CC BY
188
УДК 616.34-002.44-078
МЕТАБОЛОМ СЫВОРОТКИ КРОВИ И МИКРОБИОТА КИШЕЧНИКА ПРИ ЯЗВЕННОМ КОЛИТЕ И ЦЕЛИАКИИ
С.И. Ситкин 12, Е.И. Ткаченко 1, Т.Я. Вахитов2, Л.С. Орешко 1, Т.Н. Жигалова 1, Е.Б. Авалуева 1 1 Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова,
Санкт-Петербург, Россия 2 НИИ особо чистых препаратов, Санкт-Петербург, Россия
SERUM METABOLOME AND GUT MICROBIOTA IN ULCERATIVE COLITIS
AND CELIAC DISEASE
S. Sitkin 12, E. Tkachenko 1, T. Vakhitov2, L. Oreshko 1, T. Zhigalova 1, E. Avalueva1 1 North-West State Medical University named after I.I. Mechnikov, Saint-Petersburg, Russia 2 State Research Institute of Highly Pure Biopreparations, Saint-Petersburg, Russia
© Коллектив авторов, 2014
Одной из целей метаболомики является изучение ответных реакций организма на патофизиологические воздействия путем оценки уровней низкомолекулярных метаболитов в биологических жидкостях и тканях, а также их динамики. Микробиота кишечника вовлечена в развитие аутоиммунного воспаления при язвенном колите и целиакии. Целью исследования явилось изучение методом ГХ-МС метаболома сыворотки крови у пациентов с язвенным колитом и целиакией. В образцах сыворотки крови, полученных от 75 пациентов (20 пациентов с легкими и среднетяжелыми формами язвенного колита, 35 пациентов с целиакией и 20 практически здоровых добровольцев), было идентифицировано 84 метаболита, по крайней мере, 18 из которых имели комбинированное происхождение (эндогенное + микробное). В сыворотке крови пациентов с язвенным колитом выявлено значимое повышение уровня фенилуксусной, парагидроксифенилуксусной, индолуксусной, янтарной и фумаровой кислот, а также снижение уровня фенилпропионовой кислоты. У пациентов с целиакией отмечалось достоверное повышение индолуксусной, индолпропионовой, янтарной и фумаровой кислот. Повышенный уровень янтарной кислоты подтверждал гипотезу о ее возможном повреждающем действии на слизистую оболочку кишечника, особенно при язвенном колите. Пероральное применение метабиотика (масляной кислоты в комбинации с инулином) на фоне базисной терапии месалазином у больных язвенным колитом и на фоне безглютеновой диеты у пациентов с целиакией улучшало клиническую симптоматику, метаболомический профиль сыворотки крови и показатели микробиоценоза, достоверно устраняя анаэробный дисбаланс, повышая количество бутират-продуцирующих бактерий и нормализуя патологически повышенный уровень янтарной кислоты.
Ключевые слова: бутират, инулин, метабиотики, метаболом, метаболомика, целиакия, язвенный колит.
One of the aims of metabolomics is to research the response of an organism to a pathophysiological insult by measuring the concentrations of small molecule metabolites in biofluids and tissues and its dynamics. Gut microbiota is most probably involved in the development and maintenance of autoimmune inflammation in ulcerative colitis and celiac disease. The aim of this study was to investigate GC-MS-based serum metabolomic profiles in UC and CD patients. Serum metabolic profiles were collected from 75 individuals: 20 patients with mild-moderate active UC, 35 CD patients, and 20 healthy controls (HC). We characterized 84 serum metabolites by use GC-MS. 18 metabolites at least have a combined (human + microbial) origin. In serum of UC patients, phenylacetic acid (PAA), 4-hydroxyphenylacetic acid (4-HPAA), 3-indolylacetic acid (IAA), succinic acid (SA) and fumaric acid (FA) were the metabolites most prominently increased, whereas 3-phenylpropionic acid (PPA) was significantly decreased. Serum of CD patients showed significant increases in IAA, 3-indolepropionic acid (IPA), SA and FA. Increased serum levels of succinic acid suggest its possible damaging effect on intestinal mucosa especially in ulcerative colitis. Orally administered butyrate plus inulin as supplement to mesalazine in UC or gluten free diet in CD was effective in reducing disease activity with a marked improvement of serum metabolomic profiles (including SA reduction) and gut microbiota in both diseases.
Key words: butyrate, celiac disease, inulin, metabiotics, metabolome, metabolomics, ulcerative colitis.
Введение
Метаболомика, наряду с другими omics-технологиями (геномикой, транскриптомикой и протеомикой), является неотъемлемой частью современной молекулярной биологии и одним из наиболее развивающихся научных направлений как в фундаментальной, так и в клинической медицине. Метаболомика занимается изучением низкомолекулярных соединений (НМС), входящих в состав метаболома, представляющего собой комплекс всех низкомолекулярных (как правило, не более 1-1,5 кДа) метаболитов в клетке, ткани, органе, биологической жидкости, являющихся промежуточными или конечными продуктами обмена веществ.
Отличительной особенностью метаболоми-ческих исследований в гастроэнтерологии является то, что один из акцентов в них, а иногда и основной акцент, делается на изучение метаболитов микробного происхождения. Кишечник (прежде всего толстая кишка) в «суперорганизме» человека и микробиоты представляет собой своеобразный биореактор с практически неограниченным метаболическим потенциалом, определяемым возможностями именно микробиома. Организм человека при этом «сотрудничает» с микробиотой благодаря так называемому явлению метаболической интеграции, существование которого недавно было постулировано отечественными учеными [1]. При этом человек получает от микроорганизмов целый ряд ключевых метаболитов, не только поддерживающих его энергетический баланс (короткоцепочечные жирные кислоты и др.), но и активно участвующих в регуляции экспрессии его генов, нейро-трансмиссии и иммуномодуляции [2].
По мнению ряда исследователей, уровень ряда низкомолекулярных метаболитов в крови, например некоторых карбоновых кислот, во многом определяется именно метаболической активностью микробиоты кишечника [1, 3]. В связи с этим особый интерес представляют метаболомические исследования при таких заболеваниях органов пищеварения, как воспалительные заболевания кишечника (язвенный колит и болезнь Крона), синдром раздраженного кишечника (СРК), целиакия (глютеновая энтеропатия), кишечные инфекции (Clostridium difficile, Salmonella spp., Campylobacter jejuni) и др.), где роль нарушений микробиоценоза кишечника весьма велика [4].
Дифференциально-диагностические возможности метаболомических исследований
были продемонстрированы в исследовании Schicho R. и соавт. [5], показавшем, что количественное метаболомическое профилирование сыворотки, плазмы и мочи позволяет достоверно разделить группы пациентов с ВЗК и здоровых лиц. При этом у пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника уровень метанола, маннозы, изолейцина, муравьиной и 3-метил-2-оксовалериановой кислот в крови был значимо повышен, а уровень мочевины и лимонной кислоты понижен. Изменение уровня некоторых метаболитов у больных ВЗК (повышение уровня креатина в плазме, снижение уровня гиппуровой кислоты в моче), по мнению авторов, могло быть связано с нарушениями микробиоценоза кишечника. В другом исследовании были показаны возможности многомерного индекса на основе технологии AminoIndex™, отражающего метаболомический аминокислотный профиль плазмы крови («аминограмму») и позволяющего проводить дифференциальную диагностику как между пациентами с язвенным колитом и болезнью Крона, так и между больными ВЗК и здоровыми лицами [6].
Цель исследования: изучение метаболома сыворотки крови у пациентов с язвенным колитом и целиакией методом газовой хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС), а также оценка динамики изменений метаболомического профиля и показателей микробиоценоза кишечника на фоне приема метабиотика - комбинированного препарата масляной кислоты (бутирата кальция) и инулина.
Материалы и методы
В открытое сравнительное рандомизированное исследование включались обследованные практически здоровые лица (добровольцы) обоего пола в возрасте от 18 до 60 лет и соответствующие им по полу и возрасту пациенты с легкими/среднетяжелыми формами язвенного колита в фазе обострения и больные целиакией, подписавшие добровольное информированное согласие на участие в исследовании. Всего в исследование было включено 75 пациентов: 20 пациентов с легкими и среднетяжелыми формами язвенного колита, 35 пациентов с целиакией и 20 практически здоровых добровольцев.
Диагноз язвенного колита устанавливался на основании данных анамнеза, эндоскопического (колоноскопия), гистоморфологическо-го (гистологическое исследование биоптатов
слизистой оболочки толстой кишки) и биохимического исследований. Клиническая и эндоскопическая активность воспалительного процесса оценивались с помощью индексов Мейо и Рахмилевича [7]. Диагноз це-лиакии устанавливали на основании данных анамнеза, эндоскопического, гистоморфоло-гического и биохимического исследований (морфометрия слизистой оболочки ретробуль-барного отдела двенадцатиперстной кишки, HLA-типирование, иммунологическое исследование крови) [8].
В исследование не включались пациенты с тяжелыми и осложненными формами язвенного колита (в том числе пациенты с внеки-шечными осложнениями и проявлениями), требующими назначения кортикостероидов и/или иммуносупрессантов, пациенты с хроническими диффузными заболеваниями печени различной этиологии, пациенты с тяжелыми сопутствующими заболеваниями системного характера, в том числе пациенты с сердечно-сосудистой, дыхательной, печеночной и почечной недостаточностью, пациенты с эндокринной патологией, а также женщины в период беременности и лактации.
Здоровые добровольцы (группа 1) в течение 28 дней получали метабиотик - комбинированный препарат масляной кислоты и инулина по 3 табл. в день.
Больные язвенным колитом (группа 2) и больные целиакией (группа 3) были рандоми-зированы внутри своих групп в 2 подгруппы (2а и 2Ь, 3а и 3Ь соответственно). Пациенты, вошедшие в подгруппы 2а и 3а, в течение 28 дней получали только стандартную терапию - пе-роральный месалазин (салофальк в таблетках или гранулах) в дозе 3,0 г в сутки при язвенном колите (при необходимости - в комбинации с ректальным месалазином в форме свечей, суспензии или пены в дозе 7,0-14,0 г в неделю и средствами симптоматической терапии) и без-глютеновую диету при целиакии.
Пациенты, вошедшие в подгруппы 2Ь и 3Ь, получали в течение 28 дней в дополнение к стандартной терапии метабиотик - комбинированный препарат масляной кислоты (бутирата) и инулина по 3 табл. в день.
Прием любых антибактериальных, противовирусных, противогрибковых и противопрото-зойных средств, пробиотиков, пребиотиков и препаратов (БАД к пище), содержащих бактериальные метаболиты, в течение всего периода исследования исключался.
Забор венозной крови, получение и хранение сыворотки для целей исследований проводили в соответствии с действующими стандартами. В рамках исследования был создан банк сывороток крови. Исследование проводили на газовом хроматографе c масс-спектрометром GCMS-QP2010 Plus (Shimadzu Corporation, Япония).
Во всех группах оценивали состояние микробиоценоза толстой кишки до и после назначения метабиотика (в 0-1-й и 29-30-й дни). Для количественного определения микроорганизмов ДНК, выделенную из образцов кала, подвергали полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени. Для идентификации группы бутират-продуцирующих бактерий методом ПЦР в реальном времени использовали соответствующие праймеры: Butyryl-CoA CoA transferases (R. hom., R. hominis A2-183; E. hal.,
E. hallii L2-7; A. cac. I, A. caccae L1-92; F. prau.,
F. prausnitzii A2-165), Acetyl-CoA hydrolase (D. haf., D. hafniense), 4-Hydroxybutyrate CoA transferases (C. klu., C. kluyveri; C. tet., C. tetani; A. cac. II, A. caccae L1-92; C. am., C. aminobutyricum) [9].
Статистическую обработку данных проводили стандартными методами с использованием программ Microsoft Excel 2010, SPSS и PAST.
Результаты и их обсуждение
В ходе исследования метаболома крови человека методом ГХ-МС в сыворотке крови было идентифицировано 84 низкомолекулярных соединения. По количеству метаболитов этот результат хорошо согласуется с данными, полученными в других лабораториях, и даже превосходит некоторые из них. Так, например, международной группе зарубежных ученых -авторов базы данных Serum Metabolome database (SMDB) (http://www.serummetabolome.ca) аналогичным методом удалось идентифицировать 74 метаболита (Psychogios N. et al., 2011), среди которых 21 составляли аминокислоты (АК), а 10 - сахара.
Из идентифицированных 84 соединений 18 входили и в состав выделенных нами ранее экзометаболитов бактерий. Еще, как минимум, 7 метаболитов, по данным литературы, могли иметь двойное (эндогенное + микробное) или же преимущественно микробное происхождение. Средние показатели по содержанию этих метаболитов были различны для здоровых людей, больных целиакией и язвенным колитом.
Фенилкарбоновые кислоты. Основным источником фенилкарбоновых кислот (ФКК) в организме человека служат ароматические
аминокислоты - фенилаланин и тирозин. В сыворотке крови здоровых добровольцев и пациентов с целиакией и язвенным колитом методом ГХ-МС нами были идентифицированы такие ФКК, как бензойная кислота (БК), фенилук-сусная кислота (ФУК), фенилмасляная кислота (ФМК), фенилпропионовая кислота (ФПК), парагидроксифенилуксусная (4-оксифенилук-сусная) кислота (ПГФУК) и 2-метилбензойная кислота (2-МБК).
С точки зрения изучения метаболической активности микробиоты кишечника наибольший интерес из идентифицированных нами ФКК представляют фенилуксусная, парагидроксифенилуксусная, фенилпропионовая и бензойная кислоты. Из постоянных представителей анаэробной флоры организма человека в метаболизме ароматических аминокислот принимают участие в основном представители двух родов - Clostridia (тип Firmicutes) и Bacteroides (тип Bacteroidetes). Так, например, Clostridium botulinum тип G и Clostridium subterminale ме-таболизируют фенилаланин и тирозин в фе-нилуксусную и парагидроксифенилуксусную кислоты [10]. Subdoligranulum variabile (кластер Clostridium leptum), не так давно выделенный из фекалий человека, также может вырабатывать парагидроксифенилуксусную кислоту. Из числа клостридий, наиболее часто встречающихся в кишечнике, такие виды, как Clostridium bifermentans, Clostridium difficile, Clostridium perfringens и Clostridium sordellii активно продуцируют фенилуксусную кислоту, а Clostridium sporogenes - фенилпропионовую и параги-дроксифенилпропионовую кислоты. В свою очередь в результате ß-окисления фенилпро-пионовой и парагидроксифенилпропионовой кислот в печени образуется бензойная кислота. Из бактероидов, характерных для микробиоты кишечника человека, фенилуксусную кислоту продуцируют Bacteroides fragilis, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides ovatus и Bacteroides distasonis [11]. Из представителей других родов можно упомянуть Peptostreptococcus anaerobius (семейство Clostridiaceae, тип Firmicutes), способный метаболизировать тирозин в фенилпропионовую и парагидрокси-фенилпропионовую кислоты. Способность к продукции фенилмолочной и парагидрокси-фенилмолочной кислот обнаружена у Klebsiella pneumonia и Escherichia coli (оба микроорганизма относятся к семейству Enterobacteriaceae, тип Proteobacteria) и Staphylococcus aureus (семейство Staphylococcaceae, тип Firmicutes).
В норме фенилкарбоновые кислоты присутствуют в крови человека. По данным Белоборо-довой Н.В. и соавт. [11], средние концентрации ФУК и ФПК в сыворотке крови здорового человека составили, соответственно, 226 и 147 нг/мл (с интерквартильным размахом в 0-512 и 0-220 соответственно). При генетически обусловленных нарушениях эндогенных путей метаболизма фенилаланина и тирозина, например, при фенилкетонурии и тирозинемии, уровень ФКК в сыворотке крови и в моче может существенно повышаться.
В доступной нам литературе мы не нашли сведений о содержании в крови фенилкарбоно-вых кислот при воспалительных заболеваниях кишечника (ВЗК), таких как язвенный колит (ЯК) и болезнь Крона (БК), а также при цели-акии. Практически единственное упоминание о возможной связи ФКК с фенотипами ВЗК имеется в исследовании Jansson J. et al. [12], показавшей, что содержание парагидроксифенил-пропионовой кислоты в фекалиях пациентов с болезнью Крона существенно выше (в 6-7 раз), чем у здоровых индивидуумов. Кроме того, в одном исследовании было показано, что при колоректальном раке, частота развития которого при ВЗК (особенно при язвенном колите) достоверно увеличена, уровень ФУК и ПГФУК в моче повышается [13].
Данные об уровне 5 идентифицированных фенилкарбоновых кислот в сыворотке крови больных целиакией, язвенным колитом и здоровых добровольцев представлены на рис. 1.
При анализе данных обращает на себя внимание значимое повышение уровня фенилук-сусной и парагидроксифенилуксусной кислот и снижение уровня фенилпропионовой кислоты в крови у больных язвенным колитом по сравнению, как со здоровыми лицами, так и с больными целиакией (0,19 усл. ед. vs. 0,10 усл. ед. и 0,13 усл. ед.; 0,41 усл. ед. vs. 0,19 усл. ед. и 0,29 усл. ед.; 0,18 усл. ед. vs. 0,33 усл. ед. и 0,29 усл. ед.; во всех случаях различия достоверны). У больных целиакией также имелась небольшая тенденция к повышению уровня фе-нилуксусной и парагидроксифенилуксусной кислот в крови по сравнению со здоровыми добровольцами, однако различия в концентрациях были недостоверными. Эти данные могут свидетельствовать о возможном повышении метаболической активности некоторых видов родов Clostridia и Bacteroides, метаболизирую-щих фенилаланин и тирозин в фенилуксусную и парагидроксифенилуксусную кислоты, а так-
же о вероятном снижении продукции фенил-пропионовой кислоты бактерией Clostridium sporogenes у больных язвенным колитом. Изменение метаболической активности бактериальной флоры кишечника, в свою очередь, может являться следствием серьезных нарушений микробиоценоза (дисбиоз толстой кишки, синдром избыточного бактериального роста
в тонкой кишке), сопровождающих как воспалительные заболевания кишечника, так и целиакию [14, 15]. Кроме того, с учетом данных ^ Цш et а1. [13], повышенный уровень ФУК и ПГФУК при язвенном колите может свидетельствовать и о более высоком риске развития колоректального рака у этой группы пациентов.
Рис. 1. Концентрации фенилкарбоновых в сыворотке крови больных язвенным колитом, целиакией и здоровых
добровольцев по данным ГХ-МС (в усл. ед.)
Полученные нами данные о более чем двукратном повышении уровня ПГФУК у больных язвенным колитом представляют несомненный интерес еще с одной точки зрения. Не так давно было показано, что добавление парагидрокси-фенилуксусной кислоты в культуру Clostridium difficile приводит к активной продукции пара-крезола (токсического фенольного соединения с выраженной бактериостатической активностью в отношении нормофлоры) в результате декар-боксилирования ПГФУК ферментом C. difficile. Этот феномен является уникальным свойством вида C. difficile (среди других представителей рода клостридий), фактически ответственным за развитие C. difficile-ассоциированных заболеваний в условиях гиперпродукции параги-дроксифенилуксусной кислоты [16]. Возможно, что данные о существенном повышении уровня ПГФУК у пациентов с ЯК помогут (хотя бы частично) объяснить повышенную частоту инфекции C. difficile при язвенном колите, подтвержденную многочисленными эпидемиологическими исследованиями, а также возможную патогенетическую связь между инфекцией C. difficile и ВЗК.
Следует отметить факт 1,5-2-кратного повышения концентрации бензойной кислоты и 2-метилбензойной кислот в сыворотке крови у больных обеих групп по сравнению со здоровыми лицами. Причина этого явления не вполне ясна, однако имеются данные о повышении уровня экскреции бензоата и других ФКК (ФУК и ПГФУК) с мочой при синдроме избыточного бактериального роста, сопровождающего различные заболевания желудочно-кишечного тракта, в том числе целиакию, синдром короткой кишки и др. [17, 18].
Индолкарбоновые кислоты. Предшественником индолкарбоновых кислот является триптофан - незаменимая аминокислота, играющая важную роль в биосинтезе белка и являющаяся также биохимическим прекурсором таких соединений, как серотонин и никотиновая кислота. В ряде исследований было показано, что индолкарбоновые кислоты могут принимать участие в регуляции экспрессии некоторых бактериальных генов [19].
В настоящем исследовании нами были идентифицированы 2 индолкарбоновые кислоты -индолуксусная кислота и индолпропионовая кислота (рис. 2).
2,50 2,00
ИУК ИПК
■ Язвенный колит
■ Целиакия
■Здоровыелица
Рис. 2. Концентрации индолкарбоновых кислот в сыворотке крови больных целиакией, язвенным колитом и здоровых добровольцев по данным газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (в усл. ед.)
Индолуксусная кислота (ИУК) является одним из основных метаболитов триптофана, наряду с 3-индолпропионовой кислотой, индо-лилакрилоилглицином (indolylacryloylglycine), 5-оксииндолилуксусной кислотой
(5-hydroxyindolylacetic [5-HIAA]) и 3-окси-антраниловой кислотой (3-hydroxyanthranilic acids), а также индолом и скатолом. Продуцентами индолуксусной кислоты являются некоторые виды клостридий, в частности, Clostridium botulinum тип G, Clostridium difficile, Clostridium lituseburense, Clostridium putrefaciens, Clostridium subterminale и др., метаболизирующие триптофан и другие ароматические аминокислоты [10, 20]. Из представителей других родов ее способны вырабатывать Bacteroides thetaiotaomicron, Citrobacter sp. (семейство Enterobacteriaceae, тип Proteobacteria) и Escherichia coli.
При экспериментальном колите у мышей уровень ИУК в сыворотке крови и колоректаль-ной ткани понижается, а ее содержание (наряду с содержанием янтарной и глютаминовой кислот, а также глютамина) тесно связано с активностью воспалительного процесса [21].
Индолпропионовая кислота (ИПК), так же как и индолуксусная кислота, является метаболитом триптофана. Физиологические функции ее до сих пор не выяснены, однако в ряде работ сообщается о ее возможности
предотвращать окислительный стресс, а также о потенциальном нейропротективном действии. Известна также способность ИПК подавлять рост Legionella pneumophila, микроорганизма, этиологически связанного с болезнью легионеров [22, 23].
Спектр микроорганизмов, способных продуцировать ИПК, по всей видимости, ограничен представителями рода Clostridia, в том числе Clostridium sporogenes и Clostridium cylindrosporum. Косвенным подтверждением бактериального происхождения 3-индолпро-пионовой кислоты могут служить данные о снижении уровня ИПК у животных после назначения антибиотиков [24]. Прямое подтверждение микробного происхождения ИПК было получено в экспериментальном исследовании на мышах (обычных и безмикробных линий), результаты которого показали, что продукция индолпропионовой кислоты полностью зависит от микрофлоры кишечника и, в частности, от колонизации Clostridium sporogenes. ИПК обнаруживалась только в сыворотке крови обычных мышей и полностью отсутствовала в крови безмикробных мышей. Из 24 видов микроорганизмов, принадлежащих к различным типам бактерий (Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, Proteobacteria) и архей (Methanobrevibacter smithii), только Clostridium sporogenes был способен продуцировать ИПА в культуре [25].
В доступной нам литературе мы не нашли данных о содержании 3-индолпропионовой кислоты в крови пациентов с язвенным колитом и целиакией.
Анализ полученных нами данных показал достоверное повышение концентраций индо-луксусной кислоты, как у больных язвенным колитом, так и у больных целиакией (1,86 усл. ед. и 1,33 усл. ед. соответственно vs. 0,51 усл. ед. у здоровых добровольцев; различия достоверны), что может быть обусловлено повышенной активностью клостридий, метаболизирующих ароматические аминокислоты, и согласуется с сопутствующим повышением уровня фенил-уксусной и парагидроксифенилуксусной кислот в обеих группах больных (см. выше).
Выявленное значимое повышение уровня ин-долпропионовой кислоты у больных целиакией по сравнению с больными язвенным колитом и здоровыми лицами (1,93 усл. ед. vs. 0,46 усл. ед. и 0,70 усл. ед. соответственно; различия достоверны) может быть обусловлено возможной разницей в количестве/метаболической активности Clostridium sporogenes у больных целиаки-
ей и язвенным колитом и полностью согласуется с описанным выше снижением концентрации ФПК у пациентов с язвенным колитом.
Дикарбоновые кислоты. Из дикарбоновых кислот мы идентифицировали в сыворотке крови янтарную и фумаровую кислоты. Янтарная и фумаровая кислоты, наряду с щавелевоуксус-ной, лимонной и другими кислотами, являются интермедиатами в цикле трикарбоновых кислот (цикле Кребса), который служит универсальным конечным путем окисления углеводов, липидов и белков и играет ключевую роль в процессах глюконеогенеза, липогенеза и катаболизма азота. Фумаровая кислота также является одним из побочных продуктов цикла мочевины (цикла Кребса - Хензелейта), реакции которого протекают в клетках печени и обеспечивают преобразование азотосодержащих продуктов распада в мочевину.
Янтарная кислота. Основными бактериальными продуцентами янтарной кислоты в организме человека являются Bacteroides spp. (B. fragilis, B. ovatus, B. thetaiotaomicron, B. cellulosilyticus, B. caccae, B. merdae, B. stercoris и др.), а также Eggerthella lenta (семейство Coriobacteriaceae, тип Actinobacteria), ранее известная как Eubacterium lentum, которая в ряде случаев может быть причиной клинически выраженной бактериемии, в том числе у пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника [11, 26]. Из других представителей микробиоценоза кишечника человека янтарную кислоту способны производить Paraprevotella clara и Paraprevotella xylaniphila (семейство Prevotellaceae, тип Bacteroidetes), ацетогенная бактерия Marvinbryantia forma-texigens (семейство Lachnospiraceae, тип Firmicutes), ранее известная, как Bryantella Formatexigens, Ruminococcus champanellensis (семейство Ruminococcaceae, тип Firmicutes). Некоторые микроорганизмы, например, Phascolarctobacterium succinatutens, недавно выделенная из фекалий здорового человека (семейство Acidaminococcaceae, тип Firmicutes), могут в свою очередь утилизировать янтарную кислоту, производимую другими кишечными бактериями, конвертируя ее в пропионовую кислоту путем декарбоксилирования [27].
Определение концентрации янтарной кислоты в крови и других биологических жидкостях может иметь клиническое значение. Так, уровень янтарной кислоты (как и уровень молочной кислоты) в крови повышается при гипоксических состояниях, что дает возможность
рассматривать этот показатель как один из возможных маркеров гипоксии. При болезни Крона концентрация янтарной кислоты в сыворотке крови повышается, при язвенном колите повышается ее количество в просвете толстой кишки. При экспериментальном колите у мышей уровень янтарной кислоты в сыворотке крови и колоректальной ткани (наряду с уровнем ин-долуксусной и глютаминовой кислот, а также глютамина) тесно связан с активностью воспалительного процесса. При колоректальном раке выявлено снижение концентрации янтарной кислоты в моче [13, 21].
Фумаровая кислота. Из бактерий кишечной микрофлоры фумаровую кислоту, так же как и янтарную, производят представители рода Bacteroides (Bacteroides fragilis, Bacteroides thetaiotaomicron) и вышеупомянутая Eggerthella lenta, однако в гораздо меньших (в десятки раз) количествах [11], поэтому, скорее всего, основным источником фумаро-вой кислоты в тканях и жидкостях организма являются не микроорганизмы, а эндогенные метаболические процессы (цикл Кребса и цикл Кребса - Хензелейта).
При воспалительных заболеваниях кишечника (как при язвенном колите, так и при болезни Крона) уровень фумаровой кислоты в сыворотке крови повышается, а содержание ее в ткани толстой кишки у пациентов с язвенным колитом и колоректальным раком может снижаться [28].
В настоящем исследовании было выявлено достоверное повышение уровня янтарной кислоты в сыворотке крови, как при язвенном колите, так и при целиакии, по сравнению со здоровыми добровольцами (в 2,8 и 1,5 раза соответственно; в обоих случаях различия достоверны) (рис. 3). Уровень фумаровой кислоты у больных обеих групп также повышался (в 2,1 и 2,6 раза соответственно; различия достоверны). Интересно, что соотношение концентраций янтарной и фумаровой кислот у больных язвенным колитом, целиакией и здоровых добровольцев значимо различалось (11,3, 4,9, и 8,4 соответственно), что может быть обусловлено различной направленностью метаболических процессов в каждой из групп. Поскольку в цикле трикарбоновых кислот фумаровая кислота образуется из янтарной, то повышенная утилизация янтарной кислоты, сопровождающаяся снижением ее концентрации, может приводить к повышению концентрации фумаровой кислоты, и наоборот.
Янтарная кислота Фумаровая кислота
■ Язвенный колит
■ Целиакия ■Здоровыелица
Рис. 3. Концентрации янтарной и фумаровой кислот
в сыворотке крови больных целиакией, язвенным колитом и здоровых добровольцев по данным ГХ-МС (в усл. ед.)
I До лечения Послелечения
Рис. 4. Динамика концентрации янтарной кислоты в сыворотке крови у больных и здоровых лиц на фоне приема масляной кислоты (бутирата) и инулина (в усл. ед.)
Особенности микробиоценоза толстой кишки при язвенном колите и целиакии. Как у пациентов с язвенным колитом, так и у больных целиакией, были выявлены специфические изменения микробиоценоза кишечника:
1) анаэробный дисбаланс (повышение доли бактероидов, связанных с хроническим воспалением, и снижение доли пробиотической бути-рат-продуцирующей бактерии Faecalibacterium prausnitzii);
2) снижение общего количества бутират-про-дуцирующих бактерий;
3) увеличение количества условно-патогенных микроорганизмов (Escherichia coli, Clostridium difficile, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis/vulgaris, Staphylococcus aureus).
Возможности коррекции метаболомического профиля и нарушений микробиоценоза кишечника. Дополнительное применение метабиотика (масляной кислоты в комбинации с инулином) в течение 4 недель на фоне базисной терапии приводило, наряду с улучшением клинической симптоматики и показателей микробиоценоза, к достоверной нормализации уровня янтарной кислоты как у больных язвенным колитом, так и у пациентов с целиакией (в обоих случаях различия достоверны). Уровень янтарной кислоты в сыворотке крови у здоровых лиц на фоне приема масляной кислоты и инулина не изменялся (рис. 4).
Побочных эффектов при применении масляной кислоты и инулина не наблюдалось.
Количественная оценка состояния микробиоценоза выявила достоверное устранение анаэробного дисбаланса, что отражалось в уменьшении соотношения Bacteroides fragilis/ Faecalibacterium prausnitzii до нормальных значений (< 80), повышение общего количества некультивируемых бутират-продуцирующих бактерий (примерно в 1,5 раза) и уменьшение количества условно-патогенных микроорганизмов (Escherichia coli, Clostridium difficile, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis/vulgaris, Staphylococcus aureus) в подгруппах пациентов с язвенным колитом и целиакией (2b и 3b), дополнительно получавших метабиотик (бути-рат + инулин). Стоит отметить, что повышение числа бутират-продуцирующих бактерий, играющих ключевую роль в энергетическом обеспечении кишечного эпителия, а также положительная динамика соотношения Bacteroides fragilis/Faecalibacterium prausnitzii на фоне приема масляной кислоты и инулина наблюдались и в группе практических здоровых лиц (рис. 5 и 6).
Обсуждая полученные данные, следует подчеркнуть, что продукция янтарной кислоты представителями микробиоты кишечника в настоящее время рассматривается как потенциальный фактор их вирулентности. Так, на-
пример, было показано, что Bacteroides fragilis могут вырабатывать янтарную кислоту в количествах, способных ингибировать так называемый респираторный (окислительный) взрыв в нейтрофильных лейкоцитах за счет снижения внутриклеточного pH [29]. В исследовании K.B. Abdul-Majid et al. (1997) янтарная кислота бактериального происхождения подавляла бактерицидную активность нейтрофилов [30]. Роль янтарной кислоты в повреждении слизистой оболочки при экспериментальном колите у крыс была показана S. Fukui et al. [31]. Введение янтарной кислоты при этом сопровождалось снижением кровотока в слизистой оболочке толстой кишки и инфильтрацией полиморфноядерных клеток, способных генерировать свободные радикалы кислорода (супероксидные радикалы), играющие значимую роль в развитии воспалительного процесса.
140 п-
Язвенный колит Целиакия Здоровыелица
■ До лечения
■ Послелечения
Рис. 5. Динамика соотношения Bacteroides fragilis/Faecalibacterium prausnitzii на фоне приема бутирата и инулина (во всех случаях различия достоверны
В японских экспериментальных исследованиях было показано, что в отличие от коротко-цепочечных жирных кислот (КЖК), стимулирующих пролиферацию эпителиальных клеток кишечника, янтарная кислота достоверно ин-гибирует пролиферацию колоноцитов и уменьшает размер крипт. С учетом имеющихся данных о накоплении янтарной кислоты в толстой кишке у больных язвенным колитом K. Tamura et al. (1995) предположили, что ингибирую-
В другом исследовании K. Ariake et al. (2000) подтвердили, что янтарная кислота, продуцируемая представителями рода Bacteroides (особенно B. caccae), может выступать в роли уль-церогенного фактора при экспериментальном колите у мышей [32]. Уровень янтарной кислоты в фекалиях мышей с колитом при этом был повышен. Y. Shiomi et al. (2011), в свою очередь, выявили достоверное снижение уровня янтарной кислоты в ткани толстой кишки у мышей с экспериментальным колитом, вызванным декстраном сульфата натрия (DSS-колит), что, по мнению авторов, может быть связано с повреждением слизистой оболочки кишечника янтарной кислотой. В сыворотке крови мышей с DSS-колитом уровень янтарной кислоты незначительно снижался (на 7-й день исследования), восстанавливаясь при этом к 10-му дню до нормальных значений [21].
10,6 10,5 10,4 10,3 10,2 10,1 10
Язвенный колит Целиакия
■ До лечения
■ Послелечения
Рис. 6. Динамика бутират-продуцирующих бактерий на фоне приема бутирата и инулина (количество бактерий приведено в lg КОЕ/г; в обоих случаях различия достоверны)
щий эффект янтарной кислоты в отношении пролиферации эпителия толстой кишки может быть непосредственно связан как с развитием язвенного колита, так и с ухудшением его течения [33].
И наконец, в одном из последних экспериментальных исследований было установлено, что янтарная кислота микробного происхождения (источником ее могут служить грамо-трицательные кишечные бактерии, например,
бактероиды, Escherichia coli, Salmonella) является не чем иным, как провоспалитель-ной сигнальной молекулой, индуцирующей интерлейкин-ip через протеин HIF-1a [34].
Выводы
1. Метаболомический профиль сыворотки крови и других биологических образцов (возможно, ограниченный рядом соединений, таких как КЖК, фенилкарбоновые, индолкарбоновые, дикарбоновые, оксикарбоновые кислоты, некоторые аминокислоты и др.), а также отдельные высокоинформативные метаболиты (например янтарная кислота) могут рассматриваться, по нашему мнению, как потенциальные биомаркеры активности, тяжести течения и прогноза при хронических заболеваниях кишечника, ассоциированных с нарушениями микробиоценоза (например язвенного колита или целиакии), а исследование их уровня в динамике, в свою очередь, может служить косвенным методом оценки эффективности препаратов, механизм действия которых связан с влиянием на микро-биоту кишечника и метаболические процессы (пробиотики, пребиотики, метабиотики, кишечные антисептики и антибиотики).
2. Применение метабиотика (масляной кислоты в комбинации с инулином) на фоне базисной терапии месалазином у больных язвенным колитом и на фоне безглютеновой диеты у пациентов с целиакией улучшает клиническую симптоматику, метаболомический профиль сыворотки крови, и показатели микробиоценоза, достоверно устраняя анаэробный дисбаланс, повышая долю бутират-продуцирующих бактерий, играющих значимую роль в снабжении колоноцитов энергией, и нормализуя патологически повышенный уровень янтарной кислоты, связанной с воспалением.
Литература
1. Белобородова, Н.В. Интеграция метаболизма человека и его микробиома при критических состояниях / Н.В. Белобородова // Общая реаниматология. - 2012. - Т. VIII, №№ 4. -С. 42-54.
2. Tremaroli, V. Functional interactions between the gut microbiota and host metabolism / V. Tremaroli, F. Backhed // Nature. - 2012. -Vol. 489, No. 7415. - P. 242-249.
3. Osipov, G.A. Study of human microecology by mass spectrometry of microbial markers / G.A. Osipov, N.V. Verkhovtseva // Benef. Microbes. - 2011. - Vol. 2, No. 1. - P. 63-78.
4. DuPont, A.W. The intestinal microbiota and chronic disorders of the gut / A.W. DuPont, H.L. DuPont // Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. -
2011. - Vol. 8, No. 9. - P. 523-531.
5. Schicho, R. Quantitative metabolomic profiling of serum, plasma, and urine by 1H NMR spectroscopy discriminates between patients with inflammatory bowel disease and healthy individuals / R. Schicho [et al.] // J. Proteome Res. -
2012. - Vol. 11, No. 6. - P. 3344-3357.
6. Hisamatsu, T. Novel, objective, multivariate biomarkers composed of plasma amino acid profiles for the diagnosis and assessment of inflammatory bowel disease / T. Hisamatsu [et al.] // PLoS One. -2012. - Vol. 7, No. 1. - e31131.
7. Sutherland, L.R. 5-Aminosalicylic acid enema in the treatment of distal ulcerative colitis, proctosigmoiditis, and proctitis / L.R. Sutherland [et al.] // Gastroenterology. - 1987. - Jun; 92(6). Р. 1894-1898.
8. Орешко, Л.С. Целиакия взрослых: особенности патогенеза, клинических проявлений, диагностики, лечения и профилактики осложнений : автореф. дисс. ... д-ра мед. наук / Л.С. Орешко. - СПб., 2008. - 44 с.
9. Louis, P. Diversity, metabolism and microbial ecology of butyrate-producing bacteria from the human large intestine / P. Louis, H.J. Flint // FEMS Microbiol Lett. - 2009. - 294(1). Р. 1-8.
10. Elsden, S.R. Amino acid utilization patterns in clostridial taxonomy / S.R. Elsden, M.G. Hilton // Arch Microbiol. - 1979. - Nov;123(2). - Р. 137141.
11. Белобородова, Н.В. Экзометаболиты некоторых анаэробных микроорганизмов микрофлоры человека / Н.В. Белобородова [и др.]// Биомедицинская химия. - 2011. - Т. 57, вып. 1. -С. 95-105.
12. Jansson, J. Metabolomics reveals metabolic biomarkers of Crohn's disease / J. Jansson [et al.] // PLoS One. - 2009. - Jul 28;4(7). - Р. e6386.
13. Qiu, Y. Urinary metabonomic study on colorectal cancer / Y. Qiu [et al.] // J. Proteome Res. - 2010. - Vol. 9, No. 3. - P. 1627-1634.
14. De Cruz, P. Characterization of the gastrointestinal microbiota in health and inflammatory bowel disease / P. De Cruz [et al.] // Inflamm Bowel Dis. - 2012. - Feb; 18(2). - Р. 372-390.
15. DePalma, G. Intestinal dysbiosis and reduced immunoglobulin-coated bacteria associated with coeliac disease in children / G. De Palma [et al.] // BMC Microbiol. - 2010. - Feb 24;10. - Р. 63.
16. Selmer, T. p-Hydroxyphenylacetate decarboxylase from Clostridium difficile. A novel
glycyl radical enzyme catalysing the formation of p-cresol / T. Selmer, P.I. Andrei // Eur J Biochem. -2001. - Mar; 268(5). - P. 1363-1372.
17. Lord, R.S. Clinical applications of urinary organic acids. Part I: Detoxification markers / R.S. Lord, J.A. Bralley // Altern Med Rev. - 2008. -Sep; 13(3). - P. 205-215.
18. Lord, R.S. Clinical applications of urinary organic acids. Part 2. Dysbiosis markers / R.S. Lord, J.A. Bralley // Altern Med Rev. - 2008. -Dec;13(4). - P. 292-306.
19. Kline, E.L. Metabolite gene regulation of the L-arabinose operon in Escherichia coli with indoleacetic acid and other indole derivatives. / E.L. Kline [et al.] // Proc Natl Acad Sci USA. -1980. - Apr; 77(4). - P. 1768-1772.
20. Yokoyama, M.T. Microbial metabolites of tryptophan in the intestinal tract with special reference to skatole / M.T. Yokoyama, J.R. Carlson // Am J Clin Nutr. - 1979. - Jan; 32(1). -P. 173-178.
21. Shiomi, Y. GCMS-based metabolomic study in mice with colitis induced by dextran sulfate sodium / Y. Shiomi [et al.] // Inflamm Bowel Dis. -2011. - Nov; 17(11). - P. 2261-2274.
22. Hwang, I.K. Indole-3-propionic acid attenuates neuronal damage and oxidative stress in the ischemic hippocampus / I.K. Hwang [et al.] // J Neurosci Res. - 2009. - Jul; 87(9). -P. 2126-2137.
23. Mandelbaum-Shavit, F. Susceptibility of Legionella pneumophila grown extracellularly and in human monocytes to indole-3-propionic acid / F. Mandelbaum-Shavit [et al.] // Antimicrob Agents Chemother. - 1991. - Dec; 35(12). -P. 2526-2530.
24. Young, S.N. The origin of indoleacetic acid and indolepropionic acid in rat and human cerebrospinal fluid / S.N. Young [et al.] // J Neurochem. - 1980. - May; 34(5). - P. 1087-1092.
25. Wikoff, W.R. Metabolomics analysis reveals large effects of gut microflora on mammalian blood metabolites / W.R. Wikoff [et al.] // Proc
Natl Acad Sci USA. - 2009. - Mar 10;106(10). -P. 3698-3703.
26. Venugopal, A.A. Risk and prognostic factors among patients with bacteremia due to Eggerthella lenta / A.A. Venugopal, S. Szpunar, L.B. Johnson // Anaerobe. - 2012. - Aug; 18(4). - P. 475-478.
27. Watanabe, Y. Characterization of Phascolarctobacterium succinatutens sp. nov., an asaccharolytic, succinate-utilizing bacterium isolated from human feces / Y. Watanabe, F. Nagai, M. Morotomi // Appl Environ Microbiol. - 2012. -Jan; 78(2). - P. 511-518.
28. Ooi, M. GC/MS-based profiling of amino acids and TCA cycle-related molecules in ulcerative colitis / M. Ooi [et al.] // Inflamm Res. - 2011. -Sep;60(9). - P. 831-840.
29. Rotstein, O.D. The Bacteroides by-product succinic acid inhibits neutrophil respiratory burst by reducing intracellular pH / O.D. Rotstein, P.E. Nasmith, S. Grinstein // Infect Immun. -1987. - Apr; 55(4). - P. 864-870.
30. Abdul-Majid, K.B. The effect of the bacterial product, succinic acid, on neutrophil bactericidal activity / K.B. Abdul-Majid, P.A. Kenny, J.J. Finlay-Jones // FEMS Immunol Med Microbiol. - 1997.- Feb; 17(2). - P. 79-86.
31. Fukui S., Shimoyama T., Tamura K., Yamamura M., Satomi M. Mucosal blood flow and generation of superoxide in rat experimental colitis induced by succinic acid // J. Gastroenterol. -1997. - Vol. 32, No. 4. - P. 464-471.
32. Ariake, K. Roles of mucosal bacteria and succinic acid in colitis caused by dextran sulfate sodium in mice / K. Ariake [et al.] // J. Med. Dent. Sci. - 2000. - Vol. 47, No. 4. - P. 233-241.
33. Tamura, K. Effect of butyrate on colonic mucosa / K. Tamura, M. Yamamura, M. Satomi // Jpn. J. Parent. Enter. Nutr. - 1995. - Vol. 17. -P. 481-484.
34. Tannahill, G.M. Succinate is an inflammatory signal that induces IL-1ß through HIF-1a / G.M. Tannahill [et al.] // Nature. - 2013. - Apr 11; 496(7444). - P. 238-242.
С.И. Ситкин Тел.: 543-95-38 e-mail: sitkins@mail.ru
