CC BY
48
© АРТЕМЬЕВ С.А., КАМЗАЛАКОВА Н.И., БУЛЫГИН Г.В., НАЗАРОВ И.П.
МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ ЛИМФОЦИТОВ ДЕТЕЙ ПРИ ТЯЖЕЛОМ ОЖОГОВОМ ШОКЕ
С. А. Артемьев, Н.И. Камзалакова, Г.В. Булыгин, И.П. Назаров Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф.
Войно-Ясенецкого, ректор - д.м.н., проф. И.П. Артюхов; кафедра клинической иммунологии, зав. - д.м.н. проф., Г.В. Булыгин.
Резюме. Результаты исследования позволяют заключить, что развитие ожоговой болезни у детей сопровождается значительными метаболическими перестройками лимфоцитов, определяющими функциональные возможности клеток и иммунной системы в целом. Знание метаболических механизмов развития клеточных реакций на ожоговый шок и ожоговую болезнь позволяет уточнить элементы патогенеза этих тяжелых состояний и обосновать возможность применения метаболической коррекции в комплексном лечении детей с указанной патологией.
Ключевые слова: ожоговая болезнь, ожоговый шок, липидный спектр лимфоцитов.
Артемьев Сергей Александрович - к.м.н., анестезиолог-реаниматолог Краевой клинической больницы; e-mail: asa@24kr.ru, тел. 8(391)2-97-96-97.
Камзалакова Наталья Ивановна - д.м.н., проф. кафедра клинической иммунологии КрасГМУ, 8(391)220-15-52.
Булыгин Геннадий Викторович - д.и.н., проф., зав. каф. Клинической иммунологии КрасГМУ; e-mail: skyman1977@mail.ru, тел. 8(391) 220-15-52.
Реакция организма детей на ожоговый шок подчиняется известным общефизиологическим закономерностям. В то же время, можно считать доказанным, что полноценное участие иммунокомпетентных клеток в процессах антигенного распознавания с последующим формированием адекватного иммунного ответа определяется, прежде всего, особенностями их внутриклеточного обмена и состоянием их мембран [1; 3]. Изменения липидного обмена у больных в критических состояниях изучены мало. Имеются лишь отдельные сведения об общих закономерностях этих изменений. Общеизвестно, что с возрастом липидный спектр крови меняется существенно, а в критических состояниях это может способствовать формированию системы воспалительных реакций и полиорганной недостаточности [7]. Согласно результатам современных исследований, при различных патологических состояниях, показатели липидного обмена сыворотки крови значительно изменяются. При развитии сепсиса на фоне обширного инфекционного процесса концентрация холестерина, липопротеидов высокой плотности в сыворотке крови резко снижается [8; 10]. Это способствует накоплению холестерина в мембранах лимфоцитов и, как следствие, увеличению микровязкости липидного бислоя, в результате чего реакция лимфоцитов на внешний сигнал снижается. [9]. Активация процессов перекисного окисления липидов, инициированная гиперкатехоламинемией при стрессе, приводит к накоплению гидроперекисей, в результате чего происходит повреждение важнейших регуляторных механизмов жизнедеятельности клетки: нарушаются рецепторная и транспортная функции мембран, контактные свойства клеточных поверхностей [8]. Нарушения со стороны липидного обмена, формирующиеся на высоте интоксикации при генерализации гнойного инфекционного процесса, что можно наблюдать на примере ожоговой болезни, и, соответственно, расстройство функций мембран лимфоцитов влияют на функциональную активность последних и способствуют развитию иммунодефицитных состояний. Это, очевидно, сопровождается изменением подвижности молекул гистосовместимости в плоскости мембраны, снижением экспрессии ИЬЛ-
антигенов на поверхности мембран лимфоцитов, что способствует нарушению процессов распознавания. Клинически это может проявиться в развитии и быстрой генерализации инфекционного процесса [1]. В процессе лечения показатели метаболизма лимфоцитов стремятся к своим физиологическим значениям, что является критерием эффективности проводимой терапии, обратимости патологического состояния и длительности нахождения в пациентов стационаре [1]. В связи с этим задачей исследования явилось выявление структурно-метаболических особенностей лимфоцитов, обусловливающих их функциональные возможности, в зависимости от регуляторных влияний организма и возраста ребенка. Для решения этой задачи в лимфоцитах периферической крови обследованных детей определялся липидный спектр клеток.
Материалы и методы
Исследование проводилось на базе ожогового центра Красноярской краевой клинической больницы. Для реализации поставленной задачи было проведено обследование 140 детей в динамике. У всех детей, вошедших в исследование, на момент получения травмы отсутствовали какие-либо интеркуррентные заболевания. В группу 1 вошли 50 детей с тяжелым ожоговым шоком в возрасте от 1 до 5 лет. В группу 2 были отобраны 30 детей с тяжелым ожоговым шоком в возрасте от 6 до 10 лет. Каждой исследуемой соответствовала контрольная группа из 30 практически здоровых детей, сопоставимых по полу и возрасту.
Дети сравниваемых групп были сопоставимы по факторам, способным влиять на исход травмы: возраст, пол, площадь и глубина поражения кожи, степень тяжести ожогового шока, характер проведения противошоковой терапии. Поскольку определение глубины повреждения кожи и площади ожога в период ожогового шока, учитывая анатомо-физиологические особенности детей, носит малодостоверный и субъективный характер [4; 5], было решено в качестве интегрального критерия тяжести обожженных использовать степень ожогового шока.
Забор крови для исследования у пациентов проводился на первые, седьмые, четырнадцатые и двадцать первые сутки с момента получения травмы, что соответствует основным периодам ожоговой болезни.
Изучение липидного спектра лимфоцитов периферической крови проводилось методом тонкослойной хроматографии. Липидные экстракты из лимфоцитов (4,0-6,0*106 клеток) готовились по J.E. Folch et al. (1957), разгонка фракций проводилась на силуфолевых пластинках UV-254 с последующим их проявлением 5% раствором фосфорномолибденовой кислоты в 96% этаноле. Для определения размеров пиков пластины сканировались на "Chromoscan-200". Идентификация липидных фракций осуществлялась при помощи стандартов фирмы "Sigma", а также по относительной подвижности фракций. Определялись следующие фракции липидов: фосфолипиды (ФЛ), холестерин (ХОЛ), свободные жирные кислоты (СЖК), триацилглицериды (ТАГ), эфиры холестерина (ЭХ); их соотношения (ХОЛ/ФЛ, СЖК/ТАГ).
Статистическая обработка результатов клинических наблюдений выполнена методами вариационной статистики. Данные в тексте и в таблицах приведены в виде среднего значения и стандартной ошибки среднего значения ^±m). Достоверность различий анализировали с помощью t-критерия Стьюдента-Фишера в доверительном интервале более 95% при нормальном распределении вариационного ряда. В случае ненормального распределения вариационного ряда достоверность различий оценивали с помощью непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уитни.
Результаты и обсуждение
Исследование лимфоцитов периферической крови больных детей 1-ой возрастной группы (дети 1 - 5 лет), показало, что развитие ожогового шока сопровождается значительными изменениями липидного спектра клеток, а их направленность отражает как деструктивные процессы, возникающие под влиянием стрессовых воздействий, так и «включение» механизмов защиты клеточных структур (табл. 1).
Уже в течение первых суток после ожоговой травмы в клетках определялось менее высокое, чем в контроле, содержание одного из основных структурных компонентов - суммарных фосфолипидов (р<0,05). Снижалось в этот срок и процентное содержание в лимфоцитах энергетических субстратов липидной природы - триацилглицеридов (ТАГ)(р<0,05). В то же время в лимфоцитах больных содержание было больше, чем у здоровых, холестерина (ХОЛ)(р<0,05), его эфиров (р<0,05) и суммарного холестерина (р<0,001). Кроме этого, определяемые нами показатели свидетельствовали о повышении в клетках процессов липолиза: отмечалось увеличение в клетках свободных жирных кислот (р<0,01) и соотношения СЖК/ТАГ (р<0,001) (рис. 1). Весьма важным, с точки зрения характеристики мембранных структур лимфоцитов, являлось повышение соотношения ХОЛ/ФЛ (р<0,001) (рис. 2), что отражало увеличение относительной доли ХОЛ в клеточных структурах, обеспечивающего их защиту от «пробоя» трансмембранным потенциалом, но одновременно определяющего снижение проницаемости для субстратов метаболизма.
На 7-е сутки течения ожоговой болезни у больных этой возрастной группы сохранялась часть описанных выше перестроек липидного спектра лимфоцитов (табл. 1). Так, оставалось высоким содержание ХОЛ и СЖК, но, в то же время, отмечалась тенденция к нормализации относительного количества ФЛ (р<0,001 по сравнению с показателем 1-го дня), соотношения ХОЛ/ФЛ (р<0,05 - с контролем; р<0,01 - с 1-м днем).
Обращали на себя внимание изменения липидного спектра лимфоцитов детей младшей группы на 14-й день, которые отражали наиболее неблагоприятное функциональное состояние иммунокомпетентных клеток. В этот срок выявлены максимальные за весь срок наблюдения содержание в клетках ХОЛ (р<0,001 по сравнению с контролем), СЖК (р<0,001; соответственно) и соотношение ХОЛ/ФЛ (р<0,001 - с параметром контроля) (рис. 1). На низком уровне определялись показатели ФЛ и ТАГ.
Двадцать первые сутки течения ожоговой болезни характеризовались приближением к уровню показателей контрольной группы многих параметров липидного спектра лимфоцитов больных. В этот срок не отличалось достоверно от контрольных цифр относительное содержание в клетках ХОЛ, ФЛ, СЖК, эфиров ХОЛ. Однако сохранялись выше, чем у здоровых детей соотношения ХОЛ/ФЛ, СЖК/ТАГ и уровень общего холестерина. Относительное количество в лимфоцитах ТАГ оставалось невысоким, не достигая контрольного значения.
При обследовании 2-й группы детей (дети 6 - 10 лет) были выявлены перестройки липидного спектра лимфоцитов (табл. 2), которые, с одной стороны, отражали общие закономерности реагирования клеток на течение ожоговой болезни, с другой стороны, имели проявления, обусловленные, вероятно, онтогенетическими особенностями их функционального состояния. В частности, менее существенными, чем в первой группе больных (дети 1 - 5 лет), отмечались изменения липидного состава клеток на 7 - 14-й дни после ожоговой травмы. Кроме того, у детей старшей группы содержание в клетках ХОЛ, как в контроле, так и во все сроки наблюдения было достоверно выше, чем у детей 1 - 5 лет (р<0,05). Однако, как и в последней группе, на 1-й день определялось более высоким, чем в контроле, содержание в лимфоцитах СЖК (р<0,001), общего холестерина (р<0,001); повышены были и соотношения СЖК/ТАГ (р<0,001) и ХОЛ/ФЛ (р<0,001) (рис. 1 и 2).
В отличие от первой группы больных детей, существенные изменения по сравнению с контрольным уровнем всех определявшихся показателей липидного спектра лимфоцитов у пациентов второй группы, установленные в первый день наблюдения, сохранялись вплоть до 14-х суток течения ожоговой болезни. На 21-й же день исследования установили, что такие из параметров как относительное содержание ФЛ, эфиров ХОЛ и общего ХОЛ достигали показателей здоровых детей. Но количество ХОЛ, СЖК, а также соотношения ХОЛ/ФЛ и СЖК/ТАГ все-таки превышали контрольные значения, а уровень в лимфоцитах ТАГ как и в первой группе детей был ниже контрольного.
Результаты исследования позволяют заключить, что развитие ожоговой болезни у детей сопровождается значительными структурно-метаболическими перестройками лимфоцитов, определяющими функциональные возможности клеток и иммунной системы в целом. Указанные перестройки обусловлены, прежде всего, активацией симпатоадреналовой системы и выбросом стрессовых гормонов, что характерно для стрессовых состояний.
В качестве основных закономерностей структурно-метаболических изменений лимфоцитов больных детей на фоне первых суток ожогового шока установлены следующие:
1) активация процессов липолиза и перекисного окисления липидов, о чем свидетельствует высокое соотношение СЖК/ТАГ и уменьшение количества ФЛ;
2) накопление холестерина в мембранах лимфоцитов как механизм их защиты от интенсивных процессов ПОЛ (высокое соотношение ХОЛ/ФЛ) [2];
3) показатели липидного спектра у большинства больных не достигали контрольного уровня к 21 суткам исследования, хотя регистрировалась статистически значимая тенденция к нормализации.
Основными различиями реагирования лимфоцитов детей разного возраста на ожоговую болезнь явились:
а) на седьмые сутки для большинства показателей липидного обмена лимфоцитов детей 1-й группы отмечалась тенденция к их нормализации, тогда как в клетках старших детей этого не происходило (отсутствие достоверных различий между параметрами 1-го и 7-го дней наблюдения);
б) основные структурные компоненты (ХОЛ, ФЛ) и их соотношение в лимфоцитах больных младшей возрастной группы на 14-й день вновь отражали неблагоприятные изменения липидного спектра клеток, повторяющие те, которые отмечались у детей на «пике» ожогового шока в первые сутки после травмы, но еще более выраженные. У детей же старшей возрастной группы все липидные показатели лимфоцитов на 14-
й день ожоговой болезни оставались на уровне предыдущего срока обследования.
Таким образом, изучение структурно-метаболических параметров лимфоцитов детей разных возрастных групп показало, что их изменения в динамике ожоговой болезни соответствуют известным из литературы основным закономерностям реагирования клеток на состояние функционального напряжения, формирующееся при повышении активности симпатоадреналовой системы [2]. В то же время, наши исследования позволили установить особенности этого реагирования, обусловленные возрастом ребенка, степенью «зрелости» систем его организма. Знание метаболических механизмов развития клеточных реакций на ожоговый шок и ожоговую болезнь позволит не только уточнить элементы патогенеза этих тяжелых состояний, но и обосновать возможность применения метаболической коррекции в комплексном лечении детей с указанной патологией.
Литература:
1. Булыгин Г.В., Казакова Г.В., Каспаров Э.В. Особенности структурнометаболических параметров Т- и В-лимфоцитов здорового человека и при некоторых патологических состояниях. - Красноярск, 1998. - 127 с.
2. Голиков П.П. Рецепторные механизмы антиглюкокортикоидного эффекта при неотложных состояниях. - Москва: Медицина, 2002. С. 21-34, 42-51.
3. Мороз И.Н., Гурина И.Н., Новиков Д.А. Характеристика клеточного и гуморального иммунитета у больных с различными формами астенических расстройств. Иммунология. - 2003. - №4. - С. 238 - 241.
4. Парамонов Б.А., Порембский Я.О., Яблонский В.Г. - СПб.: Спецлит,
2000. - 246-254 с.
5. Пахомов С.П. Хирургия ожогов у детей. - Тверь, 1997. - 207 с.
6. Труфакин, В. А. Циркадные вариации метаболической реакции лимфоцитов крови людей на гормональные стимулы в норме и при разви-
тии иммунодефицита. / В.А. Труфакин, А.В. Шурлыгина // Бюлл. Эксперим. Биол. и Мед. - 1995. - Т. 119, №2. - С. 181 - 183.
7. Щербакова, Л.Н. Спектр липопротеидов в плазме больных, перенесших тяжелую механическую травму / Л.Н. Щербакова, Н.Р. Кравченко-Бережная, А. А. Бессекеев // Анестезиология и реаниматология. - 2002. -№6. - С. 19 - 22
8. Alvarez, C. Lipids, lipoproteins and apoproteins in serum during infection / C. Alvarez, A. Ramos // Clin. Chem. - 1998. - Vol. 42, №1. - P. 142 - 145.
9. Fitzsimons, E.I. Sepsis and clinical chemical changes / E.I. Fitzsimons // Clin. Chem. - 1998. - Vol.43, №6. - P. 1246 - 1275.
10.Gonzalez-Flecha, В. Oxidative stress in muscle and liver of rats with septic syndrome / B. Gonzalez-Flecha, S. Llesuy, P. Evelson // Free. Radic. Biol. Med. - 1999. - Vol. 23, №4. - P. 445 - 451.
Таблица 1
Динамика показателей липидов лимфоцитов детей первой группы с ожоговым шоком тяжелой степени
Показатели липидов лимфоцитов в разное время (сутки)
Контрольная группа 1 1 7 14 21
1 2 3 4 5
ХОЛ, % 14,20±0,57 16,90±0,90 р1<0,05 16,14±1,02 18,76±0,74 р1<0,001 р3<0,05 16,09±0,90 р4<0,05
ФЛ, % 22,09±0,85 16,30±0,77 р1<0,001 20,42±0,61 р2<0,001 16,04±0,62 р1<0,001 р3<0,001 19,83±0,96 р4<0,01
СЖК, % 8,71±0,49 11,89±0,85 р1<0,01 10,64±0,92 12,50±0,84 р1<0,001 10,12±0,49 р4<0,05
ТАГ, % 9,12±0,31 4,70±0,30 р1<0,001 6,16±0,72 р1<0,001 5,71±0,50 р1<0,001 7,02±0,33 р1<0,001 р4<0,05
ЭХ, % 45,89±1,67 50,21±1,22 р1<0,05 46,66±1,35 47,00±1,27 46,94±1,31
Сумм. ХОЛ, % 60,09±1,24 67,11±1,34 р1<0,001 62,79±1,54 р2<0,05 65,75±1,10 р1<0,001 63,02±0,62 р1<0,05 р4<0,05
ХОЛ/ФЛ 0,65±0,01 1,11±0,09 р1<0,001 0,80±0,06 р1<0,05 р2<0,01 1,20±0,06 р1<0,001 р3<0,001 0,82±0,03 р1<0,001 р4<0,001
СЖК/ТАГ 0,96±0,05 2,74±0,27 р1<0,001 2,13±0,25 р1<0,001 2,55±0,24 р1<0,001 1,48±0,07 р1<0,001 р4<0,001
Примечание: р1 - достоверность различий с контролем; р2,з,4 - достоверность различий с показателем соответствующей графы.
Таблица 2
Динамика показателей липидов лимфоцитов детей второй группы с ожоговым шоком тяжелой степени
Показатели липидов лимфоцитов в разное время (сутки)
Контроль 2 1 сутки 7 сутки 14 сутки 21 сутки
1 2 3 4 5
ХОЛ, % 16,50±0,46 22,09±0,93 р1<0,001 21,13±0,93 р1<0,001 21,90±0,88 р1<0,001 18,52±0,66 р1<0,05 р4<0,01
ФЛ, % 25,00±0,76 17,39±0,58 р1<0,001 19,04±0,71 р1<0,001 19,12±1,14 р1<0,001 22,77±1,30 р4<0,05
СЖК, % 8,40±0,46 12,60±0,89 р1<0,001 12,10±0,71 р1<0,001 11,62±0,77 р1<0,001 10,31±0,64 Pl<0,05
ТАГ,% 11,08±0,37 7,80±0,46 р1<0,001 8,31±0,50 р1<0,001 8,00±0,37 р1<0,001 9,03±0,39 р1<0,001
ЭХ,% 39,02±1,21 40,11±1,40 39,43±1,51 39,36±1,30 39,37±1,34
Сумм. ХОЛ, % 55,52±1,02 62,20±1,28 р1<0,001 60,56±1,00 р1<0,001 61,26±1,20 р1<0,001 57,89±1,26
ХОЛ/ФЛ 0,67±0,02 1,29±0,07 р1<0,001 1,12±0,05 р1<0,001 1,20±0,07 р1<0,001 0,85±0,05 р1<0,001 р4<0,001
СЖК/ТАГ 0,77±0,04 1,70±0,17 р1<0,001 1,55±0,15 р1<0,001 1,47±0,09 р1<0,001 1,16±0,07 р1<0,001 р4<0,01
Примечание :рі - достоверность различий с контролем; р2,з,4 - достоверность различий с показателем соответствующей графы.
Рис. 1 Динамика соотношения ХОЛ/ФЛ лимфоцитов.
2,6
2,1
1,6
1,1
0,6
14
21
сутки
1
7
Е31 группа
□ 2 группа S 1 контроль
□ 2 контроль
Рис. 2 Динамика соотношения СЖК/ТАГ лимфоцитов.
