CC BY
51
УДК УДК 639.09:615.2 МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ В ПЕЧЕНИ РАДУЖНОЙ ФОРЕЛИ (ONCORHYNCHUS MYKISS WALBAUM), ВАКЦИНИРОВАННОЙ ПРОТИВ ИЕРСИНИОЗА ПМ. Ткаченко1, кандидат биол. наук; И. Грудневская2, кандидат биол. наук
1Кафедра зоологии и физиологии животных, Институт биологии и охра-
UDC 639.09:615.2 THE METABOLIC ALTERATIONS IN THE LIVER OF RAINBOW TROUT (ONCORHYNCHUS MYKISS WALBAUM) AFTER VACCINATION AGAINST YERSINIA RUCKERI Tkachenko G.1, Grudnevska I.2
1 Department of Zoology and Animal Physiology, Institute of Biology and Environmental Protection, Pomeranian University in
Research, Inland Fisheries Institute, Rutki, 83-330 Zukowo, Poland
ны среды, Поморский Университет в Slupsk, Poland2 Department of Salmonid Слупске, Польша2 Отдел исследований лососевых рыб, Института пресноводного рыбного хозяйства, Рутки, 83-330 Жуково, Польша
tkachenko@apsl.edu.pl, jgrudniewska@infish.com.pl Целью данного исследования была The aim of this study was to examine оценка активности метаболических the activity of metabolic enzymes (trans-ферментов (аминотрансфераз, лак- aminases, lactate dehydrogenase) and
татдегидрогеназы) и метаболитов (молочная и пировиноградная кислоты) в печени радужной форели (Oncorhynchus mykiss Walbaum), вакцинированной против иерсинио-за. Оценка показателей интенсивно-
metabolites (lactic and pyruvic acids) in the hepatic tissue of rainbow trout (Onco-rhynchus mykiss Walbaum), vaccinated against yersiniosis. Assessment of metabolism indices suggests that they are associated with an alteration of process-
сти метаболизма свидетельствует о es in the protein catabolism and mobiliza-том, что они связаны с изменением tion of tissue respiration coupled with the
процессов катаболизма белков и мобилизацией тканевого дыхания, сопряженного с окислительным фосфорилированием и гликолизом в печени. Перспективным остается использование ряда изученных маркеров окислительного стресса и метаболических реакций для оценки состояния организма рыб при различных методах иммунизации. Ключевые слова: иммунизация, вакцина, Yersinia ruckeri, метаболизм, печень
oxidative phosphorylation and glycolysis in the liver. Perspective remains the use of an number of studied markers of oxidative stress and metabolic reactions to assess the health state of the fish at different immunization methods.
Key words: immunization, vaccine, Yersinia ruckeri, metabolism, liver
Ежегодно Yersinia ruckeri - грамотрицательная бактерия, вызывающая иерсиниоз («энтерит, сопровождающийся покраснением рта») у рыб лососевых пород? - является причиной больших экономических потерь в индустрии аквакультуры. Однако, несмотря на значимость проблемы, пока мало известно как о механизмах патогенеза этого заболевания, так и о функционировании данного микроорганизма в целом, что препятствует разработке мер для эффективной борьбы с ним [1].
Из всех известных методов профилактики наиболее широкое распространение до последнего времени имело использование антимикробных препаратов как для наружного, так и для внутреннего применения. В последние десятилетия все большее внимание уделяется вакцинации как одному из наиболее эффективных и экологически чистых методов профилактики заболеваний рыб [3, 4].
В последнее десятилетие в отделе патологии рыб Ветеринарного научно-иследо-вательского института в Пулавах (Польша) создана вакцина против иерсиниоза рыб, показавшая высокую степень защиты как в лабораторных, так и производственных испытаниях [4, 5]. Несмотря на полученные положительные результаты, влияние отдельных антигенов и вакцин на физическое состояние рыб, а также специфичность вызываемого ими иммунитета остаются до конца не изученными, а зачастую и неизвестными. Имеющиеся в доступной нам литературе данные в большинстве случаев характеризуют лишь продукцию специфических антител на введение той или иной вакцины и уровень вызываемой ею защиты. Очень важным, на наш взгляд, является изучение эффективности вакцинации на метаболические изменения организма иммунизированных рыб [6].
Одним из критериев оценки биохимического статуса животных является определение активности аминотрансфераз, в частности, аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы, несущих информацию о состоянии белкового обмена у животных и функционального состояния печени [7]. Поэтому целью данного исследования была оценка активности метаболических ферментов (аминотрансфе-раз, лактатдегидрогеназы) и метаболитов (молочная и пировиноградная кислоты) в печени радужной форели (Oncorhynchus mykiss Waibaum), вакцинированной против иерсиниоза.
Материалы и методика исследований. Эксперимент проводили в Отделе исследований лососевых рыб Института пресноводного рыбного хозяйства (Жуково, Польша). Все биохимические анализы проводили на кафедре зоологии и физиологии животных Института биологии и охраны окружающей среды Поморского университета (Слупск, Польша).
Клинически здоровая радужная форель со средней массой тела 107,9±3,1 г была использована в экспериментах. Опыты проводились при температуре воды 14,5±0,5°С и рН 7,5. Уровень растворенного кислорода составлял около 12 ppm с дополнительной подачей кислорода с расходом воды 25 л/мин и фотопериоде 7 часов в день. Форель кормили коммерческой гранулированной диетой.
Рыбы были разделены на две группы - контрольную и вакцинированную. Вакцина против иерсиниоза содержала три инактивированных штамма Yersinia ruckeri, изолированных из радужной форели с клиническими признаками иерсиниоза. Бактерийные изоляты принадлежали к серотипу О1 и показали некоторые различия в их биохимических свойствах. Концентрированная вакцина была инкорпорирована в корм для рыб. Форель иммунизировали per os гранулированным кормом с инакти-вированными антигенами трижды (с интервалом между вакцинацией в один день). Пятнадцать особей радужной форели из каждой группы декапитировали на 31 сутки после иммунизации.
Печень была выделена после декапитации рыб. Буфер изоляции ткани содержал 100 мМ Трис-HCl (рН 7,2). Гомогенаты центрифугировали 15 мин при 3000 об./мин. Белок в пробах определяли методом Брэдфорд (1976). Метаболические изменения оценивали по активности аланин- (АлАТ) и аспартатаминотрансферазы (АсАТ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и содержанию молочной и пировиноградной кислот. Полученные результаты анализировали с помощью пакета программы STATISTICA 10.0 (StatSoft, Poland).
Результаты исследований. Аминотрансферазы, занимающие важное место среди биокатализаторов, играют ключевую роль в обмене веществ, объединяя в единое целое белковый, углеводный, жировой обмен и цикл трикарбоновых кислот Учитывая исключительную роль аминотрансфераз в обмене основных метаболитов клетки, активность этих ферментов используют в качестве биохимического индикатора физиологического статуса и клинического индикатора стрессового состояния, вызванного заболеванием, терапией или интоксикацией у ряда организмов, в том числе и у рыб [7]. В наших исследованиях вакцинация против иерсиниоза сопровождается снижением активности аминотрансфераз (АлАТ - на 28%, р=0,009, АсАТ -на 32%, р=0,006) и лактатдегидрогеназы (на 26%, р=0,008) (рис. 1), что, несомненно, связано с ингибированием процессов катаболизма белков печени [8]. Содержание молочной и пировиноградной кислот в печени радужной форели, иммунизированной вакциной против иерсиниоза, несущественно снизилось в сравнении с контрольной группой рыб (рис. 2).
Как показали данные литературы, патология печени сопровождается постепенным уменьшением активности АсАТ в соответствии со степенью деструкции и жирового перерождения ее клеток [7]. Так, в мозаичной печени активность АсАТ уменьшается на 18%, в анемичной - на 22%, а в анемично-рыхлой - на 75%, что соответствует степени разрушения клеточных мембран и миграции фермента в сыворотку крови [9]. В мозаичной и анемичной печени активность АлАТ, так же как и АсАТ, сохраняет тенденцию к уменьшению, в то время как в анемично-рыхлой печени происходит резкое увеличение активности этого фермента (на 34% по сравнению с нормой). Резкое изменение активности АлАТ и АсАТ в анемично-рыхлой печени, по сравнению с нормальной, связано с изменением молекулярных форм этих ферментов [7].
25
О
Контрольная группа Вакцинированная Контрольная группа Вакцинированная Контрольная группа Вакцинированная рыб группа рыб рыб группа рыб рыб группа рыб
АлАТ ЛгЛТ ЛДГ
Рис. 1. - Активность аланинаминотрансферазы (АлАТ), аспартатаминотранс-феразы (АсАТ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в печени радужной форели, иммунизированной вакциной против иерсиниоза в первый месяц после иммунизации.
* изменения статистически достоверные (р<0,05) между показателями, полученными в контрольной и вакцинированной группах рыб.
Взаимопревращение пирувата в лактат и обратно совершается в организме непрерывно. Интенсивность данной реакции зависит от каталитической активности ферментативных систем, обеспечивающих разнообразные превращения пирувата. Одним из таких ферментов является лактатдегидрогеназа (ЛДГ, 1.1.1.27) - гликолитический фермент, обратимо катализирующий окисление лактата в пируват [10]. Снижение уровня молочной и возрастание пировиноградной кислот сопровождается повышением каталитической активности лактат-дегидрогеназы, которая и катализирует взаимопревращение лактата и пирувата со сдвигом
данной реакции вправо, в сторону образования пировиноградной кислоты [11].
В наших исследованиях на уровень показателей, характеризующих состояние углеводного обмена в организме рыб, несущественное влияние оказывает вакцинация против иер-синиоза (рис. 2). Вакцинация активно влияет на обменные процессы белков со снижением активности ЛДГ. Если учесть, что в вакцинированной группе рыб также снижается активность аминотрансфераз, которые увеличивают пул аминокислот и/или пирувата, то можно говорить о снижении мобилизации энергетических ресурсов для интенсификации метаболизма у вакцинированных рыб в первый месяц после иммунизации. Интересно, что активность аминотрансфераз и ЛДГ, а также содержание лактата и пирувата во втором месяце после иммунизации возвращаются к нормальному уровню и не отличаются от показателей у контрольной группы рыб.
Контрольная Вакцинированная Контрольная Вакцинированная группа рыб группа рыб группа рыб группа рыб
Лактат, мкмоль/мг белка Пируват, нмоль/мг белка
Рис. 2. - Содержание молочной и пировиноградной кислот в печени радужной форели, иммунизированной вакциной против иерсиниоза в первый месяц после иммунизации.
* изменения статистически достоверные (р<0,05) между показателями, полученными в контрольной и вакцинированной группах рыб.
На фоне вакцинации в печени рыб в первый месяц после иммунизации изменяются условия протекания реакций энергообеспечения. Вместе с фосфорилированием на субстратном уровне также в виде высокоэнергетических фосфатов улавливается свободная энергия сгорания глюкозы на путях гликолиза. В наших исследованиях активация процессов гликолиза при вакцинации сопровождается увеличением значения коэффициента лактат/пируват от 1,52 (контрольная группа рыб) до 1,62 (вакцинированная группа рыб).
Выводы. Наше исследование влияния вакцины против иерсиниоза позволило оценить метаболические реакции печени рыб на клеточном уровне организации. Иммунизация рыб в наших исследованиях снижает активность аминотрансфераз и лактатдегидрогеназы, а также содержание лактата и пирувата. Оценка показателей интенсивности метаболизма свидетельствует о том, что они связаны с изменением процессов катаболизма белков и мобилизацией тканевого дыхания, сопряженного с окислительным фосфорилированием и гликолизом в печени рыб. Перспективным остается использование ряда изученных маркеров окислительного стресса и метаболических реакций для оценки состояния организма рыб при различных методах иммунизации.
This study was supported by grant of the Pomeranian University for Young Scientists.
Список литературы:
1. Евгеньева, Т.П. Морфология мышечной ткани русского осетра р. Волги/ Т. П. Евгеньева // Сб. тр. «Осетровое хозяйство». - Астрахань, 1989. - С. 89-90.
2. Рахконен, Р ЗДОРОВАЯ РЫБА/ З. Рахконен, П. Веннерстрем, П. Ринтамяки, Р Каннел и НИИ охотничьего и рыбного хозяйства // Профилактика, диагностика и лечение болезней. - Nykypaino, Helsinki, 2013.
3. Савкин, H.A. Диагностическое значение определения активности некоторых сывороточных ферментов при заболевании печени у животных. Дисс. канд. биол. наук, Ленинград, 1971. - 270 с.
4. Самсонова, М.В. Аланин- и аспартатаминотрансферазы как индикаторы физиологического состояния рыб. Дисс. на соис. науч. степ. канд. биол. наук, 03.00.04 - биохимия. Москва, 2002.
5. Чистюлин, Д.К. Выделение и характеристика порообразующих белков из Yersinia ruckeri. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук, 02.00.10 - Биоорганическая химия, Владивосток, 2014.
6. Chettri J.K., Raida M.K., Kania P.W., Buchmann K. 2012. Differential immune response of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) at early developmental stages (laivae and fry) against the bacterial pathogen Yersinia ruckeri. Dev. Comp. Immunol., 36: 463-474.
7. Ellis A.E. 1988/ A.E. Ellis // Fish vaccination. New York, Academic press. - 255 p.
8. Kozinska A., P^kala A. 2012. Porownanie efektywnosci dwoch autoszczepionek przeciwko jersiniozie u pstr^gow t^czowych (Oncorhynchus mykiss). Komunikaty Rybackie, 5(130): 8-12.
9. Lott J.A., Nemensanszky E. 1987. Lactate dehydrogenase. In: Lott J.A., Wolf P.L., eds. Clinical Enzymology, a Caseoriented Approach. 1987; pp. 213-244.
10. Moss D.W., Henderson A.R. Enzymes. In: Burtis C.A., Ashwood E.R., eds. Tietz Textbook of Clinical Chemistry. 2nd ed. Philadelphia, Saunders Co., 1986; pp. 735-896.
11. P^kala A. 2009. Charakterystyka fenotypowa i genotypowa krajowych izolatow Yersinia ruckeri w aspekcie ich patogennosci dla ryb. Rozprawa doktorska, PlWet-PIB, Pulawy.
УДК 581.19+579.6
АНТИМИКРОБНАЯ АКТИВНОСТЬ СПИРТОВОГО ЭКСТРАКТА ИЗ ЛИСТЬЕВ FICUS DRUPACEA THUNB. (MORACEAE)
Г.М. Ткаченко1, кандидат биол. наук, Л.И. Буюн2, доктор биол. наук, Е.В. Сосновский3, кандидат биол. наук,
A.И. Прокопив34, кандидат биол. наук,
B.И. Гончаренко4, кандидат биол. наук,
З. Осадовский1, доктор биол. наук
1Институт биологии и охраны среды, Поморский Университет в Слупске, Польша
Национальный ботанический сад им. Н.Н.Гришко НАН Украины, Киев, Украина
3Ботанический сад Львовского национального университета имени Ивана Франка, Львов, Украина
4Львовский национальный университет имени Ивана Франка, Львов, Украина
UDC 581.19+579.6 THE ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF THE ETHANOLIC EXTRACT OBTAINED FROM FICUS DRUPACEA THUNB. (MORACEAE) LEAVES Tkachenko G.1, Buyun L.2, Sosnovskyi E.3, Prokopiv A.34, Goncharenko V.4, Osadowski Z.1
11nstitute of Biology and Environmental Protection, Pomeranian University in Slupsk, Poland
2M. Grishko National Botanical Garden, Kiev, Ukraine
3Botanical Garden of Ivan Franko Lvov National University, Lviv, Ukraine 4Ivan Franko Lviv National University, Lvov, Ukraine
tkachenko@apsl.edu.pl
