевых посредников воспаления. В организм человека арахидоновая кислота поступает преимущественно с пищей (мясомолочные продукты, яйца) или синтезируется из линолевой кислоты.

Пальмитиновая кислота является насыщенной жирной кислотой и входит в состав большинства растительных масел и животных жиров. Это первая жирная кислота в организме человека, синтезируемая в процессе липогенеза. Наряду с глюкозой,

насыщенные жирные кислоты (пальмитиновая и стеариновая) являются основными субстратами для синтеза АТФ, т. е. для обеспечения клеток энергией (Терешина Е. В., 2007). В организм пальмитиновая кислота поступает с пищей или синтезируется эндогенно. Повышенное потребление пальмитиновой кислоты, по данным ВОЗ, повышает риск развития сердечно-сосудистых заболеваний (Технический отчет ВОЗ № 916, 2003). Данные о продукции пальмитиновой кислоты микроорганизмами в кишечнике человека в доступных нам литературных источниках отсутствуют.

Пул свободных жирных кислот крови образован в основном пальмитиновой, стеариновой, олеиновой, линолевой и арахидоновой кислотами. Изменение концентраций этих кислот наблюдается при различных хронических заболеваниях. Так, повышенный уровень арахидоновой и пальмитиновой кислот в сыворотке крови наблюдался при колоректальном раке (Ма ^ е! а1., 2010). При раке поджелудочной железы содержание арахидоновой кислоты в плазме крови повышалось (№ауата 8. е! а1., 2010), а содержание пальмитиновой кислоты снижалось (Nishiumi 8. е! а1., 2010). При раке печени уровень пальмитиновой кислоты в сыворотке крови повышался

При воспалительных заболеваниях кишечника концентрации жирных кислот, как полиненасыщенных, так и насыщенных, в крови изменяются в зависимости от активности процесса и нозологической формы. Так, при активном язвенном колите концентрация пальмитиновой кислоты в плазме крови достоверно повышалась, в то время как концентрации линолевой и арахидоновой кислот не изменялись (Б81еуе-Сота8 М. е! а1., 1992). У больных с неактивным язвенным колитом (фаза ремиссии) уровень всех этих кислот (линолевой, арахидоновой и пальмитиновой) в плазме крови был достоверно выше, чем в контрольной группе здоровых лиц. При болезни Крона наблюдались аналогичные изменения за исключением повышения уровня пальмитиновой кислоты. Результаты этих исследований позволили авторам сделать вывод о повышенном биосинтезе исследуемых кислот при воспалительных заболеваниях кишечника (Ез1еуе-Сота8 М. е! а1., 1993).

Относительно недавнее исследование, напротив, продемонстрировало достоверное снижение уровня линолевой и арахидоновой кислот в плазме крови детей с язвенным колитом и болезнью Крона, связанное с активностью заболевания и обусловленное, по мнению авторов, малабсорбцией и малдигестией, характерными для детей, страдающих воспалительными заболеваниями кишечника (8оЛа Р. е! а1., 2005).

В настоящем исследовании было выявлено достоверное снижение уровня линолевой кислоты в сыворотке крови больных язвенным колитом по сравнению с больными целиакией и здоровыми лицами (на 41 - 52%). Концентрация арахидо-новой кислоты в сыворотке крови пациентов с язвенным колитом также была несколько снижена

70,00

60,00

50,00

40,00

30,00

20,00

10,00

0,00

I Язвенный колит I Целиакия I Здоровые лица

Линолевая кислота Арахидоновая кислота Пальмитиновая кислота

Рис. 6. Концентрации линолевой, арахидоновой и пальмитиновой кислот в сыворотке крови больных язвенным колитом, цели-акией и здоровых добровольцев по данным ГХ-МС (в усл. ед.).

по сравнению с больными целиакией и здоровыми лицами (на 21 - 23%), однако различия не были достоверными. Уровень пальмитиновой кислоты в группах больных язвенным колитом и целиакией был достоверно выше, чем в группе здоровых добровольцев (в 1,28 и 1,51 раза соответственно) (рис. 6).

Полученные нами данные не противоречат результатам опубликованных ранее исследований. Выявленные изменения в пуле свободных жирных кислот в крови больных язвенным колитом и це-лиакией, скорее всего, не связаны с нарушениями микробиоценоза. Причиной снижения уровня ли-нолевой и арахидоновой кислот при язвенном колите может быть недостаточное поступление этих кислот с пищей. Повышение уровня пальмитиновой кислоты в группах больных целиакией и язвенным колитом, в свою очередь, может быть обусловлено повышением эндогенного синтеза данной кислоты, связанного с аутоиммунным воспалением, характерным для обоих заболеваний.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Метаболомический профиль сыворотки крови и других биологических образцов (возможно, ограниченный рядом соединений, таких как КЖК, фе-нилкарбоновые, индолкарбоновые, дикарбоновые,

оксикарбоновые кислоты, некоторые аминокислоты и др.), а также отдельные высокоинформативные метаболиты (например, янтарная кислота) могут рассматриваться, по нашему мнению, как потенциальные биомаркеры активности, тяжести течения и прогноза при хронических заболеваниях кишечника, ассоциированных с нарушениями микробиоценоза (например, язвенного колита или целиакии), а исследование их уровня в динамике, в свою очередь, может служить косвенным методом оценки эффективности препаратов, механизм действия которых связан с влиянием на микробио-ту кишечника и метаболические процессы (проби-отики, пребиотики, метабиотики, кишечные антисептики и антибиотики).

Применение метабиотика (масляной кислоты в комбинации с инулином) на фоне базисной терапии месалазином у больных язвенным колитом и на фоне безглютеновой диеты у пациентов с це-лиакией улучшает клиническую симптоматику, ме-таболомический профиль сыворотки крови, и показатели микробиоценоза, достоверно устраняя анаэробный дисбаланс, повышая долю бутират-про-дуцирующих бактерий, играющих значимую роль в снабжении колоноцитов энергией, и нормализуя патологически повышенный уровень янтарной кислоты, связанной с воспалением.

ЛИТЕРАТУРА

1. Белобородова Н. В. Интеграция метаболизма человека и его микробиома при критических состояниях // Общая реаниматология. — 2012. — Т. VIII, № 4. — С. 42 - 54.

2. Белобородова Н. В., Архипова А. С., Белобородов Д. М., Бойко Н. Б., Мелько А. И., Оленин А. Ю. Хромато-масс-

спектрометрическое определение низкомолекулярных ароматических соединений микробного происхождения в сыворотке крови больных сепсисом // Клинич. лаб. диагностика. — 200б. — № 2. —

С. 3 - 6.

3. Белобородова Н. В., Байрамов И. Т., Оленин А. Ю., Федотче-

ва Н. И. Экзометаболиты некоторых анаэробных микроорганизмов микрофлоры человека // Биомедицинская химия. — 2011. — Т. 57, вып. 1. — С. 95 - 105.

4. Белобородова Н. В., Ходакова А. С., Байрамов И. Т., Оленин А. Ю. Микробный путь образования фенилкарбоновых кис-

лот в организме человека // Биохимия. — 2009. — Т. 74, вып. 12. — С. 1657 - 1663.

5. Орешко Л. С. Целиакия взрослых: особенности патогенеза, клинических проявлений, диагностики, лечения и профилактики осложнений: Автореферат дис.... д-ра мед. наук. — СПб., 2008. — 44 с.

6. Abdul-Majid KB, Kenny PA, Finlay-Jones JJ. The effect of the bacterial product, succinic acid, on neutrophil bactericidal activity. FEMS Immunol Med Microbiol. 1997 Feb; 17 (2):79 - 86.

7. Ariake K., Ohkusa T., Sakurazawa T., Kumagai J., Eishi Y., Hoshi S., Yajima T. Roles of mucosal bacteria and succinic acid in colitis caused by dextran sulfate sodium in mice // J. Med. Dent. Sci. — 2000. — Vol. 47,

No. 4. — P. 233 - 241.

8. Beloborodova N., Bairamov I., Olenin A., Shubina V., Teplova V., Fedotcheva N. Effect of phenolic acids of microbial origin on production

LЛ LЛ

-o Ln

of reactive oxygen species in mitochondria and neutrophils // J. Biomed. Sci. — 2012. — Vol. 19. — 89.

9. Bendheim P. E., Poeggeler B, Neria E, Ziv V, Pappolla MA, Chain DG. Development of indole-3-propionic acid (OXIGON) for Alzheimer's disease. J Mol Neurosci. 2002 Aug-Oct; 19 (1-2):213 - 7.

10. Bien J, Palagani V, Bozko P. The intestinal microbiota dysbiosis and Clostridium difficile infection: is there a relationship with inflammatory bowel disease? Therap Adv Gastroenterol. 2013 Jan; 6 (1):53 - 68. doi: 10.1177/1756283X12454590.

11. Chan EC, Koh PK, Mal M, Cheah PY, Eu KW, Backshall A, Cavill R, Nicholson JK, Keun HC. Metabolic profiling of human colorectal cancer using high-resolution magic angle spinning nuclear magnetic resonance (HR-MAS NMR) spectroscopy and gas chromatography mass spectrometry (GC/MS). J Proteome Res. 2009 Jan; 8 (1):352 - 61.

12. Chassard C, Delmas E, Robert C, Lawson PA, Bernalier-Donadille A. Ruminococcus champanellensis sP. nov., a cellulose-degrading bacterium from human gut microbiota. Int J Syst Evol Microbiol. 2012 Jan; 62 (Pt 1):138 - 43. Epub 2011 Feb 25.

13. Cheng X, van Breemen RB. Mass spectrometry-based screening for inhibitors of beta-amyloid protein aggregation. Anal Chem. 2005 Nov 1;77 (21):7012 - 5.

14. Cheng Y., Xie G., Chen T. et al. Distinct urinary metabolic profile of human colorectal cancer // J. Proteome Res. — 2012. — Vol. 11, No. 2. — P. 1354 - 1363.

15. Chung KT, Anderson GM, Fulk GE. Formation of indoleacetic acid by intestinal anaerobes. J Bacteriol. 1975 Oct; 124 (1):573 - 5.

16. Chyan YJ, Poeggeler B, Omar RA, Chain DG, Frangione B, Ghiso J, Pappolla MA. Potent neuroprotective properties against the Alzheimer beta-amyloid by an endogenous melatonin-related indole structure, indole-3-propionic acid. J Biol Chem. 1999 Jul 30;274 (31):21937 - 42.

17. De Cruz P, Prideaux L, Wagner J, Ng SC, McSweeney C, Kirkwood C, Morrison M, Kamm MA. Characterization of the gastrointestinal microbiota in health and inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis. 2012 Feb; 18 (2):372 - 90. doi: 10.1002/ibd. 21751. Epub 2011 May 20.

18. De Melo MP, Pithon-Curi TC, Curi R. Indole-3-acetic acid increases glutamine utilization by high peroxidase activity-presenting leukocytes. Life Sci. 2004 Aug 20;75 (14):1713 - 25.

19. De Palma G, Nadal I, Medina M, Donat E, Ribes-Koninckx C, Calabuig M, Sanz Y. Intestinal dysbiosis and reduced immunoglobulin-coated bacteria associated with coeliac disease in children. BMC Microbiol. 2010 Feb 24;10:63.

20. DuPont A. W., DuPont H. L. The intestinal microbiota and chronic disorders of the gut // Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. — 2011. — Vol. 8,

No. 9. — P. 523 - 531.

21. Elsden S. R., Hilton M. G. Amino acid utilization patterns in clostridial taxonomy. Arch Microbiol. 1979 Nov; 123 (2):137 - 41.

22. Elsden SR, Hilton MG, Waller JM. The end products of the metabolism of aromatic amino acids by Clostridia. Arch Microbiol. 1976 Apr 1;107 (3):283 - 8.

23. Fava F, Danese S. Intestinal microbiota in inflammatory bowel disease: Friend of foe? World J Gastroenterol 2011; 17 (5): 557 - 566

24. Farshidfar F., Weljie A. M., Kopciuk K. et al. Serum metabolomic profile as a means to distinguish stage of colorectal cancer // Genome Med. — 2012. — Vol. 4, No. 5. — 42.

25. Fukui S., Shimoyama T., Tamura K., Yamamura M., Satomi M. Mu-cosal blood flow and generation of superoxide in rat experimental colitis induced by succinic acid // J. Gastroenterol. — 1997. — Vol. 32, No. 4. — P. 464 - 471.

26. Hammer 0., Harper D. A. T., Ryan P. D. PAST: Paleontological statistics software package for education and data analysis. Palaeontologia Electronica (Palaeontologia Electron.) — 2001. — 4 (1). — 9 pp.

27. Hanai H., Kanauchi O., Mitsuyama K., Andoh A., Takeuchi K., Takayuki I., Araki Y., Fujiyama Y., Toyonaga A., Sata M., Kojima A., Fukuda M., Bamba T. Germinated barley foodstuff prolongs remission in patients with ulcerative colitis // Int. J. Mol. Med. — 2004. — Vol. 13, No. 5. — P. 643 - 647.

28. Hisamatsu T., Okamoto S., Hashimoto M., Muramatsu T., Andou A., Uo M., Kitazume M. T., Matsuoka K., Yajima T., Inoue N., Kanai T., Ogata H., Iwao Y., Yamakado M., Sakai R., Ono N., Ando T., Suzuki M., Hibi T. Novel, objective, multivariate biomarkers composed of plasma amino acid profiles for the diagnosis and assessment of inflammatory bowel disease // PLoS One. — 2012. — Vol. 7, No. 1. — e31131.

29. Hwang I. K., Yoo KY, Li H, Park OK, Lee CH, Choi JH, Jeong YG, Lee YL, Kim YM, Kwon YG, Won MH. Indole-3-propionic acid attenuates neuronal damage and oxidative stress in the ischemic hippocampus. J Neurosci Res. 2009 Jul; 87 (9):2126 - 37.

30. Inagaki A., Ichikawa H., Sakata T. Inhibitory effect of succinic acid on epithelial cell proliferation of colonic mucosa in rats // J. Nutr. Sci. Vi-taminol. — 2007. — Vol. 53, No. 4. — P. 377 - 379.

31. Jankowski J, van der Giet M, Jankowski V, Schmidt S, Hemeier M, Mahn B, Giebing G, Tolle M, Luftmann H, Schluter H, Zidek W, Te-

pel M. Increased plasma phenylacetic acid in patients with end-stage renal failure inhibits iNOS expression. J Clin Invest. 2003 Jul; 112 (2):256 - 64.

32. Jansson J, Willing B, Lucio M, Fekete A, Dicksved J, Halfvarson J, Tysk C, Schmitt-Kopplin P. Metabolomics reveals metabolic biomarkers of Crohn's disease. PLoS One. 2009 Jul 28;4 (7):e6386.

33. Jellet JJ, Forrest TP, Macdonald IA, Marrie TJ, Holdeman LV. Production of indole-3-propanoic acid and 3- (p-hydroxyphenyl) propanoic acid by Clostridium sporogenes: a convenient thin-layer chromatography detection system. Can J Microbiol. 1980 Apr; 26 (4):448 - 53.

34. Jeong YM, Oh MH, Kim SY, Li H, Yun HY, Baek KJ, Kwon NS, Kim WY, Kim DS. Indole-3-acetic acid/horseradish peroxidase induces apoptosis in TCCSUP human urinary bladder carcinoma cells. Pharmazie. 2010 Feb; 65 (2):122 - 6.

35. Kanauchi O., Mitsuyama K., Andoh A., Iwanaga T. Modulation of intestinal environment by prebiotic germinated barley foodstuff prevents chemo-induced colonic carcinogenesis in rats // Oncol. Rep. — 2008. — Vol. 20, No. 4. — P. 793 - 801.

36. Kanauchi O., Mitsuyama K., Homma T., Takahama K., Fujiyama Y., Andoh A., Araki Y., Suga T., Hibi T., Naganuma M., Asakura H., Na-kano H., Shimoyama T., Hida N., Haruma K., Koga H., Sata M., Tomi-yasu N., Toyonaga A., Fukuda M., Kojima A., Bamba T. Treatment of ulcerative colitis patients by long-term administration of germinated barley foodstuff: multi-center open trial // Int. J. Mol. Med. — 2003. — Vol. 12, No. 5. — P. 701 - 704.

37. Karbownik M, Stasiak M, Zasada K, Zygmunt A, Lewinski A. Comparison of potential protective effects of melatonin, indole-3-propionic acid, and propylthiouracil against lipid peroxidation caused by potassium bromate in the thyroid gland. J Cell Biochem. 2005 May 1;95 (1):131 - 8.

38. Karbownik M, Stasiak M, Zygmunt A, Zasada K, Lewinski A. Protective effects of melatonin and indole-3-propionic acid against lipid per-oxidation, caused by potassium bromate in the rat kidney. Cell Biochem Funct. 2006 Nov-Dec; 24 (6):483 - 9.

39. Karoum F, Potkin S, Chuang LW, Murphy DL, Liebowitz MR, Wyatt RJ. Phenylacetic acid excretion in schizophrenia and depression: the origins of PAA in man. Biol Psychiatry. 1984 Feb; 19 (2):165 - 78.

40. Kline EL, Brown CS, Bankaitis V, Montefiori DC, Craig K. Metabolite gene regulation of the L-arabinose operon in Escherichia coli with indoleacetic acid and other indole derivatives. Proc Natl Acad Sci U S A. 1980 Apr; 77 (4):1768 - 72.

41. Komaromy-Hiller G, Sundquist PD, Jacobsen LJ, Nuttall KL. Serum succinate by capillary zone electrophoresis: marker candidate for hypoxia. Ann Clin Lab Sci. 1997 Mar-Apr; 27 (2):163 - 8.

42. Komiyama Y., Mitsuyama K., Masuda J., Yamasaki H., Takedatsu H., Andoh A., Tsuruta O., Fukuda M., Kanauchi O. Prebiotic treatment in experimental colitis reduces the risk of colitic cancer // J. Gastroenterol. Hepatol. — 2011. — Vol. 26, No. 8. — P. 1298 - 1308.

43. Kopple JD. Phenylalanine and tyrosine metabolism in chronic kidney failure. J Nutr. 2007 Jun; 137 (6 Suppl 1):1586S-1590S; discussion 1597S-1598S.

44. Lambert M. A., Moss C. W. Production of p-hydroxyhydrocinnamic acid from tyrosine by Peptostreptococcus anaerobius. J Clin Microbiol.

1980 Aug; 12 (2):291 - 3.

45. Li L., Huang L., Lemos H. P., Mautino M., Mellor A. L. Altered tryp-tophan metabolism as a paradigm for good and bad aspects of immune privilege in chronic inflammatory diseases. Front Immunol. 2012;3:109. Epub 2012 May 11.

46. Li M, Wang B, Zhang M, Rantalainen M, Wang S, Zhou H, Zhang Y, Shen J, Pang X, Zhang M, Wei H, Chen Y, Lu H, Zuo J, Su M, Qiu Y, Jia W, Xiao C, Smith LM, Yang S, Holmes E, Tang H, Zhao G, Nicholson JK, Li L, Zhao L. Symbiotic gut microbes modulate human metabolic phenotypes. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Feb 12;105 (6):2117 - 22. Epub 2008 Feb 5.

47. Lord RS, Bralley JA. Clinical applications of urinary organic acids. Part I: Detoxification markers. Altern Med Rev. 2008 Sep; 13 (3):205 - 15.

48. Lord RS, Bralley JA. Clinical applications of urinary organic acids. Part 2. Dysbiosis markers. Altern Med Rev. 2008 Dec; 13 (4):292 - 306.

49. Louis P, Flint HJ. Development of a semiquantitative degenerate realtime pcr-based assay for estimation of numbers of butyryl-coenzyme A (CoA) CoA transferase genes in complex bacterial samples. Appl Environ Microbiol. 2007 Mar; 73 (6):2009 - 12.

50. Louis P, Flint HJ. Diversity, metabolism and microbial ecology of butyrate-producing bacteria from the human large intestine. FEMS Microbiol Lett. 2009 May; 294 (1):1 - 8. doi: 10.1111/j. 1574 - 6968.2009.01514.x. Epub 2009 Feb 13.

51. Mandelbaum-Shavit F, Barak V, Saheb-Tamimi K, Grossowicz N. Susceptibility of Legionella pneumophila grown extracellularly and in human monocytes to indole-3-propionic acid. Antimicrob Agents Chemother. 1991 Dec; 35 (12):2526 - 30.

52. Mao LF, Chu C, Schulz H. Hepatic beta-oxidation of 3-phenylpropionic acid and the stereospecific dehydration of (R) — and (S) — 3-hydroxy-3-phenylpropionyl-CoA by different enoyl-CoA hydratases. Biochemistry. 1994 Mar 22;33 (11):3320 - 6.

53. Marklová E, Hak J, Parízek J, Morávek P. Urinary excretion of some metabolites of tryptophan in malignant diseases. Sb Ved Pr Lek Fak Karlovy Univerzity Hradci Kralove. 1992;35 (3):275 - 9.

54. Mayrand D, Bourgeau G. Production of phenylacetic acid by anaerobes. J Clin Microbiol. 1982 Oct; 16 (4):747 - 50.

55. Morotomi M, Nagai F, Sakon H, Tanaka R. Paraprevotella clara gen. nov., sP. nov. and Paraprevotella xylaniphila sP. nov., members of the family 'Prevotellaceae'isolated from human faeces. Int J Syst Evol Microbiol. 2009 Aug; 59 (Pt 8):1895 - 900. Epub 2009 Jun 30.

56. Mutsaers HA, van den Heuvel LP, Ringens LH, Dankers AC, Russel FG, Wetzels JF, Hoenderop JG, Masereeuw R. Uremic toxins inhibit transport by breast cancer resistance protein and multidrug resistance protein 4 at clinically relevant concentrations. PLoS One. 2011 Apr 4;6 (4):e18438.

57. Nicholson J. K., Lindon J. C., Holmes E. 'Metabonomics': understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data // Xenobiotica. — 1999. — Vol. 29, No. 11. — P. 1181 - 1189.

58. Nishiumi S., Kobayashi T., Ikeda A. et al. A novel serum metabolomics-based diagnostic approach for colorectal cancer // PLoS One. — 2012. — Vol. 7, No. 7. — e40459.

59. Nistal E, Caminero A, Vivas S, Ruiz de Morales JM, Sáenz de Miera LE, Rodríguez-Aparicio LB, Casqueiro J. Differences in faecal bacteria populations and faecal bacteria metabolism in healthy adults and celiac disease patients. Biochimie. Volume 94, Issue 8, August 2012, Pages 1724 - 1729.

60. Nordlund E., Aura AM, Mattila I, Kosso T, Rouau X, Poutanen K. Formation of phenolic microbial metabolites and short-chain Fatty acids from rye, wheat, and oat bran and their fractions in the metabolical in vitro colon model. J Agric Food Chem. 2012 Aug 22;60 (33):8134 - 45. Epub 2012 Aug 14.

61. Ooi M, Nishiumi S, Yoshie T, Shiomi Y, Kohashi M, Fukunaga K, Nakamura S, Matsumoto T, Hatano N, Shinohara M, Irino Y, Takenawa T, Azuma T, Yoshida M. GC/MS-based profiling of amino acids and TCA cycle-related molecules in ulcerative colitis. Inflamm Res. 2011 Sep; 60 (9):831 - 40. Epub 2011 Apr 27.

62. Osipov G. A., Verkhovtseva N. V. Study of human microecology by mass spectrometry of microbial markers // Benef. Microbes. — 2011. — Vol. 2, No. 1. — P. 63 - 78.

63. Pauling L., Robinson A. B., Teranishi R., Cary P. Quantitative analysis of urine vapor and breath by gas-liquid partition chromatography // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. — 1971. — Vol. 68, No. 10. — P. 2374 - 2376.

64. Psychogios N, Hau DD, Peng J, Guo AC, Mandal R, Bouatra S, Sinel-nikov I, Krishnamurthy R, Eisner R, Gautam B, Young N, Xia J, Knox C, Dong E, Huang P, Hollander Z, Pedersen TL, Smith SR, Bamforth F, Greiner R, McManus B, Newman JW, Goodfriend T, Wishart DS. The human serum metabolome. PLoS One. 2011 Feb 16;6 (2):e16957. doi: 10.1371/journal. pone. 0016957.

65. Qi Y, Li P, Zhang Y, Cui L, Guo Z, Xie G, Su M, Li X, Zheng X, Qiu Y, Liu Y, Zhao A, Jia W, Jia W. Urinary metabolite markers of precocious puberty. Mol Cell Proteomics. 2012 Jan; 11 (1):M111.011072. Epub 2011 Oct 25.

66. Qiu Y., Cai G., Su M. et al. Urinary metabonomic study on colorectal cancer // J. Proteome Res. — 2010. — Vol. 9, No. 3. — P. 1627 - 1634.

67. Rachmilewitz D. Coated mesalazine (5-aminosalicylic acid) versus sulphasalazine in the treatment of active ulcerative colitis: a randomised trial. Br Med J. 1989;298:82 - 86.

68. Rey FE, Faith JJ, Bain J, Muehlbauer MJ, Stevens RD, Newgard CB, Gordon JI. Dissecting the in vivo metabolic potential of two human gut acetogens. J Biol Chem. 2010 Jul 16;285 (29):22082 - 90. Epub 2010 May 5.

69. Robert C, Chassard C, Lawson PA, Bernalier-Donadille A. Bacte-roides cellulosilyticus sP. nov., a cellulolytic bacterium from the human gut microbial community. Int J Syst Evol Microbiol. 2007 Jul; 57 (Pt 7):1516 - 20.

70. Rossiter S, Folkes LK, Wardman P. Halogenated indole-3-acetic acids as oxidatively activated prodrugs with potential for targeted cancer therapy. Bioorg Med Chem Lett. 2002 Sep 16;12 (18):2523 - 6.

71. Rotstein OD, Nasmith PE, Grinstein S. The Bacteroides by-product succinic acid inhibits neutrophil respiratory burst by reducing intracel-lular pH. Infect Immun. 1987 Apr; 55 (4):864 - 70.

72. Rubio-Tapia A, Barton SH, Rosenblatt JE, Murray JA. Prevalence of small intestine bacterial overgrowth diagnosed by quantitative culture of intestinal aspirate in celiac disease. J Clin Gastroenterol. 2009 Feb; 43 (2):157 - 61.

73. Schicho R., Shaykhutdinov R., Ngo J., Nazyrova A., Schneider C., Panaccione R., Kaplan G. G., Vogel H. J., Storr M. Quantitative metabo-lomic profiling of serum, plasma, and urine by *H NMR spectroscopy discriminates between patients with inflammatory bowel disease and

healthy individuals // J. Proteome Res. — 2012. — Vol. 11, No. 6. —

P. 3344-3357.

74. Schmidt S, Westhoff TH, Krauser P, Ignatius R, Jankowski J, Jankowski V, Zidek W, van der Giet M. The uraemic toxin phenylacetic acid impairs macrophage function. Nephrol Dial Transplant. 2008 Nov; 23 (11):3485 - 93. Epub 2008 May 14.

75. Schroeder KW, Tremaine WJ, Ilstrup DM. Coated oral 5-amino-salicylic acid therapy for mildly to moderately active ulcerative colitis. A randomized study. N Engl J Med. 1987 Dec 24;317 (26):1625 - 9.

76. Selmer T, Andrei PI. p-Hydroxyphenylacetate decarboxylase from Clostridium difficile. A novel glycyl radical enzyme catalysing the formation of p-cresol. Eur J Biochem. 2001 Mar; 268 (5):1363 - 72.

77. Shah HN, Olsen I, Bernard K, Finegold SM, Gharbia S, Gupta RS. Approaches to the study of the systematics of anaerobic, gram-negative, non-sporeforming rods: current status and perspectives. Anaerobe. 2009 Oct; 15 (5):179 - 94. Epub 2009 Aug 18.

78. Shiomi Y, Nishiumi S, Ooi M, Hatano N, Shinohara M, Yoshie T, Kondo Y, Furumatsu K, Shiomi H, Kutsumi H, Azuma T, Yoshida M. GC-MS-based metabolomic study in mice with colitis induced by dextran sulfate sodium. Inflamm Bowel Dis. 2011 Nov; 17 (11):2261 - 74. doi: 10.1002/ibd. 21616. Epub 2011 Feb 1.

79. Smith E. A., Macfarlane G. T. Enumeration of human colonic bacteria producing phenolic and indolic compounds: effects of pH, carbohydrate availability and retention time on dissimilatory aromatic amino acid metabolism. J Appl Bacteriol. 1996 Sep; 81 (3):288 - 302.

80. Song Y. L., Liu C. X., McTeague M., Summanen P., Finegold S. M. Clos-tridium bartlettii sP. nov., isolated from human faeces. Anaerobe. 2004 Jun; 10 (3):179 - 84.

81. Surawicz CM. Le microbiote dans les diarrhées infectieuses [The microbiota and infectious diarrhea]. Gastroenterol Clin Biol. 2010 Sep; 34 Suppl 1: S29-36. doi: 10.1016/S0399-8320 (10) 70018-X.

82. Sutherland LR, Martin F, Greer S, Robinson M, Greenberger N, Saibil F, Martin T, Sparr J, Prokipchuk E, Borgen L. 5-Aminosalicylic acid enema in the treatment of distal ulcerative colitis, proctosigmoiditis, and proctitis. Gastroenterology. 1987 Jun; 92 (6):1894 - 8.

83. Tamura K., Yamamura M., Satomi M. Effect of butyrate on colonic mucosa // Jpn. J. Parent. Enter. Nutr. — 1995. — Vol. 17. — P. 481 - 484.

84. Tannahill GM, Curtis AM, Adamik J, Palsson-McDermott EM, McGettrick AF, Goel G, Frezza C, Bernard NJ, Kelly B, Foley NH, Zheng L, Gardet A, Tong Z, Jany SS, Corr SC, Haneklaus M, Caffrey BE, Pierce K, Walmsley S, Beasley FC, Cummins E, Nizet V, Whyte M, Taylor CT, Lin H, Masters SL, Gottlieb E, Kelly VP, Clish C, Auron PE, Xavier RJ, O'Neill LA. Succinate is an inflammatory signal that induces IL-1ß through HIF-1a. Nature. 2013 Apr 11;496 (7444):238 - 42. doi: 10.1038/ nature11986. Epub 2013 Mar 24.

85. Thota VR, Dacha S, Natarajan A, Nerad J. Eggerthella lenta bacteremia in a Crohn's disease patient after ileocecal resection. Future Microbiol. 2011 May; 6 (5):595 - 7.

86. Tremaroli V., Bäckhed F. Functional interactions between

the gut microbiota and host metabolism // Nature. — 2012. — Vol. 489, No. 7415. — P. 242 - 249.

87. van der Heiden C, Wauters EA, Duran M, Wadman SK, Ketting D. Gas chromatographic analysis of urinary tyrosine and phenylalanine metabolites in patients with gastrointestinal disorders. Clin Chim Acta. 1971 Sep; 34 (2):289 - 96.

88. Vanholder R, Schepers E, Pletinck A, Neirynck N, Glorieux G. An update on protein-bound uremic retention solutes. J Ren Nutr. 2012 Jan; 22 (1):90 - 4. doi: 10.1053/j. jrn. 2011.10.026.

89. Venugopal AA, Szpunar S, Johnson LB. Risk and prognostic factors among patients with bacteremia due to Eggerthella lenta. Anaerobe. 2012 Aug; 18 (4):475 - 8. Epub 2012 Jun 4.

90. Walk ST, Young VB. Emerging Insights into Antibiotic-Associated Diarrhea and Clostridium difficile Infection through the Lens of Microbial Ecology. Interdiscip Perspect Infect Dis. 2008;2008:125081. doi: 10.1155/2008/125081. Epub 2008 Dec 4.

91. Watanabe Y, Nagai F, Morotomi M. Characterization of Phascolarc-tobacterium succinatutens sP. nov., an asaccharolytic, succinate-utilizing bacterium isolated from human feces. Appl Environ Microbiol. 2012 Jan; 78 (2):511 - 8. Epub 2011 Nov 11.

92. Wikoff WR, Anfora AT, Liu J, Schultz PG, Lesley SA, Peters EC, Siuzdak G. Metabolomics analysis reveals large effects of gut microflora on mammalian blood metabolites. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Mar 10;106 (10):3698 - 703. Epub 2009 Feb 20.

93. Yokoyama MT, Carlson JR. Microbial metabolites of tryptophan in the intestinal tract with special reference to skatole. Am J Clin Nutr. 1979 Jan; 32 (1):173 - 8.

94. Young SN, Anderson GM, Gauthier S, Purdy WC. The origin of in-doleacetic acid and indolepropionic acid in rat and human cerebrospinal fluid. J Neurochem. 1980 May; 34 (5):1087 - 92.

S >

CT

So L o

0-ïï

<s oe

u o

H y

m o a -

s ^ ¡^

u ID L

B ID

s/

Û U J S

1-0 u c

ID

a

tu I-

LH