CC BY
38
M.B. Вялкина2, A.A. Федоров3, Э.Н. Эскина4, Ю.С. Медведева2, E.H. Архипова1' 2, M.A. Лебедева1' 2, Н.Н. Хлебникова2, М.В. Баранов1, М.Ю. Карганов1 2
Метаболические сдвиги и морфологические изменения в глазе крысы при моделировании микрогравитации
1 НИИ космической медицины ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр специализированных видов медицинской помощи и медицинских технологий» ФМБА России, г. Москва 2 ФГБНУ «НИИ общей патологии и патофизиологии», г. Москва 3 ФГБНУ «НИИ глазных болезней», г. Москва 4 ФГБОУ ДПО «Институт повышения квалификации» ФМБА России, г. Москва
M.V. Vyalkina2, A.A. Fedorov3, E.N. Eskina4, Yu.S. Medvedeva2, E.N. Arkhipova1' 2, M.A. Lebedeva1' 2, N.N. Khlebnikova2, M.V. Baranov1, M. Yu. Karganov1 2
Metabolic shifts and morphological changes in rats' eye during microgravity simulation
1 Research Institute for Space Medicine Federal Research Clinical Center of Specialized Types of Medical Care and Medical Technologies, Federal Biomedical Agency of Russia, Moscow 2 Research Institute of General Pathology and Pathophysiology, Moscow, Russia 3 Research Institute of Eye Diseases, Moscow, Russia 4 Ophthalmological Department of Federal Medical-Biology Agency of Russia, Moscow, Russia
Ключевые слова: амакриновые клетки, биполярные клетки, лазерная корреляционная спектроскопия, моделирование микрогравитации, мюл-леровские клетки, сосуды сетчатки.
Keywords: Amacrine Cells, Bipolar Cells, Laser Correlation Spectroscopy, Microgravity Simulation, Muller Cells, Retinal Vessels.
Моделирование микрогравитации на крысах вызывало изменения в составе глазных смывов. Молекулярный субфракционный анализ с помощью лазерной корреляционной спектроскопии выявил существенные различия в характере распределения частиц следующих размеров: 1,92,56; 4,64-6,25; 91,3; 165-300 и 400-734 нм. Моделирование микрогравитации вызывало ряд взаимосвязанных процессов в сетчатке экспериментальных крыс, выражающихся в снижении общей и неравномерной послойной толщины сетчатки, умеренном отеке и, следовательно, относительном снижении плотности нейронов, главным образом за счет амакриновых и биполярных клеток внутреннего ядерного слоя. Эти изменения могут быть объяснены относительной циркуляторной ишемией внутренних слоев сетчатой оболочки глаза.
Microgravity simulation in rats resulted in changes in eye lavage content. Molecular subfraction analysis, using laser correlation spectroscopy, revealed substantial differences in the pattern of particle size distributions: 1.9-2.56; 4.64-6.25; 91.3; 165-300, and 400-734 nm. Microgravity modeling induced a series of interrelated processes in the retina of experimental rats which was manifested in a decrease of overall and uneven layer-by-layer thickness of the retina, mild edema and, consequently, a decreased relative density of neurons. In the inner nuclear layer, the cell density decreased chiefly due to the amacrine and bipolar cells. These changes could be explained by relative circulatory ischemia of the retinal layers, which are dependent on the retinal vessel circulation system.
В последние годы вслед за растущей интенсивностью космических полетов расширяются и исследования их влияния на организм человека. Зафиксировано, что приблизительно у 20% астронавтов, побывавших на Международной космической станции (МКС), отмечаются ощутимые изменения со стороны органа зрения [14]. Авторы связывают эти явления с биохимическими процессами, вызванными дефицитом фола-та и витамина В12, и полиморфизмом ферментов, указывая и на повышение внутри -черепного давления как возможную причину наблюдаемых нарушений. Было обнаружено также, что микрогравитация вызывает у людей снижение внутриглазного давления [12], увеличение толщины и объема сетчатки с последующим появлением относительных, т.е. неполных и вполне обратимых, скотом. Возвращение этих показателей к исходному уровню занимало около 6 месяцев.
Дальнейшие исследования выявили ней-рональные потери в сетчатке после космического полета [13], нарушения структуры ре-тинального пигментного эпителия [10] и более раннее появление катаракты [4]. Таким образом, в настоящее время истинные причины и патогенез зрительных расстройств во время и после космического полета остаются невыясненными, что и послужило основанием для проведения настоящего исследования.
Материалы и методы
Исследования проводили на крысах-самцах линии Вистар массой тела 220—270 г. Животные были разделены на две группы: опытную, в которой моделировали эффекты микрогравитации (п=186), и контрольную, находившуюся в условиях вивария (п=193). Крысы обеих групп получали стандартный пищевой рацион и в течение всего эксперимента имели свободный доступ к воде и пище. Работы проведены в соответствии с решением этического комитета и с соблюдением соответствующих правил обращения с экспериментальными животными.
Эффекты микрогравитации достигались путем вывешивания животных экспериментальной группы [1; 9] на 7 суток под углом 30° в специальном стенде (рис. 1). Стенд представляет собой каркас, на котором по двум
направляющим рельсам перемещается балка с подвижной кареткой. Каретка может двигаться в любом направлении в пределах горизонтальной плоскости над сетчатым полом размером 40х40 см, под которым помещается поддон для сбора экскрементов. Для подвешивания животного к подвижной каретке в целях обеспечения равномерного распределения весовой нагрузки на туловище используется специальная система, состоящая из капронового костюма для крысы с отверстиями для конечностей. В костюме располагаются две металлические пластины, примыкающие к спине животного, которые удерживают его тело от провисания и позволяют придать избранный угол вывешивания для всего тела.
Смывы с обоих глаз отбирали следующим образом: микродозатором с одноразовым наконечником наносили на глаз 200 мкл физиологического раствора, не касаясь роговицы, в то же время вторым дозатором собирали смыв во избежание попадания избытка жидкости на шерсть. Полученные образцы хранили при +4°С 3—4 часа либо при —20°С не более 5 суток до измерения. Непосредственно перед анализом смывы центрифугировали 15 минут при 3000 об./мин и супернатант вносили в кювету прибора. Лазерная корреляционная спектроскопия (ЛКС) позволяет определять субфракционный состав биоингредиентов в довольно широком диапазоне их молекулярных размеров (от 1 до 10 000 нм). Физическая сторона данного метода основана на принципах допплеровской спектроскопии [7]. Подробные ЛК-гистограммы, сформиро-
11 I
Р 1
Г -Л
V [ V
Рис. 1. Экспериментальное животное в стенде для моделирования эффектов микрогравитации
ванные управляющей программой спектрометра, состоят из 32 точек. Количество столбцов отражает число учитываемых субфракций молекул при обработке (минимизации) спектра, а их величина — вклад в светорассеяние соответствующей фракции [8].
По окончании эксперимента крыс подвергали эвтаназии путем передозировки снотворного. Энуклеированные глаза фиксировали в холодном 2,5% растворе глютаральдегида в течение 2—8 часов с предварительным нанесением проникающих циркулярных разрезов в перилимбальной области. После отмывания в фосфатном буфере отсекали передний отрезок глаза в проекции плоской части цилиар-ного тела, удаляли хрусталик и выделяли горизонтальную колодку, из которой вырезали фрагменты стенки глазного яблока со всеми тремя оболочками размерами 1,5 х 1,5 мм, соответствующие областям заднего полюса, экватора и переднего отрезка. Выделенные образцы дофиксировали в 1% растворе осмиевой кислоты (1 час), обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заливали в смесь эпоксидных смол эпон-аралдит. Полутонкие срезы толщиной 0,5—1,5 мкм готовили на «УльтратомеЛУ» (ЬКВ, Швеция), окрашива-
ли метиленовым синим и фуксином (полих-ромное окрашивание). Полученные гистологические препараты исследовали на световом микроскопе Leica DM-2500, фоторегистриро-вали на цифровую фотокамеру Leica DFC320 с последующим морфометрическим анализом изображений с помощью программного обеспечения ImageScope Color.
Результаты исследования и их обсуждение
Были проведены две серии экспериментов с 7-суточным моделированием микрогравитации, интервал между сериями составил 9 месяцев. Прежде всего, предстояло убедиться в стабильности и воспроизводимости результатов. Для этой цели были сопоставлены данные, полученные с левого и правого глаз животных контрольной и экспериментальной групп. Как видно из рисунков 2 и 3, существенных различий в характере распределения частиц в смывах с левого и правого глаз как в опытной, так и в контрольной группах обеих серий не выявлено. Небольшие различия между сериями могут быть обусловлены сезонными колебаниями сывороточного гомеостаза. Эти наблюде-
ние. 2. Гистограмма распределения частиц смывов с глаз контрольных животных по размерам
По оси ординат - вклад в светорассеяние частиц соответствующей зоны, %, по оси абсцисс - размер частиц, нм
Рис. 3. Гистограмма распределения частиц смывов с глаз экспериментальных животных по размерам
По оси ординат - вклад в светорассеяние частиц соответствующей зоны, %, по оси абсцисс - размер частиц, нм
ния позволили объединить данные, полученные с обоих глаз, внутри одной серии.
Сравнения результатов опытной и контрольной групп, полученных в двух сериях экспериментов, представлены на рис. 4. Основные статистически значимые различия наблюдаются в характере распределения частиц следующих размеров: 1,9—2,56; 4,64—6,25; 91,3; 165—300 и 400—734 нм. Следует отметить, что во всех интервалах кроме последнего сдвиги в обеих сериях сохраняют свою направленность. В первой зоне, где вклад в светорассеяние выше
у опытной группы, располагаются альбумины. Повышение их содержания характерно для дегидратации, вызванной условиями эксперимента. Кроме того, в этой зоне могут проявляться небольшие белки, возникающие вследствие дистрофических процессов, идущих в клетках. Во второй зоне (4,64—6,25 нм) локализованы глобулины, и пониженное их содержание у крыс опытной группы может свидетельствовать об уязвимости иммунной системы, к которой приводит нахождение в условиях моделированной микрогравитации [5; 6; 11].
45 40 35 30 25 20 15 10 5 0
Смывы с глаз крыс
2-я серия
■ Контроль (191)
■ Подвешенные (188)
* *** ***
X *
ЙИ
51 Щ ^
1Л с>1
<4 Ч из со"
Ю Г\1 <чО
Р.
и-Г т оо
Рис. 4. Сравнение смывов с глаз крыс контрольной и подвешенной групп
По оси ординат - вклад в светорассеяние частиц соответствующей зоны, %, по оси абсцисс - размер частиц, нм; * - сравнение контрольной и подвешенной групп,р <0,05;** - сравнение контрольной и подвешенной групп,р <0,005;*** - сравнение контрольной и подвешенной групп, р <0,001 (критерий Манна-Уитни)
Пик в районе 91 нм, как было показано в опытах на лимфоцитах [3], обусловлен выходом нуклеопротеинов в межклеточную среду. В наших экспериментах вклад в светорассеяние этой фракции у опытной группы был выше, чем у контрольной. Это может свидетельствовать об усилении разрушения клеток в условиях моделированной микрогравитации. В зоне 165—300 нм вклад в светорассеяние смывов опытной группы ниже, чем в контрольной. Аналогичное снижение в этой зоне выявлено у пациентов с кератоконьюнктиви-том [2]. Зона 400—734 нм содержит крупные иммунные комплексы и, возможно, продукты деструкции клеток. Неустойчивость результатов на этом участке в двух сериях экспериментов может быть связана с сезонными изменениями в организме животных.
В норме сетчатая оболочка крысы по своей цитоархитектонике и типу васкуляризации во многом напоминает человеческую. Важным отличием следует считать существенно более тонкий наружный плексиформный слой (НПС) и, наоборот, утолщенный внутренний плекси-формный слой (ВПС). В области заднего полюса сетчатая оболочка крысы имела толщину 256±18,4 мкм. Толщина отдельных слоев указана в приведенной далее таблице. В слое нервных волокон располагаются магистральные ретинальные сосуды (рис. 5). В области экватора толщина сетчатой оболочки уменьшалась до 204,7±14,2 мкм, в большей степени за счет наружного ядерного слоя и ВПС (рис. 6). При большем увеличении можно видеть проходимые артериолярные ретинальные сосуды на уровне НПС (рис. 7). На периферии сетчатки ее толщина достигала 133,7±11,4 мкм, в основном за счет обоих плексиформных слоев. Соответственно практически равномерно уменьшалась удельная плотность нейронов, а также глиальных элементов (рис. 8).
Через 7 дней эксперимента общая толщина сетчатой оболочки в области заднего полюса несколько уменьшалась (218± 3,95 мкм) без заметного превосходства какого-то из слоев. Венозные ретинальные сосуды выглядели расширенными, в отличие от суженных артериолярных звеньев ( рис. 9). Застойный венозный кровоток мог быть причиной возникновения гипоксии внутренних слоев сетчатки. Плотность нейронов в
соответствующих слоях уменьшалась незначительно, при этом площадь ядер нейроци-тов увеличивалась — признак чрезмерной активации метаболических процессов, истощающих резервы клетки, тем самым нивелируя разницу между толщиной этих слоев в сравниваемых группах (см. таблицу).
Рис. 5. Контрольная группа. Область заднего полюса. Послойное строение сетчатой оболочки. Магистральный сосуд в слое нервных волокон (стрелка). Полутонкий срез. Окраска метилено-вым синим и фуксином
Рис. 6. Контрольная группа. Область экватора. Полутонкий срез. Окраска метиленовым синим и фуксином
Рис. 7. Контрольная группа. Область экватора. Проходимые ретинальные капилляры, достигающие НПС (стрелка). Полутонкий срез. Окраска метилено-вым синим и фуксином
В экваториальной зоне заметными становятся разрежение и увеличение средней площади нейронов во внутреннем ядерном слое. Некоторое истончение слоя с внутренней сто-
Рис. 8. Контрольная группа. Периферическая область сетчатки. Расширенные замыкательные сосуды в слое нервных волокон (стрелки). Полутонкий срез. Окраска метиленовым синим и фуксином
Рис. 9. Экспериментальная группа. Область заднего полюса. Дилатированная ретинальная вена (стрелка). Полутонкий срез. Окраска метиленовым синим и фуксином
Рис. 10. Экспериментальная группа. Область экватора. Истончение внутреннего ядерного слоя приводило к «дислокации» ядер мюллеровских клеток (стрелки) ближе к НПС. Полутонкий срез. Окраска метилено-вым синим и фуксином
роны смещало ядра опорных мюллеровских клеток ближе к границе ВПС (рис. 10). При большем увеличении можно было видеть, что уменьшение плотности ядер внутреннего ядерного слоя происходило в основном за счет биполярных и амакриновых клеток (рис. 11). Обращала на себя внимание агрегация эритроцитов (сладжирование) в глубоких капиллярных петлях, ответственных за трофику внутренних слоев сетчатки.
На периферии сетчатки общая ее толщина уменьшалась до 133±11,2 мкм (рис. 12). Послойная толщина сетчатой оболочки, а также удельная плотность нейронов во всех трех слоях по сравнению с контрольной группой несколько уменьшены (см. таблицу) на фоне суженных как хориоидальных, так и ретинальных сосудов. Просвет значительной части капилляров был перекрыт агрегированными эритроцитами.
Рис. 11. Экспериментальная группа. Область экватора. Агрегация эритроцитов в глубоких капиллярах (стрелка). Отек и разрежение биполярных (ВР) и амакриновых (Ат) клеток. М - мюллеровская клетка. Полутонкий срез. Окраска метиленовым синим и фуксином
Рис. 12. Экспериментальная группа. Периферическая область сетчатки. Отсутствие расширенных сосудов. Снижение послойной плотности нейронов, увеличение их средней площади. Полутонкий срез. Окраска метиленовым синим и фуксином
Морфометрические параметры сетчатой оболочки глаза крысы (контрольная группа, п=5; экспериментальная группа, п=8)
Параметр Центр Экватор Периферия
Контрольная группа Экспериментальная группа Контрольная группа Экспериментальная группа Контрольная группа Экспериментальная группа
Общая толщина, мкм 256±18,4 218±3,95 204,4±14 182,4±14 146±11 133±11
Послойная толщина, мкм
Ретинальный пигментный эпителий 6,74±0,82 4,31±0,72 4,18±0,51 4,18±0,51 3,84±0,63 3,84±0,63
Фоторецепторный слой 38,4±1,12 34,3±1,52 34,6±3,07 34,6±3,07 28,2±1,88 26,2±2,58
Наружный ядерный слой 52,1±3,55 49,9±1,19 42,4±2,2 36,6±2,2 39,3±1,14 30,3±1,14
Наружный плексиформный слой 14,4±1,88 10,2±2,1 10,2±2,02 9,84±1,02 9,7±1,86 5,11±1,58
Внутренний ядерный слой 39,3±1,97 32,5±1,87 34,1±1,36 25,6±3,72 25,6±2,79 17,7±1,79
Внутренний плексиформный слой 68,46±5,22 62,3±3,39 59,5±3,34 59,5±3,34 49,3±3,54 43,3±4,54
Слой ганглиозных клеток 20,1±1,67 15,8±2,68 14,7±3,04 13,3±1,84 10,7±2,42 8,97±1,41
Плотность ядер в наружном ядерном слое, кл/мм2 41 397 38 710 35 916 36 581 31 897 32 369
Средняя площадь ядра в наружном ядерном слое, мкм2 13,2±1,89 14,9±2,15 11,1±2,04 13,5±3,14 10,42±1,82 12,8±3,74
Плотность ядер во внутреннем ядерном слое, кл/мм2 18 506 15 721 13 785 13 957 18 506 12 600
Средняя площадь ядра во внутреннем ядерном слое, мкм2 34,7±10,1 33,4±5,7 32,5±9,2 35,7±8,1 28,4±8,7 39,7±2,6
Плотность ганглиозных клеток, кл/мм2 4501 3801 3708 3608 3308 3278
Средняя площадь ядра в слое ганглиозных клеток, мкм2 52,6±12,5 51,6±12,5 42,1±12,1 55,9±11,4 38,3±18,4 61,7±16,5
Таким образом, в результате эксперимента в сетчатой оболочке глаза подопытных крыс происходил ряд взаимосвязанных процессов, основными признаками которых были: уменьшение общей и коррелированно послойной толщины внутренней оболочки глаза, небольшой отек и соответственно увеличение средней площади нейронов на фоне уменьшения их удельной плотности, более выраженные во внутреннем ядерном слое и слое ганглиозных клеток. Во внутреннем ядерном слое уменьшение плотности нейронов происходило главным образом за счет амакриновых и биполярных клеток. На фоне истончения внутреннего ядерного слоя ядра опорных мюллеровских клеток сохраняли свое положение и оказывались «приближенными» к ВПС. Для нейронов слоя ганглиоз-ных клеток было характерно увеличение средней площади клетки за счет отека. Все эти изменения можно объяснить относительной ишемией тех слоев сетчатой оболочки, которые получают трофику из системы ретинального кровообращения. Для последней в течение эксперимента были характерны сужение магистральных артериальных и дилатация венозных сосудов, агрегация эритроцитов в микрососудах, затрудняющая транскапиллярный кровоток.
Сравнительный морфометрический анализ показал достоверные различия в толщине ретинального пигментного эпителия и фоторецепторов в центральной зоне сетчатки, кровоснабжение которых осуществляется исключительно из хориоидальных сосудов, следовательно, эти зоны являются более гемодинамически уязвимыми, чем экваториальные и периферические зоны сетчатки, где достоверные изменения при наших сроках исследования отмечали только в наружном ядерном и плексиформном слоях. Наиболее же достоверные изменения в виде снижения толщины в центральном, экваториальном и периферическом отделах удалось выявить лишь во внутреннем ядерном слое.
Очевидно, что система ретинального кровообращения менее устойчива к гравитационному воздействию, нежели хориокапиллярное русло. Длительное присутствие факторов, приводящих к ишемии в зоне кровоснабжения рети-нальных сосудов — внутренних слоев сетчатки, способно привести к нарушению обработки первичного сигнала от фоторецепторов и его проведению через биполярные и ганглиозные нейроны клетками к корковым отделам зрительного анализатора. Этот факт необходимо учитывать при постановке зрительных задач космонавтам.
Все морфометрические различия в обеих группах не были статистически значимы и носили скорее временный и обратимый характер. Более длительное воздействие гравитационных факторов в эксперименте поможет однозначно определить наиболее уязвимые звенья зрительного анализатора. Эти данные мы надеемся получить в дополнительной серии исследований, проведенных в различные сроки после воздействия экспериментальной микрогравитации.
Литература
1. Ильин Е.А., Новиков В.Е. Стенд для моделирования физиологических эффектов невесомости в лабораторных экспериментах с крысами // Авиакосмическая и экологическая медицина. 1980. Т. 14. № 3. С. 79-80.
2. Хлебникова Н.Н., Таршиц Д. Л., Карга-нов М.Ю. и др. Перспективы применения метода ЛКС слезной жидкости в диагностике тяжести патологического процесса при консервативных и оперативных методах лечения глазных болезней // Лазерная медицина. 1999. Т. 3. № 3-4. С. 67-73.
3. Alchinova I. Changes in serum and cell homeostasis under irradiation: Factors of distant action // American Journal of Life Sciences. 2015. Vol. 3. No. 1-2. P. 1-4.
4. Chylack L.T. Jr, Peterson L.E., Feiveson A.H. et al. NASA study of cataract in astronauts (NASCA). Report 1: Cross-sectional study of the relationship of exposure to space radiation and risk of lens opacity // Radiation Research. 2009. Vol. 172 (1). P. 10-20.
5. Crucian B.E., Stowe R.P., Pierson D.L., Sams C.F. Immune system dysregulation following short- vs longduration spaceflight // Aviation Space and Environmental Medicine. 2008. Vol. 79. No. 9. P. 835-843.
6. Girardi C., De Pito C., Casara S. et al. Integration analysis of microRNA and mRNA expression profiles in human peripheral blood lymphocytes cultured in modeled microgravity // BioMed Research International. 2014. Article ID 296747. URL: http://dx.doi.org/10.1155/2014/296747.
7. Karganov M., Alchinova I., Arkhipova E., Skalny A.V. Laser correlation spectroscopy:
Nutritional, ecological, and toxic aspects // Biophysics / Ed. by. A.N. Misra. Rijeka, Croatia, 2012. P. 1-16.
8. Karganov M., Skalny A., Alchinova I. et al. Combined use of laser correlation spectroscopy and ICP-AES, ICP-MS determination of macro-and trace elements in human biosubstrates for intoxication risk assessment // Trace Elements and Electrolytes. 2011. Vol. 28. No. 2. P. 124-127.
9. Morey E.R., Sabelman E.E., Turner R.T., Baylink D.J. A new rat model simulating some aspects of space flight // Physiologist. 1979. Vol. 22. No. 6. P. 23-24.
10. Roberts J.E., Kukielczak B.M., Chignell C.F. et al. Simulated microgravity induced damage in human retinal pigment epithelial cells // Molecular Vision. 2006. Vol. 30 (12). P. 633-638.
11. Sonnenfeld G., Butel J.S., Shearer W.T. Effects of the space flight environment on the immune system // Reviews on Environmental Health. 2003. Vol. 18. No. 1. P. 1-17.
12. Taibbi G., Kaplowitz K., Cromwell R.L. et al. Effects of 30-day head-down bed rest on ocular structures and visual function in a healthy subject // Aviation, Space, and Environmental Medicine. 2013 Vol. 84 (2). P. 148-154.
13. Zanello S.B., Nguyen A., Theriot C.A. Retinal non-visual photoreception in space // Aviation, Space, and Environmental Medicine. 2013. Vol. 84 (12). P. 1277-1280.
14. Zwart S.R., Gibson C.R., Mader T.H. et al. Vision changes after spaceflight are related to alterations in folate- and vitamin B12-dependent one-carbon metabolism // Journal of Nutrition. 2012. Vol. 142. P. 427-431.
Контакты:
Карганов Михаил Юрьевич,
заведующий отделом экспериментальной биологии и клеточной физиологии НИИ космической медицины ФНКЦ специализированных видов медицинской помощи и медицинских технологий ФМБА России, доктор биологических наук, профессор. Тел. моб. +7 903 610 91 32. E-mail: mkarganov@mail.ru
