CC BY
18Токсикологический вестник w5 (122)
УДК: 615.9: 611 - 018.53
МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РЕАКЦИИ ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ НА ВОЗДЕЙСТВИЕ ДИОКСИДА СЕРЫ
М.В. Долгушин1, Л.М. Соседова2
!НИИ биофизики ФГБОУ ВПО Ангарской государственной технической академии Министерства образования и науки РФ, 512902, г. Ангарск
2.Ангарский филиал ФГБУ «Восточно-Сибирский научный центр экологии человека» СО РАМН - НИИ медицины труда и экологии человека 665827, г. Ангарск.
Проводили цитохимический анализ лейкоцитов морских свинок, подвергнутых ингаляции диоксидом серы (SO2). Выявлена метаболическая стимуляция нейтрофилов в виде повышения интенсивности реакции на фосфатазы, гликоген и липиды. Вместе с тем в лимфоцитах изменения активности ферментов, отражающих состояние окислительных и гидролитических процессов, имели дифференцированный характер, обнаруживая взаимосвязь со спецификой реагирования лизосом.
Ключевые слова: лейкоциты, метаболизм, ферменты, цитохимия, диоксид серы.
Введение. Исследования общетоксических эффектов диоксида серы (SO2) при биохимическом тестировании плазмы крови, эритроцитов и внутренних органов выявили изменения на уровне различных звеньев неспецифической регуляции, включая процессы повреждения и репарации клеточных мембран [8, 12, 13]. Последствиям влияния SO2 на метаболическое состояние лейкоцитов также уделялось внимание, которое было сфокусировано в основном на оценке окислительных механизмов по параметрам индуцированной и спонтанной продукции активных форм кислорода в экспериментах in vitro, с участием как самого SO2, так и его дериватов (сульфит-ионов) [10, 14-16]. В то же время результаты, полученные в условиях клиники, указывают на выраженную реактивность ферментативных параметров лейкоцитов крови по отношению к техногенным токсическим факторам [2, 4, 17]. В связи с этим комплексное изучение обменных сдвигов в нейтрофилах и лимфоцитах при воздействии SO2, одного из основных компонентов промышленных выбросов, представляется весьма актуальным. Анализ метаболического статуса лейкоцитов позволяет своевременно фиксировать признаки нарушения клеточного гомеостаза при контакте с экотокси-кантами [1, 5]. Очевидно, что эти признаки, способные выступать в роли диагностических маркеров, должны быть достаточно чувствительными, проявляясь в ходе наблюдения за относительно малочисленным контингентом и в сравнительно умеренном режиме экспозиции.
Соответственно целью нашей работы явилась экспериментальная оценка метаболических изменений в лей-
коцитах крови при воздействии диоксида серы.
Материалы и методы исследования. Опыт выполняли на морских свинках, массой 250-350 г, соблюдая «Правила лабораторной практики» (Приказ Минздрава России от 26 августа 2010 года № 708н). Все животные были разделены на две группы - контрольную (п = 10) и опытную (п = 12). Особи из опытной группы подвергались воздействию SO2, продолжительность ингаляции составила 10 дней, в концентрации 24 мг/м3 (в два раза превышающей предельно-допустимый уровень для воздуха рабочей зоны), по 4 часа ежедневно. После прекращения экспозиции у животных забирали образцы крови, готовили мазки, которые были в дальнейшем использованы для определения метаболических параметров цитохимическими методами. При этом оценивали уровень липидов, гликогена и щелочной фосфатазы в нейтрофилах, сукцинатдегидрогеназы (СДГ) и лактат-дегидрогеназы (ЛДГ) в лимфоцитах, кислой фосфатазы (КФ) в нейтрофилах и лимфоцитах [9]. Реакцию на КФ применяли для анализа состояния лизосомальных мембран, выявляя «свободную» активность (после инкубации в течение часа), «общую» активность (после инкубации в течение трех часов) и «связанную» активность (как разницу между «общей» и «свободной») [6, 11]. Возрастание «свободной» активности КФ при параллельном снижении «связанной» считалось показателем дестабилизации мембран лизосом [6]. Результаты оценки цитохимических параметров представляли в условных единицах среднего цитохимического коэффициента по L. Каркго. Кроме того, в лимфоцитах определяли уровень тартратрезистентной КФ (ТРКФ), с использованием
Долгушин Максим Валерьевич ( Dolgushin Maxim Valerievich), НИИ биофизики ФГБОУ ВПО Ангарской государственной технической академии Министерства образования и науки РФ, maxdolg2008@yandex.ru
Соседова Лариса Михайловна (Sosedova Larisa Mikhailovna), Ангарский филиал ФГБУ «Восточно-Сибирский научный центр экологии человека» СО РАМН - НИИ медицины труда и экологии человека, Ангарск, imt@irmail.ru
L-винной кислоты [9], результаты выражали в процентах положительно реагирующих клеток. Достоверность межгрупповых различий в значениях метаболических показателей оценивали по критерию Манна-Уитни.
Результаты и обсуждение. Метаболический ответ лейкоцитов крови, обнаруженный нами после SO2-воздействия, при общем рассмотрении можно было охарактеризовать как адаптивный, учитывая преобладание стимулирующих влияний. Эффект SO2 на нейтрофилы (табл. 1) был связан с возрастанием уровня всех опре-
деляемых параметров, отражая тем самым возможную функциональную мобилизацию различных типов гранул, а также энергетических ресурсов клетки [7]. При этом усиленная цитохимическая реакция на КФ, по всей видимости, имела ферментативную обусловленность, не сопровождаясь дестабилизацией внутриклеточных мембран (табл. 1). В то же время метаболические изменения в лимфоцитах, отмеченные в целом по группе, при первичном рассмотрении, казалось, также не имели отношения к мембраноповреждающему эффекту (табл.
Таблица 1
Метаболические изменения в нейтрофилах морских свинок при воздействии диоксида серы (SO2)
Показатель Контрольная группа Опытная группа
(п=10) (п=12)
Липиды 1,58±0,04 1,82±0,05*
Щелочная фосфатаза (ЩФ) 2,05±0,08 2,43±0,05*
Гликоген 2,06±0,02 2,47±0,06*
Кислая фосфатаза (КФ)
«свободная» 0,33±0,04 0,74±0,05*
«общая» 0,87±0,06 1,29±0,04*
«связанная» 0,54±0,07 0,55±0,06
Примечания. Показана достоверность различий между значениями показателей в контрольной и опытной группах (*-р < 0,01). Все показатели выражены в условных единицах цитохимического индекса.
Таблица 2
Особенности изменения ферментативной активности в лимфоцитах морских свинок
при воздействии диоксида серы (SO2)
Показатель Контрольная группа (п=10) Опытная группа (п=12) Подгруппа 1 опытной группы (п=5) Подгруппа 2 опытной группы (п=7)
СДГ 0,65±0,06 0,89±0,05** 0,68±0,02 1,03±0,03**#
ЛДГ 0,75±0,05 0,55±0,04* 0,54±0,06* 0,56±0,05*
ТРКФ 3,2±0,7 9,1±1,5** 5,0±1,3 11,8±1,3**#
КФ «свободная» 0,54±0,05 0,74±0,03** 0,72±0,03* 0,77±0,04**
КФ «общая» 1,10±0,04 1,13±0,05 0,98±0,06 1,26±0,02**#
КФ «связанная» 0,56±0,06 0,40±0,05 0,26±0,03** 0,52±0,04#
Примечания. Показана достоверность изменений в значениях показателей активности ферментов относительно значений в группе контроля (* - р < 0,05; ** - р < 0,01) и относительно значений в подгруппе 1 (# - р < 0,01). СДГ - сукцинатдегидрогеназа; ЛДГ - лактатдегидрогеназа; ТРКФ - тартратрезистентная кислая фосфатаза; КФ - кислая фосфатаза лизосом. Показатели на СДГ, ЛДГ и КФ выражены в условных единицах среднего цитохимического коэффициента, на ТРКФ -в процентах число положительно реагирующих клеток.
Токсикологический вестник №5 (122)
2). Разнонаправленные сдвиги в активности дегидро-геназ (стимуляция СДГ при параллельном снижении уровня ЛДГ), очевидно, имели отношение к переходу на более экономное расходование субстратов окисления. Кроме того, характер изменения активности гидролитических ферментов (КФ и ТРКФ) вполне можно было считать проявлением функциональной мобилизации лизосом и секреторных органелл, учитывая отсутствие статистически значимого снижения уровня «связанной» КФ и обоснованность трактовки повышенного уровня ТРКФ в качестве одного из признаков активированных лимфоидных клеток [18].
Однако, несмотря на то, что статистически достоверного снижения уровня «связанной» КФ в лимфоцитах животных из опытной группы по сравнению с контролем не происходило, некоторое затруднение в интерпретации полученных данных было вызвано отсутствием повышенной реакции «общей» КФ, поскольку именно совместная стимуляция «общей» и «свободной» КФ указывает на истинную активацию фермента [6]. Вместе с тем значения цитохимической реакции на «связанную» КФ в лимфоцитах только у некоторых животных из опытной группы (п = 5) были ниже контрольных, тогда как у остальных особей (п = 7) они колебались в пределах значений данного показателя из группы контроля. Исходя из этого факта, все особи из опытной группы были разделены на две подгруппы, в зависимости от значений «связанной» КФ в лимфоцитах (табл. 2). В ходе сравнения ферментативного статуса лимфоцитов, имеющих различия в особенностях реагирования лизосом, было выявлено, что активация СДГ, «общей» КФ и вне-лизосомальной ТРКФ имела место только у животных из подгруппы 2, то есть при варьировании показателей «связанной» КФ в пределах контроля. И напротив, в случае положительных результатов теста на дестабилизацию мембран лизосом (в подгруппе 1) признаки метаболической активации клеток не отмечались, при этом сохранение значений «общей» КФ в пределах контроля позволяет объяснить повышение уровня «свободной» КФ практически полностью наличием мембраноповре-ждающего эффекта [6, 11].
В отличие от внутриклеточных реакций, отражающих метаболическую активацию лимфоцитов, ингибирова-ние ЛДГ проявлялось вне зависимости от состояния ли-зосом (табл. 2). По-видимому, сохранение стабильности лизосомальных мембран при снижении интенсивности гликолиза (подгруппа 1) в определенной степени могло быть обусловлено компенсаторным сдвигом, к которому имела отношение стимуляция СДГ Аналогичная взаимосвязь изменений в дегидрогеназной активности и в состоянии лизосомальных мембран лимфоцитов крови ранее обнаруживалась в ходе обследования лиц, подвергавшихся воздействию производственной вибрации. В данных условиях снижение уровня ЛДГ совместно с мембранной дестабилизацией было выявлено при начальных симптомах вибрационной патологии, тогда как реципрокная реакция СДГ и ЛДГ наблюдалась при более продолжительном стаже работы, сопровождаясь
функциональной активацией лизосом [3]. То есть, отмеченные нами различия в ферментативных изменениях лимфоцитов между животными, входящими в подгруппы 1 и 2, могут быть связаны с неодинаковой продолжительностью отдельных фаз метаболического ответа на воздействие SO2. Очевидно, что подобные внутриклеточные сдвиги ввиду своего неспецифичного характера способны отражать индивидуальную чувствительность к целому ряду экотоксикантов, аналогично биохимическим изменениям крови, которые были сходны в общих чертах при контакте организма с SO2 и другими химическими веществами [8].
Заключение. Таким образом, реакция лейкоцитов морских свинок на воздействие диоксида серы в условиях эксперимента проявлялась комплексом статистически значимых обменных сдвигов, имеющих различную внутриклеточную локализацию. При этом на нейтро-филы диоксид серы оказывал общее стимулирующее действие, индуцируя повышение уровня фосфатаз, гликогена и липидов. В то же время ферментативные изменения, затрагивающие состояние окислительных и гидролитических процессов в лимфоцитах, имели дифференцированный характер, обнаруживая взаимосвязь со спецификой реагирования лизосом.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Антошина Л.И., Павловская НА., Устюшин Б.В., Крючкова Е.Н. Изменения биохимических, цитохимических, иммунологических показателей при действии низких уровней никеля на организм человека // Мед. труда и пром. экол., 2001. -
№ 4. - С. 36-38.
2. БикбулатоваА.Н. К проблеме токсико-аллергических состояний при контакте с химическими веществами // Казанск. мед. журнал, 1996. -
№ 6. - С. 411-414.
3. Долгушин М.В. Метаболический статус лимфоцитов периферической крови у рабочих виброопасных профессий // Бюл. Вост.-Сиб. научн. центра СО РАМН, 2004. - № 4. -
С. 90-92.
4. Иванова ЛА. Цитохимия ферментов клеток крови в диагностике, оценке характера течения и эффективности терапии некоторых профессиональных заболеваний // Автореф. Дис. ... докт. мед. наук. - М., 1991. - 47 с.
5. Коленчукова ОА., Савченко АА.
Особенности иммунометаболического статуса у лиц, подверженных воздействию техногенных факторов промышленного производства // Гигиена и санитария, 2011. - № 2. - С. 19-22.
6. Михайлов Г.Т. Использование цитохимического метода выявления кислой фосфатазы для оценки функционального состояния лизосом нейтрофилов // Лаб. дело, 1984. -
№ 8. - С. 468-471.
7. Погорелов В.М., Козинец Г.И., Дягилева О.А., Проценко Д.Д. Цветной атлас клеток системы крови. - М.: Практическая медицина, 2011. -
176 с.
8. Соколов С.М., Юшкова ЛА. Влияние непрерывного воздействия SO2 на некоторые биохимические показатели крыс // Здравоохр. Белоруссии,
1986. - № 5. - С. 37-39.
9. Хейхоу Ф.Г.Дж., Кваглино Д. Гематологическая цитохимия. - М.: Медицина, 1983. - 320 с.
10. Beck-Speier I., Lenz A.G., Godleski J.J. Responses of human neutrophils to sulfite
// J. Toxicol. Environ. Health, 1994. - Vol. 41(3). - P. 285-297.
11. Bitensky L. Lysosomes and the connective tissue diseases // J. Clin. Pathol., 1978. - Vol. 12 (Suppl.). -
P. 105-116.
12. Gümüglü S., Akbaç H., Alicigüzel Y. et al. Effects of sulfur dioxide inhalation on antioxidant enzyme activities in rat erythrocytes // Ind. Health, 1998. -
Vol. 36 (1). - P. 70-73.
13. Gümüglü S., Bilmen S., Korgun D.K. et al. Age-related changes in antioxidant enzyme activities and lipid peroxidation in lungs of sulfur dioxide exposed rats // Free Radic. Res., 2001. - Vol. 34 (6). - P. 621-627.
14. Kienast K., Müller-Quernheim J., Knorst M. et al. In vitro study of human alveolar macrophage and peripheral blood mononuclear cell reactive oxygen-intermediates release induced by sulfur dioxide at different concentrations // Lung, 1994. - Vol. 172 (6). -
P. 335-345.
15. Labbé P., Pelletier M., Omara F.O.,
Girard D. Functional responses of human neutrophils to sodium sulfite (Na2SO3) in vitro // Hum. Exp. Toxicol., 1998. -Vol. 17 (11). - P. 600-605.
16. Mishra A., Dayal N., Beck-Speier I. Effect of sulphite on the oxidative metabolism of human neutrophils: studies with lucigenin- and luminol-dependent chemiluminescence //
J. Biolumin. Chemilumin., 1995. - V. 10 (1). - P. 9-19.
17. Sliwinski Z., HermanowiczA., Kossmann S., HrycekA. Neutrophil function in chemical plant workers employed in the production
of dust pesticides // Pol. J. Occup. Med. Environ. Health, 1991. - Vol. 4 (3). - P. 241-247.
18. Zuzel M., Cawley J.C. Biology of hairy cells // Best Pract. Res. Clin. Haematol., 2003. - Vol. 16 (1). -
P. 1-13.
M.V Dolgushin1, L.M. Sosedova2
Metabolic particularities of blood leukocytes response to sulfUr dioxide exposure
'FSBEI HPE «Institute of Biophysics», Angarsk State Technical Academy, 512901, Angarsk
Research Institute of Occupational Health and Human Ecology, Angarsk Branch of FSBE «East Siberian Scientific Centre for Human Ecology», Siberian branch of the Russian Academy of Medical Sciences, 665827, Angarsk, Russian Federation
A cytochemical analysis of leukocytes in guinea pigs exposed to sulfur dioxide inhalation was performed. The finding of the study was metabolic stimulation of neutrophils in the form of increasing intensity of response to phoshatase, glycogen and lipids . Along with it, changes in lymphocytes enzymes activity reflecting the state of oxidative and hydrolytic processes were of a differentiated character manifesting the interrelation with a lysosomes specific reacting.
Key words: leukocytes, metabolism, enzymes, cytochemistry, sulfur dioxide.
Материал поступил в редакцию 01.08. 2012 г
