CC BY
316
Л.А. Лутова,
Г.М. Шумилина
Кафедра генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университета
В обзоре рассмотрена роль различных фитометаболитов в обеспечении устойчивости растений. Особое внимание уделено двум стратегиям получения устойчивых к патогенам растений: благодаря уменьшению питательной ценности растений для патогена и за счет синтеза различных антимикробных соединений. Возможность применения первого подхода описана на примере зависимости некоторых патогенов от стеринов растений. Обобщены полученные на сегодняшний день данные о метаболизме, функциях стеринов и мутантах по биосинтезу этих соединений. В использовании второй стратегии основную роль играют определенные классы вторичных метаболитов.
На конкретных примерах показана роль отдельных фитоалексинов и стероидных гликоалкалоидов в повышении устойчивости растений к патогенам.
Ключевые слова: вторичные метаболиты, фитостерины, мутанты, устойчивость к вредителям.
МЕТАБОЛИТЫ РАСТЕНИЙ И ИХ РОЛЬ В УСТОЙЧИВОСТИ К ФИТОПАТОГЕНАМ
ВВЕДЕНИЕ
Проблема устойчивости растений к болезням в последнее десятилетие стала одним из главных направлений в области генетики и физиологии растений. Основное внимание при этом уделяется олигогенной устойчивости, которая обеспечивает устойчивость растений к определенным генотипам патогена и контролируется работой всего лишь нескольких R-генов. В то же время другой тип устойчивости — полигенная или полевая устойчивость обладает рядом преимуществ. В частности, именно этот тип устойчивости обеспечивает невосприимчивость растений к широкому спектру патогенов, независимо от расовой принадлежности последних, ограничивает численность популяции патогена и расообразовательные процессы, протекающие в них. К сожалению, факторы, лежащие в основе полигенной устойчивости, мало изучены. В связи с этим особый интерес представляет выявление растительных метаболитов, отсутствие или недостаток которых в растении тормозит развитие патогена и предупреждает его размножение. Подобный эффект характерен для ряда вторичных метаболитов растений и стеринов. Впервые эти факты были сведены в рабочую гипотезу, предложенную сотрудниками кафедры генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университета и проверенную на практике [5, 6, 11-13].
В обзоре рассмотрена роль стеринов и других биогенных соединений, которые вовлечены в природные взаимодействия растение-патоген и в той или иной степени определяют устойчивость к патогенам. Центральное место в обзоре уделено стеринам растений. Описаны стериновые мутанты и способы их получения.
РОЛЬ СТЕРИНОВ В УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ К ВРЕДИТЕЛЯМ СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
Многие организмы — насекомые,, нематоды и некоторые грибы — утратили в процессе эволюции способность синтезировать стерины de novo из нециклических соединений, поэтому они получают их в готовом виде из растений. В большей степени зависимость насекомых от фитостеринов обусловлена необходимостью использовать последние в качестве предшественников для синтеза гормона линьки насекомых — экдизона и экдисте-роидов, которые необходимы для превращении личинки в имаго [10]. При этом размножение и развитие различных видов насекомых жестко зависит от определенного качественного и количественного содержания фитостеринов в растениях-продуцентах [51]. Исключение из пищевого рациона или замена одних стеринов на другие сильно влияет на жизнеспособность насекомых и их личинок, как это было продемонстрировано на Locusta migratoria [24] и Drosophila melanogaster [7].
На основе зависимости насекомых от определенных стероидов растений (фитостеринов) могут возникать интересные межвидовые ассоциации.
Так, показана специфичность ассоциаций между четырьмя видами дрозофил и четырьмя видами кактусов в североамериканской пустыне Сонора [41]:
Lophocerus schotti — Drosophila pachea;
Carnegiea gigantea — D. nigrospiracula;
Lemairocerus thurberi — D. mojavensis;
Rathbunia alamosensis — D. arizonensis.
У каждого из этих видов кактусов есть «своя» дрозофила, живущая за счет мертвых тканей кактуса и служащая как бы санитаром для данного вида растений. Со своей стороны дрозофилы тоже проявляют высокую избирательность. Один из этих видов (D. arizonensis) живет только на одном виде растения-хозяина. Остальные три вида живут либо только на указанном виде кактуса, либо еще на 1-2 видах растений.
Биохимия специфичности этой ассоциации такова. Во-первых, кактусы всех четырех видов привлекают дрозофил наличием стероидных аттрактантов, необходимых для синтеза гормонов линьки. Во-вторых, кактусы каждого из этих видов вырабатывают свой алкалоид-репеллент, отпугивающий все виды дрозофил, кроме одного — «своего».
Интересно, что зависимость дрозофил от этих кактусов, по-видимому, совершенно облигатна, так как их фи-тостерины содержат ненасыщенную связь в положении Д7 в отличие от ряда других фитостеринов с двойной связью в положении А5. Гормон линьки а-экдизон должен содержать двойную связь в положении Д7, а дрозофилы сами не способны провести реакцию реорганизации двойной связи А5—> А7 (рис. 1).
Таким образом, экологическое значение фитостеринов и близких им по структуре фитоэстрогенов двояко. С одной стороны, они могут оказывать воздействие на популяции фитофагов, ограничивая их численность. С другой, — стерины могут служить важнейшим химическим ресурсом для метаболизма клеток некоторых фитофагов.
Экзогенные стерины имеют также большое химикоэкологическое значение в жизнедеятельности некоторых грибов. Например, представители рода Phytofthora могут синтезировать только сквален, но не могут конвертировать его в 2,3-эпоксид [4]. Поэтому при отсутствии в пище стеринов гриб может слабо расти только вегетативно. Добавление стеринов в культуральную среду стимулирует вегетативный рост и половое размножение. Изменяя состав и соотношение стеринов в растении можно получить устойчивые к этому грибу растения.
Исследования, проведенные на различных объектах, показали, что отбор мутантов по биоснтезу стеринов можно проводить по их устойчивости к полиеновым антибиотикам или ингибиторам биосинтеза стеринов [6,11]. Как правило, устойчивость к такого рода соединениям обусловлена изменениями в работе единичных генов, кодирующих отдельные этапы биосинтеза стеринов [6, 15].
На основе этого феномена на кафедре генетики и селекции СПбГУ была создана модельная система «табак-Drosophila», позволяющая получать и выявлять расте-
Puc. I. Пути синтеза гормона линьки дрозофил из шоттенола кактусов или из ситостерола (Jacobson, 1982): а — ситостерол; б — гормон линьки а-экдизон; в — шоттенол.
Реакции: 1 — миграция двойной связи А5 —> Д7; 2 — дс-алкилирование в положении С24; 3 — окисление
ния с измененным составом стеринов [6]. Авторами были получены нистатинустойчивые клеточные линии и растения-регенеранты табака. В качестве мутагена использовали УФ излучение (продолжительностью 4 минуты). На гомогенатах, приготовленных из некоторых нистатин-устойчивых клеточных линий и растений табака, у самок снижалась плодовитость и задерживалось развитие личинок. На гомогенатах, приготовленных из контрольных растений, личинки D. melanogaster успешно использовали растительные стерины и завершали свое развитие от личинки до взрослой особи. У мутантных растений было обнаружено увеличение тотального содержания стеринов и накопление двух групп Д7-сте-ринов и интермедиатов Д5-стеринов. При этом единственным фенотипическим отличием мутантных растений от контрольных была неспособность к цветению. Итак, предложенный растительный субстрат, являясь
единственным источником пищи, полностью удовлетворял потребность насекомых в стеринах, а изменение содержания последних оказывало негативное воздействие на размножение и развитие Drosophila melanogaster [5].
На основе опосредованной клеточной селекции были также получены растения картофеля, устойчивые к полиеновому антибиотику (ПА) филлипину и ингибитору биосинтеза стеринов байтану. Среди мутантных растений в биотесте с фитофторой выявлены устойчивые растения. При этом у устойчивых к фитофторозу растений линии Rf-18 было показано изменение соотношения основных стеринов (увеличение содержания ситостерина). Мутантные растения фенотипически не отличались от исходных форм. При анализе инбредно-го потомства линии Rf-18 треть проростков оказались устойчивыми к патогену, тогда как в контроле устойчивых не выявлено [12].
Кроме того, были получены мутанты растений культурного томата, устойчивые к полиеновому антибиотику нистатину [77]. При анализе их в тестах с Phytofthora infestans были выявлены формы, устойчивые к фитофторозу. Высокий уровень устойчивости сохранялся как при вегетативном размножении мутантов томата, так и при размножении семенами.
Таким образом, было показано, что изменение содержания стеринов растений (табака, картофеля, томатов) подавляет развитие стеринзависимых патогенов. Следовательно, изменение содержания стеринов у растений снижает пищевую ценность последних для вредителей.
Отбирая растения на устойчивость к нарушающим стериновый метаболизм веществам, можно одновременно выделить формы, потенциально устойчивые к фито-стеринзависимым патогенам и вредителям. Так как эта устойчивость основана на эволгоционно сложившейся и непреодолимой зависимости патогена от метаболизма хозяина, то этот тип устойчивости имеет наибольшую ценность для сельскохозяйственных растений.
Разработанная стратегия, связанная с получением растений, устойчивых к фитостеринзависимым патогенам и основанная на изменении профиля стеринов растения, уже сейчас позволяет обеспечить достаточно высокую степень устойчивости к вредителям. Однако следует отметить, что при таком способе селекции не всегда однозначно можно связать выявленную устойчивость растений к вредителям с измененным профилем стеринов у мутанта. Биосинтез и метаболизм стеринов у растений — сложный процесс, который определяется многими факторами: генотипом растения, температурой, освещенностью, изменениями условий окружающей среды и др. Поэтому получение и характеристика соответствующих мутаций у растений расширяет современные представления об экологических цепях и молекулярно-генетических аспектах взаимодействия высших растений и патогенов. Далее мы подробно рассмотрим пути биосинтеза стери-
нов и охарактеризуем мутанты по метаболизму стеринов у растений. Это особенно важно, так как подобные мутации уже хорошо изучены у низших эукариот и практически не исследованы у высших растений.
СТЕРИНЫ РАСТЕНИЙ: БИОСИНТЕЗ, ФУНКЦИИ, МУТАЦИИ Биосинтез стеринов
Стерины — важный компонент клеток всех эукариотических организмов. Они относятся к изопреноид-ному семейству соединений, построенных из изопре-новых строительных блоков -СН2 - С(СН3) = СН - СН2. Фитостерины являются производными тетрацикличес-кого углеводорода пергидро-1,2-циклопентенофенант-рена. В молекуле стеринов к тетрациклическому ядру присоединена алифатическая боковая цепь из 8-10 атомов углерода. Тетрациклическая структура стеринов представляет собой четыре конденсированных ядра — кольца А, В, С, D. В кольце А всех стеринов у С3 атома присоединена вторичная гидроксильная группа[9]. Характерными отличиями растительных стеринов от животных является присутствие алкильного заместителя у С^4 атома боковой цепи, поэтому молекулы стеринов чаще содержат 28 или 29 атомов углерода. Алкильный заместитель — это метильная, метиленовая, этильная группа с а- или ß-хиральностью С24 атома. Фитостерины могут отличаться друг от друга и по числу двойных связей в молекуле, причем чаще двойные связи располагаются в Д5(6), А7, А8, А22, Д24<28>, д25<26> [9]. Самыми распространенными стеринами в растениях являются ситостерин, стигмастерин и кампесте-рин, также в некоторых случаях и в больших количествах обнаружен холестерин. Надо отметить, что для всех клеток животных, грибов и растений биосинтез стеринов на этапах от АсСоА до сквалена одинаков по образующимся промежуточным соединениям и осуществляется через мевалонатный путь метаболизма изоп-реноидов. Однако имеются существенные различия в ферментативных комплексах, обслуживающих данные шаги биосинтеза у организмов различных царств. Так, фермент З-гидрокси-З-метилглютарил кофермент А (ГМГ-КоА) редуктаза катализирует биосинтез мевало-новой кислоты (МВК) и является первым этапом, на котором регулируется биосинтез изопентеноидов [16]. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей клонированных генов ГМГ-КоА редуктазы млекопитающих Saccharomyces cerevisiae и Arabidopsis thaliana показал, что консервативные концевые районы, соответствующие каталитическому центру белка, имеют высокую степень гомологии [21]. Биосинтез стеринов в растении (рис. 2, 3) начинается с конденсации АсСоА, который клетка добывает гремя путями:
4а-метил-5 эргостав, 14, 24(28)-триен-3\\-ол
4а-метилфекостерин
dwf7lste А7 Стерин С-5 десатураза
dwf5 А7 Стерин С-5 редуктаза
5-дегидроавенастерин
Изофукостерин
Эпистерин
dwf7/ste1 —| П А7 Стерин С-5 ”
десатураза
5-дегидроэпистерин
dwf5 | П А Стерин v
редуктаза
24-метиленхолестерин
Стерины
клеточных
мембран
Брассиностерины
Рис. 3. Некоторые этапы биосинтеза стертое (Clouse S.D. Arabidopsis Mutants Reveal Multiple Roles for Sterols in Plant Development II The Plant Cell. — 2002. — 14. — P. 1995-2000)
1. Расщепление пирувата в ходе гликолиза (с выделением С02). 2. (3-окисление жирных кислот 3. Активация свободной СН3СООН, катализируемая ферментом АсСоА-синтетазой. В результате двухэтапной конденсации трех молекул АсСоА образуется З-окси-З-метил-глутарилСоА. При участии двух молекул ЫАОРН он восстанавливается в мевалоновую кислоту (МВК). МВК — это первый специфический предшественник всех без исключения терпеноидов; реакция ее образования лимитирует скорость стероидного биосинтеза. Затем МВК в ходе трехступенчатой реакции в присутствии М§2+ и АТР превращается в изопентилдифосфат (ИПРР). Последний изомеризуется, в ходе чего происходит перемещение двойной связи из положения А3 в положение А2 и образует Д2-изопентилдифосфат. Благодаря конденсации молекулы ИПРР и молекулы Д2-изопентилдифосфата, образуется геранилдифосфат, наращивание углеродной цепи которого дает фарнезилдифосфат. Дальнейшая полимеризация по этому же типу приводит к образованию геранилгеранилдифосфата (предшественник кароти-ноидов, хлорофиллов, гибберелловой кислоты), а взаимодействие двух молекул фарнезилдифосфата (МАБРН-
АсСоА
Флааоноиды ГМГ-СоА Жирные кислоты
I
МВК
I
ФосфоМВК 1
Изопентилдифосфаг \
Гэранилдифосфат
I
фарнезилдифосфат
Каратиноиды
Рис. 2. Основные этапы биосинтеза стеринов у фотосинтезирующих и нефотосинтезирующих организмов (Benveniste, 1986; Bach & Lichtenthaler, 1983)
зависимое) приводит к образованию сквалена [9]. Дальнейшее превращение сквалена (его циклизация) является первым этапом расхождения путей биосинтеза стеринов у фотосинтезирующих и нефотосинтезирующих организмов [17]. Основными отличиями биосинтеза стеринов у растений от биосинтеза стеринов у грибов и животных являются следующие:
1. Первым циклическим соединением, образующимся у фотосинтезирующих эукариот, является циклоарте-нол, а у нефотосинтезирующих — ланостерин. 2. Фермент, раскрывающий циклопропановое кольцо (цикло-эукаленол-обтузифолиол изомераза) обнаружен только у высших растений. 3. Разная последовательность реакций деметилирования в положениях С4и С14. 4. Противоположная стереохимическая ориентация боковых цепей у С24, наличие которых строго специфично для растений и грибов [18].
Кроме этих отличий, необходимо упомянуть, что ферменты, осуществляющие однотипные реакции, могут обладать разными свойствами в отношении субстратной специфичности или восприимчивости к действию ингибитора [73].
Итак, первой специфической реакцией биосинтеза фитостеринов является циклизация 2(3) оксидосквалена с образованием циклоартенола. Затем образуются различные виды фитостеринов. Необходимо отметить, что у высших растений в нормальных физиологических и биохимических условиях биосинтез стеринов происходит по пути, определяемому видом растения. Действие ингибиторов биосинтеза стеринов приводит к накоплению промежуточных соединений и вызывает переключение биосинтеза с основного пути на вторичные [65].
ФУНКЦИИ СТЕРИНОВ
Наличие в клетке разнообразных путей биосинтеза стеринов наводит на мысль о важности и необходимости функций, выполняемых этими соединениями. Выделяют три основные функции стеринов: структурную, регуляторную, метаболическую.
Структурная функция связана с присутствием стеринов во всех клеточных мембранах: плазматической, митохондриальной, аппарата Гольджи, эндоплазматическо-го ретикулума, ядерной. Для нормального взаимодействия с фосфолипидными мембранами стерины должны иметь свободную 3-ОН группу, плоскую неповрежденную систему колец и СН3-группу при С17[18]. При этом гидроксильная группа ориентирована в гидрофильном направлении, кольцевые структуры и боковая цепь погружены в гидрофобные жирные кислоты фосфолипидов. Регуляторная функция связана со способностью стеринов определенного строения регулировать структурную организацию мембран. Для выполнения регуляторной функции требуется минимальное количество сте-
ринов, тогда как структурная организация базируется на больших количествах этих соединений [43]. Регуляторные стерины — это 24-Р-метилстерины, воздействующие на мембранные функции без предварительного транспорта внутрь или из клетки [43, 66].
Метаболическая функция состоит в том, что стерины могут быть предшественниками веществ, выполняющих разные физиологические функции. Например, эк-дистероиды насекомых [27], антеридиолы некоторых грибов [58] и брассинолиды растений [57].
Показано, что из наиболее известных растительных стеринов, структурные функции — у холестерина и, частично, ситостерина, а стигмастерин — типичный регуляторный элемент мембраны [71]. Предположительно стерины участвуют в процессе адаптации растений к стрессовым условиям. Имеются данные, что растения, выращенные в условиях пониженной температуры, короткого дня или высокой засоленности почв, характеризуются измененным соотношением стеринов и фосфолипидов в мембранах. Кроме того, изменения в стериновом составе приводят к нарушениям активного и пассивного транспорта через мембраны [54], снижают активность мембранных ферментов [76]. Стериновое голодание приводит к преждевременному старению клеток [1].
В цитоплазме молекулы стеринов образуют конъюгаты с ацилированными сахарами или сложные эфиры с жирными кислотами [42]. Возможно, текучесть мембран регулируется благодаря обратимости этерификации стеринов [46]. Избыточное количество стеринов и их интермедиатов (после образования сложных эфиров) вместе с запасными липидами (триацилглицеролами) образуют в цитоплазме масляные капли— «липидные тельца» [26]. Способность стеринов к образованию конъюгатов и эфиров предотвращает токсичность некоторых соединений и интермедиатов биосинтеза стероидов [1, 56].
Части одного и того же растения характеризуются различным количественным содержанием фитостери-нов [29], к тому же наблюдается доминирование различных стеринов на разных этапах развития растения [22, 28]. При прорастании семян содержание стеринов в растении резко падает, что связано с необходимостью быстрого синтеза большого количества мембран [28, 29]. Когда растение вступает в фазу цветения, содержание стеринов падает или выходит на плато. Последний вариант характерен, в частности, для сои. При этом было показано, что сухой вес растения увеличивался в 5 раз, что приводило к снижению удельного содержания стеринов в единице сухого материала. На последующих стадиях развития растения содержание стеринов остается неизменным вплоть до начала старения, когда можно наблюдать уменьшение уровня синтеза стеринов [28,29]. Уменьшение уровня синтеза стеринов при старении растения сопряжено с уменьшением уровня активности ГМГ-СоА редуктазы [61], что,
вероятно, связано со снижением синтеза мевалоновой кислоты. Итак, содержание стеринов в пределах одного растения колеблется от высокого в меристематиче-ских, активно растущих вегетативных и репродуктивных тканях до относительно низкого в зрелых вегетативных тканях [29].
Показано, что виды растений различаются по качественному содержанию стеринов, что позволяет использовать этот показатель в хемосистематике растений [69]. Методами газово-жидкостной хроматографии и масс-спектрального анализа показано, что растения семейства 8о1апасеае, Вгаххкасеае, Реасеае синтезируют в основном Д5-стерины, однако для некоторых видов наблюдали присутствие Д7-стеринов как промежуточных веществ биосинтеза [46]. Для Ая1егасеае и РаЬасеае набор стеринов схож с этими гремя семействами, но по крайней мере для одного из видов каждого семейства показан биосинтез исключительно Д7-стеринов [72, 49]. Растения семейств Ткеасеае, СисигЫ1асеае, СкепоросИасеае, напротив, продуцируют в основном Д7-стерины и лишь небольшое количество— Д5-стеринов [36, 15, 49]. Выявлено разнообразие стеринов листьев при анализе их состава у 13 видов из семейства С1гепоросИасеае [69].
Таким образом, стерины растений выполняют важные функции в клетке — структурные, являясь компонентом клеточных мембран и биогенетические, являясь предшественниками в синтезе стероидных гормонов и алкалоидов. Качественное и количественное соотношение стеринов зависит от вида растения, ткани и фазы развития.
РАСПРЕДЕЛЕНИЕ СТЕРИНОВ В КЛЕТКЕ
Большая часть растительных стеринов в клетке — это несвязанные стерины ((3-ОН у атома С,), входящие в состав мембраны. Минорная фракция стеринов (а именно кампестерин и его эпимер 22(23) дегидробрассикостерин) формируют пул предшественников брассиностеринов. Небольшое количество стеринов в клетке находится в виде эфиров жирных кислот, стерин-гликозидов или сте-рин-ацилгликозидов.
При значительном повышении уровня стеринов в клетке, который наблюдается у мутантных растений табака стерины находятся в виде эфиров жирных
кислот, формируя в цитоплазме липидные капли. Эти формирования, называемые также стериносомы, могут быть вовлечены в регуляцию содержания свободных стеринов в мембране [55]. Однако показано, что сверхпродукция фермента ГМГ-КоА редуктазы у трансгенных растений табака, приводящая к значительному повышению уровня стеринов в клетке, не отражается на морфологии и особенностях развития этих растений по сравнению с диким типом [19]. Вероятно, стериносомы используются в клетке исключительно как депо для
накопления стеринов и не выполняют какой-либо другой функции.
Так, етериносомы были обнаружены в клетках тапе-тума у растений Brassica napus. Предполагается, что они участвуют в обеспечении функциональных особенностей пыльцы. Например, являются одним из адгезивных компонентов пыльцевой оболочки при опылении насекомыми [60].
В связанном состоянии стерины (в основном это характерно для Л5-стеринов) могут находиться в клетке в виде стерингликозидов или ацилстерингликозидов. Такие конъюгаты находятся в плазматической мембране [42]. Итак, стерины присутствуют во всех типах растительных клеток как в свободной, так и в связанной формах.
МУТАНТЫ БИОСИНТЕЗА СТЕРИНОВ
Изучению этапов биосинтеза, специфических функций стеринов и глубоких структурно-функциональных взаимоотношений, опосредованных этими соединениями, препятствует ассоциация последних с эндоплазма-тическим ретикуломом. Это затрудняет их очистку и применение антител при скрининге экспрессирующихся библиотек для клонирования кДНК [33,34]. Поэтому селекция мутантов представляет собой важную стратегию для выделения новых генов, контролирующих метаболизм стеринов [33].
Мутанты по раннему этапу биосинтеза стеринов
Методом клеточной селекции при культивировании микрокаллусов на среде, содержащей триазол LAB170250F [55], было получено 40 мутантных растений табака (Nicotiana tabaccum). Два из них, названные sterov, имели измененный профиль стеринов по сравнению с контролем. От одного из двух генотипов было получено фертильное растение LAB 1-4, которое характеризовалось увеличением общего количества стеринов в каллусе и листьях, а также были отмечены качественные изменения — накопление некоторых промежуточных соединений биосинтеза стеринов, присутствующих в контроле в следовых количествах (24-метилхолестерол, А7-авенастерол, 24-этилиденфенол и 24-метилциклоарте-нол) [55]. Авторы предлагают два объяснения накопления промежуточных продуктов: 1) дефект связан с двумя реакциями деметилирования и с метилированием С-24-циклоартенола; 2) увеличение потока биосинтеза вызывает рост общего количества стеринов, снимающий ограничение с субстратлимитированных реакций (например, C-4-деметилирования и C-24-метилтрансферазная реакция). Показано сохранение высокого уровня содержания стеринов в течение двух половых поколений. По мнению авторов, количественное содержание стеринов зависело
от статуса клеток: в листьях общее количество стеринов было увеличено в 3 раза по сравнению с диким типом, а в каллусах— в 10 раз. При этом по количественному составу свободных стеринов LAB 1-4 не отличался от контроля, все избыточные стерины у мутанта накапливались в виде эфиров [38]. Генетический анализ показал, что мутация наследуется как ядерная полудоминантная и приводит к изменению или нарушению координации биосинтеза стеринов [56]. У мутанта в каллусе и листьях показано увеличение в три раза активности гидроксиметил-глу-тарил КоА-редуктазы (ГМГР), катализирующей синтез мевалоновой кислоты — первого предшественника в изопреноидном биосинтезе[39].
Мутантные растения по гену FACKEL, кодирующему С-14 стеринредуктазу, были получены независимо, с использованием двух разных подходов, в двух лабораториях. У арабидопсиса при анализе 14 000 растений М2, полученных из семян, обработанных ЭМС, выявили одно мутантное растение fk-179. В ходе генетического анализа показано, что fk-179— это рецессивная ядерная мутация с плейотропным эффектом. На ранних стадиях проростки, выращенные из семян этого растения, характеризовались значительными фенотипическими изменениями, а именно: отсутствие удлинения гипокотиля у этиолированных проростков на свету; на месте, где в норме формировался гипокотиль, развивались короткие, но тонкие структуры; увеличение числа семядолей. Взрослые растения имели фенотип, схожий с фенотипом мутантов по синтезу брасси-нолидов: карликовость, темно-зеленая розетка листьев, снижение апикального доминирования. Кроме того, растения fk-179 характеризовались, по сравнению с диким типом, продолжительной меристематической активностью, почти полной стерильностью и нарушениями развития сосудистой системы [50].
Шесть других аллелей локуса FACKEL были выявлены при скрининге Т-ДНК инсерционных мутантов. Анализ проводили на ранних стадиях эмбриогенеза. У 6 мутантов выявлены различные отклонения в клеточном делении на стадии глобулы [72]. Все полученные мутации оказались аллельными.
Ген был клонирован, и показано, что он гомологичен гену ERG24, кодирующему С-14 стеринредуктазу дрожжей, и двум генам стеринредуктаз человека.
Биохимическими характеристиками мутантов являлось накопление субстрата фермента С14 стеринредукта-зы —4а-метил-5эргоста-8,14,24(28 )-триен-Зр-ола, изменение соотношения стеринов, уменьшение содержания брассиностероидов. Состав стеринов изменялся как качественно (появление значительного количества А8 14-ди-енстеринов), так и количественно (уменьшение уровня кампестерина, кампестанола, ситостерина, ситостанола). С использованием 15-азостерина, ингибитора стеринме-тилтрансферазы (СМТ) были также получены мутанты
по биосинтезу стеринов, у которых наблюдалось накопление Д8 14-диенстеринов в клетках. Растения, выращиваемые на среде с добавлением 15-азостерина, характеризовались замедленным развитием, коррелирующим с повышением уровня А8 |4-диенстеринов в клетках [70]. Таким образом, эмбриональное (генетическое) и постэм-бриональное (химическое) ингибирование СМТ влияет по-разному на рост и развитие растений.
Стериновые мутанты растений по последним этапам биосинтеза
Стериновые мутанты последующих шагов биосинтеза были выявлены среди проростков с измененной морфологией (карликовостью). Так, для арабидопсиса и гороха были описаны мутации по генам, кодирующим Д7-стерин-С5-десатуразу (STE1/DWARF/BUL1), Д5 7-сте-р и н - Д7 -р е ду кт азу (DWARF 5) [23] и Д24 — стерин-изоме-разу/редуктазу (D1M/DWARF1/LKB) [52,62,23], которые характеризовались значительными изменениями роста и развития. Фенотипически эти мутанты выглядели как карлики и по многим признакам напоминали мутантов по синтезу брассиностеринов cpd [70] и dwatf4 [23]. Они также характеризовались сниженной фертильностью, удлиненным жизненным циклом и круглыми закрученными листьями [47].
Для мутантов по гену, кодирующему С5(6)-десатура-зу, характерно накопление Д7-стеринов (в основном си-тостанола). При этом у таких мутантов (stel, dwarfl и bull) почти полностью отсутствует А5 кампестерин, что приводит к снижению уровня синтеза брассиностеринов, что соответственно отражалось на размере растения [23, 69]. Трансформация корней растений stel геном ERG3 Saccharomyces cerevisiae, кодирующим Д7-стерол-С5-десатуразу, привела к частичному восстановлению нормального фенотипа [33]. Для подтверждения того, что ген STE1 Arabidopsis thaliana кодирует Д7-стерол-С5-десатуразу, мутант дрожжей, дефектный по гену ERG3, был трансформирован фрагментами библиотеки кДНК, выделенными у растений арабидопсиса дикого типа. В ходе анализа трансформантов был выявлен фрагмент, восстанавливающий утраченную функцию у мутанта дрожжей. Фрагмент соответствовал ORF размером 843Ьр и кодировал полипептид из 281 аминокислоты. Для белка характерны три гистидин-богатых мотива, которые также были выявлены у белка Erg3 [34].
Мутанты dwarj5 накапливают Д5,7-ситостерин. Очевидно, что мутантные растения имеют блок на этапе, контролируемым Д5'7-стерин-Д7-редуктазой. Экзогенное добавление брассинолидов приводит к восстановлению нормального фенотипа [69].
Описаны мутанты арабидопсиса (diminuto/dwarfl) и гороха (Jkb) по гену, кодирующему А24 — стерин-изомеразу/
редуктазу. Все они имеют карликовый фенотип, характерный для мутантов по синтезу брассиностеринов, который обусловлен нарушением клеточной элонгации. Экзогенное добавление брассинолидов восстанавливало у мутантов diminuto способность к нормальной клеточной элонгации. Качественный и количественный анализ содержания стеринов показал, что у таких мутантов очень сильно снижено содержание кампестерина и ситостерина, в то время как содержание 24-метиленхолестерина и изофукостерина (для синтеза которых не требуется А24—стерин-редуктазная активность), напротив, увеличено [52].
Таким образом, в литературе описаны стериновые мутанты, которые характеризуются различными морфологическими изменениями и, как правило, имеют карликовый фенотип.
ВТОРИЧНЫЕ МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ СОЕДИНЕНИЯ И ИХ БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ
Фитоалексины. Показано, что кроме стеринов некоторые вторичные соединения, например фитоалексины, могут также значительно изменять уровень устойчивости растений к вредителям.
Так, большая часть синтезируемых веществ, а именно более 100 ООО низкомолекулярных соединений, не являются необходимыми для жизнедеятельности. Роль многих из этих соединений еще не ясна. Спектр этих веществ, называемых вторичными метаболитами, различен у представителей различных таксономических групп растительного царства. Такое большое разнообразие данных соединений возникло в процессе эволюции высших растений и, как считают некоторые авторы, связано с их ролью в обеспечении устойчивости к вредителям [25].
Известно, что многие вторичные метаболиты обладают антимикробной активностью in vitro, и, как полагают, играют большую роль в защите растения от различных патогенов. Это достигается как благодаря конститутивному, так и индуцибельному (т. е. начинающегося после заражения патогеном) синтезу данных соединений. По современным представлениям, эти вещества разделяют на 2 группы: фигоалексины и фитоантиципины. Гетерогенную группу низкомолекулярных веществ, синтезируемых растением de novo после вторжения патогена и обладающих антимикробной активностью, называют фитоалексинами (рис. 4). В отличие от фитоалексинов, фитоантиципины синтезируются растением (после вторжения патогена) не de novo, а из сложных предшественников или конститутивно присутствуют в растении. Важно отметить, что различие между фитоалексинами и фитоан-тиципинами основано не на их химической структуре, а на том, как и когда они синтезируются в растении. Таким образом, одно и то же вещество может являться как фитоантиципином, так и фитоалексином. Так, например, сакуранетин — антимикробный агент из группы флаво-
сн
он с
НО^О "ОН
Авенантрамид А
Н СО.
ОН
Лютеолендин
О
6-метоксимеллеин
Пизатин
Капсидиол
Рис. 4. Структура некоторых фитоалексинов
нов, конститутивно синтезируется в листьях черной смородины, являясь таким образом фитоантиципином. В то же время сакуранетин — это главный фитоалексин, синтезируемый в листьях риса в ответ на вторжение патогена [53]. Как полагают, фитоалексины играют большую роль в защите растений, чем фитоантиципины. Во-первых, наличие фитоантиципинов показано для очень небольшого числа представителей высших растений, во-вторых, известно, что защитные реакции растения, которые останавливают рост патогена, развиваются после инфицирования [76].
В последние годы появляется все больше данных, подтверждающих роль вторичных соединений в защите растения от патогена.
Так, мутантные растения, у которых снижен уровень биосинтеза фитоалексинов или фитоантиципинов, характеризуются сниженной устойчивостью к патогенам по сравнению с диким типом. Например, мутация по гену кукурузы BXI приводит к блоку биосинтеза D1MBOA (2,4 гидрокси, 7-метокси,1,4 — бензоки, 3-бен-зоксазин). Гомозиготы rio данной мутации характеризовались неустойчивостью к Helminthosporium turcicum и Diplodia mayáis [30].
Известно, что сапонины — это производные тритер-пенов — также обладают антимикробной активностью. На основе двухвидовой системы хозяин-патоген: овес Avena sativa и корневой паразит Gaeumannomyces graminis var tritici, было показано, что мутантные растения со сниженным содержанием авенацина (один из са-
понинов) характеризуются пониженной устойчивостью к патогену [64]. Известно, что Gaeumannomyces graminis var tritici синтезирует фермент авенациназу, который расщепляет авенацин. С помощью метода «генного нокаута» были получены мутанты этого гриба по гену, кодирующему этот фермент. Потеря способности детоксифицировать авенацин приводила к неспособности гриба поражать овес [20]. Следовательно, авенацин обеспечивает один из первых защитных барьеров при инфицировании, и является одним из ключевых агентов, определяющих устойчивость в системе патоген-хозяин.
Интересные факты, касающиеся патогенспецефично-го ответа хозяина, получены при изучении нескольких pad— мутантов {phytoalexin deficient) арабидопсиса со сниженным уровнем биосинтеза камалексина (производное индола; единственный известный фитоалексин для арабидопсиса). Так, растения pad-3, в отличие от растений дикого типа, были неустойчивы к двум грибам-патогенам, Cochliobolus carbonum и Alternaría bras-sicola, но сохранили устойчивость к Botrytis cinerea, Peronospora parasitica. В то же время растения pad-4 оказались неустойчивы к двум последним из перечисленных патогенов. Кроме того, pad-3 сохранял устойчивость к бактериальному патогену Pseudomonas syringae. Эти результаты согласуются с тем, что различные патогены приводят к активации разных генов хозяйского ответа [37].
Другим примером, показывающим роль фитоалексинов в обеспечении устойчивости растений к патогенам, являются трансгенные растения томатов, характеризу-
ющиеся сверхпродукцией гена стилбенсинтазы и как результат — измененным содержанием фитоалексинов. Этот фермент участвует в биосинтезе фитоалексина резвератрола. Показано, что полученные трансгенные растения, в которых успешно экспрессировались 2 гена стилбенсинтазы, были устойчивы к Phytophthora infestans [74]. Аналогичная работа была проведена на люцерне. Трансгенные растения, несущие ген стилбен-синтазы, выделенный из растений винограда, характеризовались более высокой устойчивостью к Phoma medicaginis по сравнению с диким типом [48]. Примерно в то же время были получены растения люцерны со сверхэкспрессией гена, кодирующего фермент изофлавон-О-метилтрансферазу. У них был повышен уровень содержания фитоалексина медикарпина, и эти растения характеризовались большей устойчивостью к Phoma medicaginis по сравнению с диким типом [45].
Итак, фитоалексины и фитоантиципины влияют на устойчивость растений к патогенам, что открывает заманчивые перспективы для получения устойчивых растений методами генной инженерии.
Таким образом, изучение путей вторичного метаболизма растений позволит не только уточнить их биологические функции, но в будущем использовать эти соединения для получения устойчивых к патогенам культурных растений.
Стероидные гликоалкалоиды также относятся к веществам вторичного метаболизма. При рассмотрении функций стероидных гликоалколоидов мы ограничимся гликоалкалоидами рода Lycopersicon. При поиске фун-гитоксических веществ алкалоид томатин был выделен из листьев томата Lycopersicon pimpinellifolium. Как оказалось, он представляет собой смесь двух гликоалкалоидов — а-томатина и дегидротоматина. Оба эти компонента представлены во всех частях растения [31]. а-то-матин и дегидротоматин имеют сходную структуру — это гликозиды, образованные из циклического углеводорода и тетрасахарида ликотетраозы. В образовании последнего участвуют ксилоза, галактоза и глюкоза в соотношении 1:1:2. Различие между двумя гликоалкалоидами состоит лишь в том, что у дегидротоматина имеется двойная связь между С5 и С6 атомами кольца В, а у а-томатина она отсутствует.
В целях выяснения роли а-томатина в устойчивости к Phytophthora infestans проведено изучение его содержания в листьях диких видов и культурных форм томата. Показана корреляция между содержанием томатина и степенью устойчивости к фитофторозу в пределах рода Lycopersicon (рис. 5, 6) [2]. Параллельно исследовано влияниение а-томатина на способность ингибировать рост 23 видов грибов [32].
Фунгитоксичные свойства а-томатина и других стероидных гликозидов объясняются их способностью об-
Рис. 5. Растения томатов, ус- Рис. б. Растения томата, по-тойчивые к фитофторозу раженные фитофторозом
разовывать комплексы со стеринами мембран клеток гриба. Дельтонин, например, в опытах in vitro образует такой комплекс с холестерином.
Сравнительно недавно при изучении фунгиотоксич-ности а-томатина показано, что многие патогенные для томатов грибы, и даже некоторые непатогенные, содержат фермент томатиназу. Этот фермент переводит а-томатин в менее токсичные для патогена формы — pj-или р2-томатин. Стероидные гликоалкалоиды и а-то-матин и дегидротоматин , в частности, являются важным фактором иммунитета и подавляют развитие активности патогена.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Итак, устойчивость (полная или частичная) растений к патогену обеспечивается либо выработкой антимикробных соединений, либо отсутствием веществ, необходимых для роста и развития патогена. Направленное изменение биосинтеза метаболитов растений позволяет получать растения, устойчивые к вредителям. Для обеспечения своей защиты растения синтезируют большое количество различных соединений. Научные представления об особенностях метаболизма этих веществ и их роли в обеспечении защиты растений постоянно расширяются. Возможно, это позволит в будущем успешно использовать стратегию, например, сверхпродукции фитоалексинов для получения устойчивых к патогенам растений.
Другая стратегия связана с природной зависимостью патогена от определенных веществ растения. В частности, показано, что растения с изменениями метаболизма стеринов устойчивы к фитостеринзависимым патогенам. Используя такую зависимость патогена от метаболизма хозяина, можно получать устойчивые к соответствующим заболеваниям растения. Разработка этой стратегии имеет очень большое значение, так как
в данном случае используется зависимость патогена от метаболизма хозяина.
Таким образом, достижения современной науки по изучению роли как стеринов, так и вторичных метаболитов, открывают широкие перспективы для решения практических задач получения устойчивых к патогенам растений на основе высокоурожайных сельскохозяйственных сортов.
Работа поддержана грантом BRHE STO-12-O (CRDF-МинОбр РФ).
Литература
1. Галъцова Р. Д. Стеринообразование у дрожжевых организмов. — М.: Наука, 1980,—224 с.
2. Жученко A.A. Устойчивость растений к патогенам в системе их общей и специфической активности: Кн. Генетика иммунитета и селекция сельскохозяйственных растений на устойчивость в Молдавии. — Кишинев: Штиинца, 1984. — 254 с.
3. Кынтя П. К., Лазурьевстш Г. В., Балашова H. Н., Балашова И. Т. и др. Строение и биологическая активность стероидных гликозццов рэдаспи-ростанаифуросгана. —Кишинев: Штиинца, 1987. —141 с.
4. Ковганко Н.В., Ахрем A.A. Стероиды (экологические функции). — Минск: Навука i техшка, 1990. —224 с.
5. Левашина Е.А. Клеточная селекция in vitro как способ получения растений, ограничивающих развитие стерин-зависимых насекомых//Дис. ... канд. биол. наук. —СПб., 1994. —120 с.
Ь.Лутова Л.А., Левашина Е.А., Бондаренко Л.В., Андронова Е.В. и др. Мутации высших растений по биосинтезу стеринов IIГене-тика. — 1992. Вып. 28, —С. 129-136.
7 .Лучникова Е.А., Инге-Вечтомов С.Г., Ибрагимов А.И., Левченко Л.В. Влияние генетических изменений в биосинтезе стеринов у Saccharomyces cerevisiae на морфогенез и плодовитость Drosophila melanogaster в двойной системе «дрозофила- дрожжи» //Иссл. генет. — 1981. — Вып. 9. —С. 54-65.
8. Озерецковская О.Л., Ильинская Л.И., Васюкова Н.И. Биохимические механизмы олигогенной фитофтороустойчивости картофеля // Успехи биол. химии. —1993. —Вып. 66. —С. 51-85.
9. Пасешниченко В. А. Итоги науки и техники. Биосинтез и биологическая активность растительных терпеноидов и стероидов. — М., 1987. — С. 88-127.
10. Тарлаковский С. А. Стерины: их метаболизм, функции и роль во в взаимоотношениях растений с вредными организмами // Биохимические аспекты проблем защиты растений от болезней, вредителей и сорняков/Труды ВИЗРа. —1977. — Вып. 52. — С. 53-65.
1 \. ХоджайоваЛ.Т., Усольцева М.Ю., Асеева Е.А., ЛутоваЛ.А. Клеточная селекция растений картофеля, устойчивых к фитофторозу, с использованием веществ, нарушающих метаболизм стеринов // Физиология растений. —1998. —Т. 45. —С. 283-288.
12. Ходжайова Л Т., Левашина Е.А., Усольцева М.Ю., Бондаренко Л.В.
и др. Изменение содержания стеринов как способ биологической борьбы с фитостерин-зависимыми организмами // Генная инженерия и экология. — 2000. —Т. 1. —С. 56-63.
13. Чжан Си Чунь. Получение мутантов томатов, устойчивых к фитофторе с использованием методов клеточной селекции // Дис. канд. биол. наук. —СПб., 1999. — 119 с.
14. Щербакова Л. А., Васюкова H.H., Иванюк В.Г., Давыдова М.А. и
др. Фитостерины и развитие фитофтороза в период вегетации картофеля//Прикл. биохим. микробиол. —1981. —Вып. 16. — С. 106-112.
15. Akihisha Т., Shimizu N.. Ghosh P., Thakur S. et al. Sterols of Cucurbitaceae//Phytochem. — 1987. —26. —P. 1693-1700.
16. Bach T.J., Lichtenthaler H.K. Inhibitioin by mevinolin of plant growth, sterol formational pigment accumulation // Physiol. Plant. — 1983.— 59, —P. 50-60.
17. Benveniste P. Sterol Biosynthesis // Annu. Rev. Plant. Physiol. —
1986, — 37.— P. 275-308.
18. Benveniste P., Rahier A. Target sites of sterol biosynthesis inhibitors
in plants // In: Target sites of fungicidal action / Ed. Koller W.D.-London: CRC Press. — 1992. — P. 207-226.
19. Benveniste P., Schaller H., GrausemB. et al. //Expression of the Hevea brasiliensis (H.B.K.) Mull. Arg. 3-Hydroxy-3-Methylglutary 1-Coenzyme A Reductase 1 in Tobacco Results in Sterol Overproduction // Plan t Physiol. —
1995, —109, —P. 761-770.
20. Bowyer P., Clarke B.R., Lunness P., Daniels, M.J. et al. // Host range
of a plant pathogenic fungus determined by a saponin detoxifying enzyme // Science. — 1995. — 267. — P. 371-374.
21. Caelles C., Ferrer A., Balcalls L., Hegardt F.G. et al. Isolation and structural characterization of acDNA encoding Arabidopsis thaliana 3-hydroxy-3methylglutaryl coenzyme A reductase // Plant Mol. Biol. — 1989. — 13. — P. 627-634.
22. Cattel L., Balliano G., Caputo D., Delprino L. Biosynthessis of stigmasta-7, E-24(28)-dien-3b-ol and 24a-alkyl sterols in Bryonia disica//Phytochem. — 1980. — 19. — P. 465^166.
23. Choe S., Noguchi T., Fujioka S., Takatsuto S. et al. The Arabidopsis dwf7/stel mutant is defective in the delta7 sterol C-5 desaturation step leading to brassinosteroid biosynthesis // Plant Cell. — 1999. — 11. — P. 207-221.
24. Clouse S.D. Arabidopsis Mutants Reveal Multiple Roles for Sterols in Plant Development//The Plant Cell. — 2002. —14. — P. 1995— 2000.
25. Costet M.F., Achouri M., Charlet M., Janot R. et al. Ecdysteroid biosynthesis and embryonic development are disturbed in insects (Locusta migratoria) reared on plant diet (Triticum sativum) with a selectively modified sterol profile // Proc. Nat. Acad. Sei. USA. — I9S7. — 84. — P. 643-647.
26. Dixon R.A. Natural products and plant disease resistance//Nature. —
2001,— 411, — P. 843-847.
27. Dutta P.C. Lipid bodies in plants // Plant Science. — 1991. — 78. —
P.259-267.
28. Feldlaufer M.F. Diversity of molting hormones in insects//In Ecdysone,
ed.KoolmanJ.//Verlag. Stuttgart. —1989. —P. 308-311.
29. Fenner G. P., Patterson G.W., KoinessP.M. Sterol composition during
the life cycle of the soybean and squash//Lipids. — 1986. —21. — P. 53-56.
30. Fenner G.P., Patterson G. W., Lusby IV.R. Development regulation of
sterol biosynthesis in Cucurbita maxima L. // Lipids. — 1989. — 24. — P. 271-278.
31. Frey M. Analysis of a chemical plant defense mechanism in grasses II
Science. — 1997. — 277. — P. 696-699.
32. Friedman M., Levin C., McDonald G. Tomatine determination in tomatoes by HPLC using pulsed amperometric detection // J. Agric. Food Chem. —1994. —42. — P. 1959-1964.
33. Friedman M. Tomato Glycoalkaloids: Role in the Plant and in the Diet
IIJ. Agric. Food Chem. —2002. — 50. — P. 5751-5780.
34. Gachotte D., Meens R., Benveniste P. An Arabidopsis mutant deficient
in sterol biosynthesis:heterological complementation by ERG3 encoding a A7-sterol-C5-desaturase from yeast // The Plant Journal. — 1995. —8. — P. 407-416.
35. Gachotte D., Husselstein T., Bard M. et al. Isolation and characterisation of an Arabidopsis thaliana cDNA encoding a D7-sterol — C-5-desaturase by functional complementation of defective yeast mutant//The Plant Journal. — 1996. —9. —P. 391-398.
36. Garg V.K., Nes W.R. Codisterol and others A5 —sterols of Cucurbita maxima//Phytochem. — 1984. —23. —P. 2925-2929.
37. Garg V.K., Nes W.R. Studies on the C-24 configurations of D7 — sterols in the seeds of Cucurbita maxima // Phytochem. — 1984. — 23, —P. 2919-2923.
38. Glazebrook J. Use of Arabidopsis for genetic dissection of plant defense
responses // Annual Rev. Genet.— 1997.— 31.— P. 547-569.
39. Gondel L., Weber T, Maiüoi-Vernier P., Benvenisle P. ct al. Regulatory role of microsomal 3-hydroxy-3-mcthylglutaryl-coenzymc A rcductasc in tobacco mutant that overproduces sterols // Biochcm. Biophys. Res. Commun. — 1992. — 186. — P. 888-893.
40. Gondet L., Bronner R., Benvenisle P. Regulation of Sterol Contents in Membranes by Subcellulars Compartmcntation of Stcryl-Esters Accumulating in a Stcrol-Ovcrproducing Tobacco Mutant // Plant Physiol. — 1994,— 105, —P. 509-518.
41. Hammerschmidt R. Phytoalexins: what have we learned after 60 years? / / Annu. Rev. Phytopathol. — 1999. — 37. — P. 285-306.
42. Harbone J.B. Introduction to ecological biochemistry // L.: Acad. Press. — 1982. — P. 278.
43. Hartmann P., Benveniste P. Plant Membran Sterols: Isolation, Identification and Biosynthesis // Methods of Ensymology. — 1987,— 148,—P. 632.
44. Hauple R.C. & Nes W.D. Evidence for differences in sterol biosynthesis dcrivatization in sorghum // Journal of natural products. — 1984. — 47. — P. 292-299.
44. Hayashi H., Czya /., Lubenow H., Schell J., Walden R. Activation of plant gene by T-DNA tagging: auxin-independent growth in vitro // Sciencc. — 1992. — 258. — P. 1350-1353.
46. He X., Dixon R. Gcnctic manipulation of isoflavonc 7-O-mct-hyltransfcrasc enhances the biosynthesis of 48-O-methylated isoflavonoid phytoalcxins and disease resistance in alfalfa // Plant Cell. — 2000. — 12. — P. 1689-1702.
47. Heftman E. Biosynthesis of steroids in Solanaccac //Phytochemistry. — 1983, — 22.— P. 1843-1860.
48. Heuple R., Nes W.D. Evidence for differences in sterol biosynthesis dcrivatization in sorghum // Journal of natural products. — 1984. — 47. — P. 292-299.
49. Hipskind J., Paiva, N.L. Constitutive accumulation of a rcsvcratrol-glucosidc in transgenic alfalfa increases resistance to Phoma mcdicaginis // Mol. Plant-Microbe Interact. — 2000. — 13. — P. 551-562.
50. Itoh T„ Tamura T., Matsumoto T. Sterols, methylstcrols and tritcrpenc alcohols in three Thcaccac and some other vegetable oils // Lipids. — 1974,— 9,— P. 173-184.
51. Jang J.C., Fujioka S., Tasaka M., Seto H. ct al. A critical role of sterols in embryonic pattering and mcristem programming revealed by fackcl mutants of Arabidopsis thaliana // Genes & Dcvcl. — 2001,— 14,— P. 1485-1497.
52. Kauschmann A., Jessop A., Koncz C.. Szekeres M. ct al. //Plant Journal. — 1996. — 9. — P. 701-713.
53. Kircher H.W., Rosenstein F.V., Fogleman J.C. Selective uptake and lack of dcalkylation of phytostcrol by cactophilic spccics of Drosophila // Lipids. — 1984. — 19. — P. 235-238.
54. Klahre V., Noguchi T., Fujioka S., Takatsuto S. ct al. // Plant Cell. —
1998,— 10. — P. 1677-1690.
55. Kodama O., Suzuki, T. Miyakawa J. & Akatsuka T. Ultraviolct-induccd accumulation of phytoalcxins in rice leaves // Agric. Biol. Chcm.— 1988,— 52,— P. 2469-2473.
56. Koller W. Antifungal agents with target sites in sterol functions and biosynthesis // Target sites of fungicide action / Ed. Koller W. London: CRC Press. — 1991. — P. 119-207.
57. Maillot-Vernier P., Schuller H., Benveniste P., Belligard G. Biochcmical characterization of sterol mutant plant regenerated from tobacco callus resistant to a triazolc cytochrome P -obtusifoliol-14-dcmethylase inhibitor // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 1989,— 165,— P. 125-130.
58. Mailott-Vernier P., SchallerH., Benveniste P., Belligard G. Gcnctic study and further biochcmical charactcrization of tobacco mutant that overproduces sterols // Mol. Gen. Genet. — 1991. — 231. — P. 33^10.
59. Maugh T.M. New Chemicals promis larger crops //Scicncc. — 1981, — 212. — P. 33-34.
60. McMorris T.C. Sex hormones in the aquatic fungus Achlya // Lipids. — 1978,— 13.— P. 716-722.
61. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid and bioassays with tobacco tissue culture // Phisiol. Plant. — 1962. — 15. — P. 473—479.
62. Murphy D. The biogenesis and functions of lipid bodies in animals, plants and microorganisms // Prog Lipid Res. — 2001. — 40. — P. 325^138.
63. Narita J.O., Gruissem W. Tomato hydroxymcthylglutaril-CoA rcductasc is required early in fruit development but not during ripening // The Plant Cell. — 1989. — 1. — P. 181-190.
64. Nomura T„ Kitasaka Y., Takatsuto S., Reid J. ct al. // Plant Physiol. —
1999,— 119,— P. 1517-1526.
65. Pang S.-Z., de Boer D., Wan Y, Ye G. ct. all.An improved green fluorescent protein gene as a vital marker in plants // Plant Physiol. —
1996,— 258,— P. 1350-1353.
66. Papadopoulou K., Melton R.E., Leggett M., Daniels M.J. ct al. Compromised disease resistance in saponin-dcficicnt plants // Proc. Natl Acad. Sci. USA. — 1999. — 96. — P. 12923-12928.
67. Pascale S.. Taton M., Raliier A. Plant sterol biosynthesis. Identification and charactcrization of two distinct microsomal oxidative enzymatic systems involved in sterol C-4 dcmctilation // J. Biol. Chcm. — 1993. — 268, — P. 11636-11654.
68. Pinto W.J., Nes W.R. Stcrcochemical spccifity for sterols in Saccharomyces ccrevisiac // J. Biol. Chcm. — 1983. — 258. — P. 4472-4479.
69. Salimova E., Boschetti A., Eichenberger W., Lutova L. Sterol mutants of Clamidomonas reinhardtii: charactcrization of three strains deficient in C24(28) rcduclase // Plant Physiol. Biochcm. — 1999. — 37. — P. 241-249.
70. Salt T., Adler J.H. Diversity of sterol composition in the family Chcnopodiaccae // Lipids. — 1985. — 20. — P. 594-601.
71. Salt T„ Tocker J.E., Adler J.H. Dominance of A5-sterols in eight spccics of the Cactaccac // Phytochcm. — 1987. — 26. — P. 731-733.
72. Schuller H. The role of sterols in plant growth and development // Progress in Lipid Rcscarch. — 2003. — 42. — P. 63-175.
73. Schaller H., Maillot-Vernier P., Benveniste P., Belliard G. Sterol composition of tobacco calli selected for resistance to fenpro-pimorf// Phytochem. — 1991. — 30. — P. 2547-2554.
74. Schrick K., Mayer V., Horrichs A., Kuluit C. ct al. FACKEL is a sterol C-14 rcductasc required for organized ccll division and expansion in Arabidopsis cmbryogcncsis // Genes Dev. — 2000. —
14,— P. 1471-1484.
75. Tada M., Tahakashi T„ Koyama H. Triterpcns and sterol from the roots of Aster scabcr // Phytochcm. — 1974. — 3. — P. 670-671.
76. Taton M., Benveniste P.. Rahier A. Mcchanism of inhibition of sterol biosynthesis enzymes by N-substitutcd morpholincs // Pcstis. Sci. --
1987,— 21, — P. 269-280.
77. ThomzikJ, Stenzel K„ Schreier P. ct al. Synthesis of a grapevine phytoalexin in transgcnic tomatoes (Lycopersicon esculentum Mill.) conditions resistance against Phvtoplithora in/estans // — Physiological and Molccular Plant Pathology. '— 1997. — 51. — P. 65-278.
78. VanEtten, Fanner B. Two Classes of Plant Antibiotics: Phytoalcxins versus Phytoanticipins? // The Plant Ccll. — 1994. — 9. — P. 1191-1192.
79. Venken M., Asctrd II , GeunsJ. et al. Scncsccnce of oat leaves: changes in the sterol composition and enzyme activities of the membrane // Plant Sci.— 1991— 79, — P. 3-11.
80. Zhang X.-C., Han Z.-H., Hodjaiova L.T., Lutova L.A. Sterols biosynthesis and their physiological role in plants // Plant Physiology Communications. — 2001. — 37. — P. 452-457.
Metabolites of plants and their role in resistance to phytopathogens
L.A. Lutova, G.M. Shumilina
Chair of gcnctics and selection of Saint Petersburg university.
THE SUMMARY: Plant disease resistance is a complex reaction where biochemical peculiarities play a major role. The review is focused on two strategies of improvement of plant resistance to some groups of pathogens. The first strategy is based on a dependence of pathogens on certain plant compounds, i.e. sterols. The lack of these metabolites in a host plant repress pathogen development and reproduction. Here we present modern data on sterol metabolism and their functions in plants as well as description of known plant sterol mutants. The other way to improve plant resistance is to stimulate biosynthesis of secondary metabolites with antimicrobial activity. The roles of phytoalexins and steroid glycoalcoloids in the development of plant resistance is described here on certain examples.
^KEY WORDS: second nretabolites, phyto sterina, mutants, resis tans to pest.
