CC BY
19
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МЕДИЦИНА И КЛИНИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА
УДК 546.172.6-31:616.1/.4
МЕТАБОЛИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА СУБХРОНИЧЕСКОЙ ТОКСИЧНОСТИ ИНГАЛЯЦИЙ ОКСИДА АЗОТА
1,2Мартусевич А. К., 1Соловьева А. Г., Мартусевич А. А., 2Ковалева Л. К.
1 Университетская клиника ФГБОУ ВО «Приволжский исследовательский медицинский университет» Минздрава России, Нижний Новгород, Россия (603155, г. Нижний Новгород, Верхневолжская наб., 18), e-mail: cryst-mart@yandex.ru
2ФГБОУ ВО Кировский ГМУ Минздрава России, Киров, Россия (610021, г. Киров, ул. К. Маркса, 112) 3ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский Нижегородский университет им. Н.И. Лобачевского», Нижний Новгород, Россия (603097, г. Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23)
Целью исследования явилась оценка влияния продолжительного курса ингаляций NO (30 дней) на параметры окислительного и энергетического метаболизма. Экспериментальное исследование было выполнено на 30 крысах-самцах линии Вистар, разделенных на 3 равных по численности группы: контрольную (n=10; животные, которым не выполняли манипуляций) и 2 основные группы (n=10 в каждой), животные которых получали ингаляции газовой смеси, содержащей повышенную концентрацию кислорода (93±3%) или NO (концентрация в газовой смеси - 20 ppm) соответственно. Ингаляционное воздействие проводили ежедневно на протяжении 30 дней (продолжительность манипуляции - 10 мин). Определяли состояние окислительного и энергетического метаболизма крови крыс в динамике воздействия. Установлено, что ингаляции кислорода и оксида азота при длительном применении (30 дней) оказывают неодинаковое влияние на параметры окислительного и энергетического метаболизма крови крыс. Отмечен антиоксидантный эффект, складывающийся из умеренной стимуляции процессов липопероксидации и выраженного увеличения антиоксидантной активности плазмы крови. При этом более выраженное нарастание общей активности антиоксидантов плазмы обнаружено для ингаляций кислорода, тогда как при использовании NO значимым компонентом метаболического ответа является усиление каталитических свойств супероксиддисмутазы эритроцитов. По параметрам энергетического метаболизма более благоприятную реакцию отмечали при проведении ингаляций кислорода, а при воздействии NO регистрировали умеренную активацию обратной реакции фермента.
Ключевые слова: оксид азота, ингаляции, субхроническая токсичность, метаболизм.
METABOLIC ESTIMATION OF SUBCHRONIC TOXICITY OF NITRIC OXIDE INHALATIONS
1,2Martusevich A. K., 1Soloveva A.G., 3Martusevich A.A., 2Kovaleva L. K.
1Privolzhsky Research Medical University, Nizhny Novgorod, Russia (603950, Russia, Nizhny Novgorod, Verhne-Volzhskaya Emb., 18), e-mail: cryst-mart@yandex.ru
2Kirov State Medical University, Kirov, Russia (610021, Russia, Kirov, Karl Marx Street, 112)
3Nizhny Novgorod State University named after N.I. Lobachevsky, Nizhny Novgorod, Russia (603097, Nizhny
Novgorod, Gagarin Av., 23)
The aim of the study was to estimate the effect of a long course of inhalations NO (30 days) on the parameters of oxidative and energy metabolism. The experiment included 30 male Wistar rats. Three groups of animals were formed: a control group (n=10), including animals that did not perform manipulations; and two main groups (n=10 in each). Animals of main groups received inhalations of a gas mixture containing an increased concentration of oxygen (93±3%) or nitric oxide (concentration - 20 ppm), respectively. Inhalations were carried out daily for 30 days (duration - 10 min). The state of oxidative and energy metabolism of rat blood was determined. It is established that inhalations of oxygen and nitric oxide in long-term use (30 days) have a different effect on the parameters of oxidative and energy metabolism of rat blood. The antioxidant effect of moderate stimulation of lipoperoxidation processes and marked increase of antioxidant activity of blood plasma was noted under both factors action. At the same time, a more pronounced increase in the total activity of plasma antioxidants was found for oxygen inhalations, whereas the use of NO significant component of the metabolic response is the strengthening of the catalytic properties of erythrocyte superoxide dismutase. According to the parameters of energy metabolism, a more favorable reaction was noted during the inhalation of oxygen, and when exposed to NO, a moderate activation of the enzyme reverse reaction was registered.
Key words: nitric oxide, inhalations, subchronic toxicity, metabolism.
Введение
В настоящее время имеет место клиническое применение ингаляций монооксида азота в коррекции некоторой кардиореспираторной патологии у детей и взрослых [1-4]. С другой стороны, механизмы действия и потенциальное токсическое влияние при длительном введении соединения не раскрыты.
С учетом того, что монооксид азота является радикальной биомолекулой [5, 6], одним из параметров, требующих мониторинга при продолжительном введении NO, служит состояние окислительного метаболизма крови и тканей. При этом имеются основания говорить о неоднозначном действии различных форм оксида азота на данную группу показателей. Так, для естественной депонированной формы соединения - динитрозильных комплексов железа с различными лигандами - продемонстрировано анти-оксидантное действие в условиях in vitro [7-9] и in vivo [10, 11]. Напротив, для высоких концентраций свободного (газообразного) NO выявлено выраженное прооксидантное действие на фоне угнетения каталитических свойств антиоксидантных ферментов, в первую очередь супероксиддисмутазы и каталазы [7, 12, 13].
В предшествующих публикациях нами показано, что свободный оксид азота оказывает дозозави-симое действие на баланс про- и антиоксидантных систем крови in vitro, причем низкие концентрации обладают лишь умеренным прооксидантным эффектом [7], а высокие - провоцируют развитие окислительного стресса [14]. При проведении десятидневного курса ингаляций низкой концентрацией NO (20 ppm) у здоровых крыс линии Wistar также отмечали невыраженную, но значимую инициацию процессов липопероксидации в плазме крови и эритроцитах, однако эти сдвиги сопровождались превалирующим увеличением каталитической активности суперок-сиддисмутазы эритроцитов [15]. В то же время влияние более продолжительного курса ингаляционного применения NO на параметры окислительного и энергетического метаболизма ранее не оценивалось, в связи с чем это и явилось целью настоящего исследования.
Материал и методы
Экспериментальное исследование было выполнено на 30 крысах-самцах линии Вистар, разделенных на 3 равных по численности группы: контрольную (n=10; животные, которым не выполняли манипуляций) и 2 основные группы (n=10 в каждой), животные которых получали ингаляции газовой смеси, содержащей повышенную концентрацию кислорода (93±3%) или NO (концентрация в газовой смеси - 20 ppm) соответственно. Ингаляционное воздействие проводили ежедневно на притяжении 30 дней (продолжительность манипуляции - 10 мин, скорость подачи газовой смеси в камеру - 2 л/мин). Для осуществления манипуляции крыс (по одной) помещали в эксикатор, в котором производили подачу и отведение газовой смеси.
NO-содержащую воздушную смесь синтезировали с применением генератора, разработанного в Российском федеральном ядерном центре-Всерос-сийском НИИ экспериментальной физики (г. Саров) [16]. Повышенную концентрацию кислорода в газовой смеси создавали с помощью кислородного кон-
центратора «Oxygen Concentrator Jay-5» (Longfian Scitech Co., LTD, Китай).
Выведение крыс из эксперимента проводили на следующий день после завершения полного курса ингаляций путем декапитации под наркозом.
Кровь животных стабилизировали 3,8% водным раствором цитрата натрия (соотношение компонентов - 1:9). Эритроцитарную массу из крови крыс получали путем центрифугирования при 3000 об-1 в течение 10 минут. Эритроциты отмывали изотоническим раствором хлорида натрия трехкратно.
В плазме крови животных всех групп методом Бе2+-индуцированной биохемилюминесценции (аппарат БХЛ-06) изучали состояние про- и антиоксидантных систем. Оценочными параметрами для исследования выступали:
1) светосумма биохемилюминесценции (за 30 сек.), трактуемая как индкатор интенсивности пере-кисного окисления липидов (ПОЛ);
2) тангенс угла наклона кинетической кривой хемилюминесценции (tg 2а), стандартно рассматриваемый как показатель суммарной активности анти-оксидантных систем (АОА).
Кроме того, нами была проведена оценка процессов липопероксидации в эритроцитах, для чего определена их перекисная резистентность (определяется в отмытых эритроцитах методически аналогично величине ПОЛ в плазме крови). Концентрация малонового диальдегида (МДА) в плазме крови и эритроцитах изучена с использованием метода В. Г. Сидор-кина, И. А. Чулошниковой (1993).
Активность супероксиддисмутазы (СОД) оценивали по Т. В. Сироте (1999).
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием программы Statistica 6.0. Нормальность распределения значений параметров оценивали с использованием критерия Шапиро-Уилка. С учетом характера распределения признака для оценки статистической значимости различий применяли Н-критерий Кра-скала-Уоллеса.
Результаты и их обсуждение
В первую очередь необходимо отметить, что продолжительные курсы изучаемых воздействий (по 30 дней) не вызывали изменения поведенческих реакций животных, их отношения к питью и приему корма.
Напротив, основное внимание было уделено оценке метаболического статуса крыс, прежде всего - потенциальному влиянию курсов ингаляций кислорода и NO на метаболические параметры (окислительный и энергетический компоненты) крови животных.
Установлено, что интенсивность процессов ли-попероксидации в плазме крови, определяемая путем биохемилюминесцентного анализа, не отличалась у животных, получавших ингаляции кислорода и оксида азота (риа 1). Данный параметр значимо увеличивался по сравнению с физиологическим уровнем лишь по завершению курса ингаляций кислорода (на 13,4%; p=0,036).
Общая антиоксидантная активность плазмы крови также не демонстрирует межгрупповых различий (риа 2), однако у представителей обеих основных групп она значимо превышает уровень, характерный для интактных крыс (p=0,017 и
р=0,041 для ингаляций кислорода и NO по сравнению с контрольной группой соответственно). Указанная благоприятная тенденция может быть обусловлена улучшением оксигенации крови, происходящим за счет кислородного компонента газовых смесей. На это дополнительно указывает большая выраженность увеличения параметра после курса ингаляций обогащенной кислородом воздушной смеси по сравнению с NO-содержащей (p=0,044).
Влияние ингаляций оксида азота и кислорода на состояние перекисного окисления липидов также оценивали по динамике концентрации малонового диальдегида в плазме крови и эритроцитах (риа 3). Выявлено, что плазменный уровень соединения повышается лишь в незначительной и практически равной степени при изучаемых воздействиях (на 16 и 21% для ингаляций кислорода и оксида азота соответственно; p=0,038 и р=0,030 для указанных случаев). В то же время эритроцитарная концентрация малонового диальдегида демонстрирует разнонаправленные изменения. Так, проведение курса ингаляций воздушной смеси с повышенным содержанием кислорода обеспечивает повышение значения параметра на 22% относительно животных контрольной группы (p=0,027). С другой стороны, продолжительное использование газообразного оксида азота приводит к снижению уровня показателя на 28% (p=0,040).
С учетом того, что оксид азота способен оказывать влияние на внутри-и внеклеточную супероксиддисмутазу [17, 18], был выполнен анализ активности фермента в эритроцитах (риа 4). Установлено, что ингаляции обогащенной кислородом воздушной смеси не изменяют уровень данного параметра, о чем свидетельствует отсутствие различий со значениями, характерными для здоровых животных (p>0,05). Напротив, проведение курса ингаляций низкой дозы оксида азота существенно усиливает каталитические свойства су-пероксиддисмутазы (на 64% относительно контрольного уровня; p=0,008). Это подтверждает ранее высказанное нами предположение о стимулирующей активности свободного NO в отношении данного энзима, обнаруженное в условиях in vitro [7], а также результаты, полученные другими исследователями [18, 19].
Также неодинаковое влияние изучаемых вариантов ингаляционного воздействия было зафиксировано для энергетического метаболизма (риа 5 и 6). Выявлено, что применение оксигени-рованной воздушной смеси приводило к активации как прямой, так и обратной
Рис. 1. Интенсивность липопероксидации в плазме крови крыс при ингаляциях воздушной смеси с повышенных содержанием кислорода и оксида азота (значения представлены в % от уровня
интактных животных, принятого за 100%; * - статистическая значимость различий с уровнем контрольной группы р<0,05)
Рис. 2. Общая антиоксидантная активность плазмы кроен крыс после курса ингаляций (значения представлены в % от уровня интактных животных, принятого за 100%; * - статистическая значимость различий с уровнем интактной группы р<0,05)
140 120 100
SO 60
2
f- 20
□ пнгапяцгш О: ■ ингаляции NO
МДАпл
МДАэр
Рис. 3. Концентрация малонового диалъдегида в плазме крови (МДАпл) и эритроцитах (МДАэр) крыс при ингаляциях кислорода и оксида азота (значения представлены в % от уровня
интактных животных, принятого за 100%; * - статистическая значимость различий с уровнем контрольной группы р<0,05)
Рис. 4. Активность супероксиддисмутазы эритроцитов при ингаляциях кислорода и NO (значения представлены в % от уровня интактных животных, принятого за 100%; * - статистическая значимость различий с уровнем контрольной группы р<0,05)
Рис. 5. Активность лактатдегидрогеназы эритроцитов крыс в прямой (ЛДГпр) и обратной (ЛДГобр) реакциях при ингаляциях кислорода и N0 (значения представлены в % от уровня интактных животных, принятого за 100%; * - статистическая значимость различий с уровнем контрольной группы р<0,05)
180 160 140 120 100 80 60 40 20 0
□ ингаляции 02
□ ингаляции NO
эритроциты
Рис. 6. Уровень лактата в плазме и эритроцитах крыс при ингаляциях кислорода и N0 (значения представлены в % от уровня интактных животных, принятого за 100%; * - статистическая значимость различий с уровнем контрольной группы р<0,05)
реакции лактатдегидрогеназы (риа 5), причем преобладала более оптимальная первая реакция (+б 1,5% vs +25,4% по сравнению с интактными животными соответственно; p=0,012 и р=0,024 для обоих случаев). При ингаляциях NO регистрировали лишь умеренную инициацию обратной реакции фермента (на 14,5%; p=0,042 по отношению к интактным животным).
В то же время уровень лактата в плазме крови и эритроцитах возрастал как при ингаляциях кислород-насыщенной воздушной смеси, так и при введении оксида азота практически в равной степени (p<0,05 для всех воздействий). Эта тенденция также может быть обусловлена стимуляцией каталитических свойств фермента.
Заключение
Проведенные исследования позволили установить, что ингаляции кислорода и оксида азота при длительном применении (30 дней) оказывают неодинаковое влияние на параметры окислительного и энергетического метаболизма крови крыс. При этом для обоих воздействий отмечен антиоксидантный эффект, складывающийся из умеренной стимуляции процессов липопероксида-ции и выраженного увеличения анти-оксидантной активности плазмы крови. В то же время механизмы его реализации для изучаемых факторов различны: более выраженное нарастание общей активности антиоксидантов плазмы обнаружено для ингаляций кислорода, тогда как при использовании NO значимым компонентом метаболического ответа является усиление каталитических свойств супероксиддисмутазы эритроцитов.
По параметрам энергетического метаболизма более благоприятную реакцию, включающую превалирующую активацию прямой реакции лактатде-гидрогеназы эритроцитов, отмечали при проведении ингаляций кислорода. При воздействии оксида азота регистрировали лишь умеренную активацию обратной реакции фермента. Также при обоих воздействиях обнаруживали незначительное нарастание уровня лактата.
Литература/References
1. Gries A., Bode C., Peter K. et al. Inhaled nitric oxide inhibits human platelet aggregation, p-selectin expression, and fibrinogen binding in vitro and in vivo. Circulation. 1998;97:1481-1487.
2. Kumar P. et al. Use of inhaled nitric oxide in preterm infants Pediatrics. 2014;133(1):1б4-170.
3. Mathisen D. J., Kuo E. Y., Hahn C. et al. Inhaled nitric oxide for adult respiratory distress
syndrome after pulmonary resection The Annals of Thoracic Surgery. 1998;66:1894-1902.
4. Ricciardi M. J., Knight B.P., Martinez F. J., Rubenfire M. Inhaled nitric oxide in primary hypertension: A safe and effective agent for predicting response to nifedipine Journal of the American College of Cardiology. 1998;32:1068-1073.
5. Костюк В.А., Потапович А.И. Биорадикалы и биоантиоксиданты. Минск: БГУ, 2004. [Kostyuk V.A., Potapovich A. I. Bioradikaly i bioantioksidanty Minsk: BGU, 2004. (in Russ.)]
6. Gryglewsky R. J., Minuz P. Nitric Oxide. Basic Research and Clinical Application, Amsterdam, Berlin, Oxford, Tokyo, Washington: IOS Press, 2001.
7. Мартусевич А. К., Соловьева А. Г., Перетягин С. П., Ванин А. Ф. Сравнительный анализ действия свободного и депонированного NO на состояние про- и антиоксидантных систем крови // Биофизика. 2015. Т. 60, № 2. С. 348-354. [Martusevich A. K., Soloveva A. G., Peretyagin S. P., Vanin A.F. Comparative analysis of action of free and bound nitric oxide on state of pro- and antioxidant systems of the blood. Biofizika. 2015;60(2):348-54. (in Russ.).]
8. Shumaev K. B., Gubkin A.A., Serezhenkov V. A. et al. Interaction of reactive oxygen and nitrogen species with albumin- and methemoglobin-bound dinitrosyl iron complexes Nitric Oxide Biol. Chem. 2008;18:37-46.
9. Vanin A. F. Dinitrosyl-iron complexes with thiolate ligands: physico-chemistry, biochemistry and physiology Nitric Oxide Biol. Chem. 2009;21:136-149.
10. Ванин А. Ф., Писаренко О. И., Студнева И.М. и др. Действие динитрозильного комплекса железа на метаболизм и клеточные мембраны ишемизированного сердца крысы // Кардиология. 2009. № 12. С. 43-49. [Vanin A. F., Pisarenko O. I., Studneva O. M. et al. Action of dinitrosyl iron complex on metabolism and cell membranes of ischemized heart of the rat. Kardiologiya. 2009;12:43-49. (in Russ.).]
11. Мартусевич А. К., Соловьева А. Г., Перетягин С. П., Давыдюк А. В. Влияние динитрозильных комплексов железа на метаболические параметры крови животных с экспериментальной термической травмой // Биофизика. 2014. Т. 59, № 6. С. 1173-1179.[Martusevich A.K., Soloveva A. G., Peretyagin S. P., Davyduk A. V. Influence of dinitrosyl iron
complexes of the animals with experimental thermal trauma. Biofizika. 2014;59(6):1173-1179. (in Russ.).]
12. Kalyanaraman B. Teaching the basics of redox biology to medical and graduate students: oxidants, antioxidants and disease mechanisms Redox biology. 2013;1:244-257.
13. Van der Vliet A. et al. Formation of reactive nitrogen species during peroxidase-catalyzed oxidation of nitrite. A potential additional mechanism of nitric oxide-dependent toxicity J. Biol. Chem. 1997;272:7617-7625.
14. Мартусевич А. К., Соловьева А. Г., Перетягин С. П., Плеханова А. Д. Изучение биологических эффектов высоких доз газообразного оксида азота in vitro // Биорадикалы и антиоксиданты. 2014. Т. 1, № 1. С. 34-46. [Martusevich A. K., Soloveva A. G., Peretyagin S.P., Plekhanova A.D. Investigation of biological effects of high doses of gaseous nitric oxide in vitro. Bioradikaly i antioxidanty. 2014;1(1):34-46. (in Russ.).]
15. Мартусевич А. К., Соловьева А. Г., Аших-мин С. П., Перетягин С. П. Влияние ингаляций оксида азота на состояние окислительного и энергетического метаболизма крови крыс // Российский физиологический журнал им. И. М. Сеченова. 2015. Т. 101, № 2. С. 180188. [Martusevich A.K., Soloveva A. G., Ashikhmin S.P., Peretyagin S. P. Influence of nitric oxide inhalations on state of oxidative and energy metabolism of rats blood. Rossiyskiy zhurnal im. I.M. Sechenova. 2015;101(2):180-188. (in Russ.).]
16. Карелин В. И., Буранов С. Н., Пименов О. А. и др. Плазмохимическая установка для NO-терапии // Медиаль. 2013. № 4. С. 46.[ Karelin V. I., Buranov S.N., Pimenov O.A. et al. Plasmochemical device for NO-therapy. Medial. 2013;4:46. (in Russ.).]
17. Fukai T., Siegfred M.R., Ushio-Fukai M. et al. Regulation of the vascular extracellular superoxide dismutase by nitric oxide and exercise training J. Clin. Invest. 2000;105:1631-1639.
18. Fukai T., Ushio-Fukai M. Superoxide вismutases: role in redox signaling, vascular function, and diseases Antioxid. Redox Signal. 2011;15(6):1583-1606.
19. Garcia-Pascual A., Labadia A., Costa G., Triguero D. Effects of superoxide anion generators and thiol modulators on nitrergic transmission and relaxation to exogenous nitric oxide in the sheep urethra Br. J. Pharmacol. 2000;129:53-62.
УДК 611.844/.846:616-073.7
О СОВРЕМЕННЫХ МЕТОДАХ ПРИЖИЗНЕННОЙ ВИЗУАЛИЗАЦИИ ГЛАЗНОГО ЯБЛОКА И ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ СТРУКТУР ГЛАЗА В ПРЕНАТАЛЬНОМ ПЕРИОДЕ ОНТОГЕНЕЗА
Найденова С. И., Луцай Е. Д., Астафьев И. В.
ФГБОУ ВО Оренбургский государственный медицинский университет Минздрава России, Оренбург, Россия (460000, г. Оренбург, ул. Советская, 6), e-mail: orgma@esoo.ru
В обзорной статье проведено обобщение данных о возможностях прижизненной визуализации глазного яблока и вспомогательных структур глаза. Современные методы прижизненной визуализации очень разнообразны и позволяют изучить все анатомические структуры органа зрения в мельчайших подробностях. В то же время к исследованию органа зрения у плода существуют противопоказания, что значительно сужает ряд методов. Некоторые методы просто не применимы в пренатальном периоде онтогенеза. Все методы исследования органа зрения у плода затратны и не проводятся без показаний. В то же время рост патологии органа зрения требует от современной медицины разработки адекватных способов профилактики и лечения, одним из которых является микрохирургическое вмешательство. Сопоставление данных, полученных при прижизненной визуализации и при секционном исследовании, может позволить существенно расширить методы, подходящие для применения в фетальной хирургии.
Ключевые слова: прижизненная визуализация, глазное яблоко и вспомогательные структуры глаза, пренаталь-ный период онтогенеза, фетальная хирургия.
