CC BY
54
© МАТУСЕВИЧ Е.А., КОСИНЕЦ В.А., 2015
МЕТАБОЛИЧЕСКАЯ КОРРЕКЦИЯ ВНУТРИПЕЧЕНОЧНОГО ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ОТВЕТА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ РАСПРОСТРАНЕННОМ ГНОЙНОМ ПЕРИТОНИТЕ
МАТУСЕВИЧ Е.А., КОСИНЕЦ В.А.
УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет», Республика Беларусь
Резюме.
Цель работы - изучить в динамике экспрессию МАС387 - маркера воспалительного ответа в печени при экспериментальном распространенном гнойном перитоните и возможности ее коррекции лекарственными средствами метаболического типа действия.
Материал и методы. Эксперимент выполнен на 55 кроликах породы шиншилла. Распространенный гнойный перитонит моделировали путем введения в брюшную полость аэробно-анаэробной смеси E.coli и B.fragilis. Через 6 часов после заражения выполняли хирургическое лечение и в послеоперационном периоде в течение 5-и суток применяли препараты Цитофлавин или Неотон. Животных выводили из эксперимента и производили забор материала (участки печени) через 6 часов после инициации перитонита, а также на 1-е, 3-и и 5-е сутки после операции. После фиксации и стандартной гистологической проводки готовили серийные срезы. Иммуногистохимическое окрашивание проводили с использованием антител к макрофагам Anti-Macrophage antibody MAC387(ab49408, «Abcam»). Для анализа изображений использовали компьютерную систему с цифровой камерой и лицензионным программным обеспечением, с помощью которого оценивали выраженность экспрессии иммуногистохимического маркера MAC387(ab49408).
Результаты. МАС387-позитивные макрофаги обнаруживаются в печени как в норме, так и при экспериментальном гнойном перитоните, причем при перитоните уровень экспрессии маркера внутрипеченочного воспаления МАС387 значительно возрастает. Данный механизм, возможно, является предиктором дальнейшего развития деструктивных процессов в печени с нарушением ее функции, а также системного воспаления и полиорганной недостаточности. Препарат, содержащий янтарную кислоту, Цитофлавин, по сравнению с препаратом креатинфосфата Неотон, более эффективно снижает уровень экспрессии МАС387+ клеток в печени.
Заключение. Применение Цитофлавина в послеоперационном периоде экспериментального распространенного гнойного перитонита позволяет корригировать интенсивность внутрипеченочного воспалительного клеточно-опосредованного ответа, способствует уменьшению степени альтерации ткани печени и оказывает цитопротекторный эффект.
Ключевые слова: экспериментальный распространенный гнойный перитонит, МАС387+ макрофаги, цитофлавин, неотон, коррекция, внутрипеченочный воспалительный ответ.
Abstract.
Objectives. To study the dynamics of expression of MAC387 - a marker of the inflammatory response in the liver in experimental generalized purulent peritonitis and the possibility of its correction with drugs of the metabolic type of action.
Material and methods. Experiment was conducted on 55 rabbits of the chinchilla breed. Generalized purulent peritonitis was modelled by the introduction into the abdominal cavity of the aerobic and anaerobic mixture of E.coli and B.fragilis. In 6 hours after the infection surgical treatment was carried out and in the postoperative period during 5 days the preparations Citoflavin or Neoton were used. The animals were taken from the experiment and the material (liver sections) was extracted in 6 hours after the initiation of peritonitis and also on the 1st, 3rd and 5th day after the surgery. After fixing and standard histological wiring serial sections were prepared. Immunohistochemical staining was performed using antibodies to macrophages Anti-Macrophage antibody MAC387 (ab49408, «Abcam»). Image analysis was made with the use of a computer system with a digital camera and licensed software
by means of which the level of expression of immunohistochemical marker MAC387 (ab49408) was evaluated. Results. MAC387-positive macrophages are detected in the liver both in the norm and in experimental purulent peritonitis, in peritonitis the expression level of MAС387 marker of the intrahepatic inflammation increasing significantly. This mechanism may be a predictor of further development of destructive processes in the liver with the disturbance of its function, as well as systemic inflammation and multiple organ failure. The preparation containing succinic acid Citoflavin, in comparison with the creatine phosphate drug Neoton, more effectively reduces the level of expression of MAС387+ cells in the liver.
Conclusion. Citoflavin application in the postoperative period of experimental generalized purulent peritonitis enables the correction of the intensity of the intrahepatic inflammatory cell-mediated response, reduces the degree of the liver tissue alteration and exerts the cytoprotective effect.
Key words: experimental generalized purulent peritonitis, MAC387+ macrophages, citoflavin, neoton, correction, intrahepatic inflammatory response.
Проблема лечения перитонита не утратила своей актуальности и по-прежнему является одним из важнейших направлений в современной абдоминальной хирургии. Высокий уровень летальности при данном заболевании обусловлен патологическими изменениями в организме и полиорганной недостаточностью [1, 2]. Ведущим патогенетическим звеном развития ПОН является системное воспаление, возникающее при срыве местных защитных механизмов и проникновении инфекционного агента в системный кровоток [3]. Первым органом, стоящим на пути гематогенного распространения инфекции из брюшной полости по портальной системе, выступает печень. Это важнейший барьерный и детоксикационный центр в организме, который препятствует росту эндогенной интоксикации, развитию системного воспаления и полиорганной дисфункции при распространенном гнойном перитоните [4].
Первой линией неспецифической защиты выступают клетки системы мононуклеар-ных фагоцитов (Купферовские резидуальные клетки печени и МАС387-позитивные моноциты-макрофаги) [4]. МАС387+ клетки - это активированные «проникающие» макрофаги, рекрутированные из моноцитов крови в печеночную ткань [4, 5]. МАС387-позитивные клетки являются маркером активности внутрипеченочного неспецифического воспалительного ответа и определяют его интенсивность [6]. При их гиперактивации наблюдается повреждение печеночной ткани вследствие секреции большого количества провоспалительных цитокинов, хемокинов, а также привлечения в зону воспаления цитотоксических лимфоцитов и естественных киллеров [5-8]. Деструктивные изменения гепатоцитов при-
водят к прогрессированию эндотоксикоза и усугублению полиорганной дисфункции [5, 9].
В этой связи является актуальным изучение экспрессии МАС387 в ткани печени при экспериментальном распространенном гнойном перитоните и возможности влияния на интенсивность внутрипеченочного воспаления лекарственными средствами метаболического типа действия.
Цель работы - изучить в динамике экспрессию МАС387 - маркера воспалительного ответа в печени при экспериментальном распространенном гнойном перитоните и возможности ее коррекции лекарственными средствами метаболического типа действия.
Материалы и методы
Исследование выполнено на 55 кроликах породы шиншилла, которые были разделены на следующие группы: интактные (n=5); с распространенным гнойным перитонитом без хирургического лечения (n=5); контрольная группа - хирургическое лечение перитонита без применения в послеоперационном периоде лекарственных средств (n=15); основная группа, хирургическое лечение перитонита с применением в послеоперационном периоде в течение 5-и суток препаратов: «Цитофлавин» внутривенно из расчета 28,5 мг янтарной кислоты на 1 кг массы животного (n=15); «Неотон» внутривенно из расчета 0,05 г на 1 кг массы животного (n=15).
Животные содержались в виварии в одинаковых условиях, на стандартном пищевом рационе в соответствии с международными правилами GLP. Карантинный режим животных составлял не менее 14 дней. Все
манипуляции с животными проводились в соответствии с постановлением Министерства здравоохранения Республики Беларусь № 131 от 13.10.2006 г. «Санитарные правила и нормы 2.1.2.12-18-2006 «Устройство, оборудование и содержание экспериментально-биологических клиник (вивариев)», Конвенцией по защите животных, используемых в эксперименте и других научных целях (принятой Советом Европы в 1986 г.) и Директивой Совета 86/609/ ЕЕС от 24.11.86 по согласованию законов, правил и административных распоряжений стран - участниц в отношении защиты животных, используемых в экспериментальных и других научных целях.
Для моделирования перитонита использовали микробную смесь, состоящую из равных количеств аэробов (E.coli, штамм 0111 К58 НИ С 130-53) и анаэробов (B.Fragilis, штамм 323). Микробную смесь вводили в брюшную полость животных стерильным шприцем из расчета 6 млрд. микробных тел на 1 кг массы кролика. Количество микробных тел рассчитывали по стандарту мутности McFarland.
Через 6 часов после введения микроорганизмов у всех животных развивались симптомы перитонита: вялость, заторможенность, отказ от пищи, учащенное дыхание, вздутие живота. В основной и контрольной группах животных через 6 часов после заражения под внутривенным нембуталовым наркозом (30 мг/кг) плюс местная анестезия 50 мл 0,25%-ого раствора новокаина выполняли оперативное вмешательство: срединная лапаротомия, удаление гнойно-геморрагического выпота, промывание брюшной полости 0,02%-ым раствором хлоргексидина биглюконата; интубация тонкой кишки перфорированной полихлорвиниловой трубкой; декомпрессия и промывание тонкой кишки физиологическим раствором до светлых вод; наложение подвесной цекостомы.
Непосредственно после операции и через каждые 8 часов в течение первых 2-3-х суток проводили промывание тонкой кишки физиологическим раствором в объеме 40-60 мл на одну процедуру. Дренажную трубку удаляли из просвета тонкой кишки на 3-и сутки после операции.
Животных с распространенным гнойным перитонитом выводили из эксперимента (летальная доза нембутала) и производили забор материала через 6 часов после заражения
(10 животных), основной и контрольной групп - на 1-е, 3-и и 5-е сутки после операции (по 5 животных в исследуемые сроки). За норму были приняты результаты исследований, проведенных у 5 интактных (здоровых) кроликов.
Материалом для иммуногистохимического исследования служили участки печени кроликов с распространенным экспериментальным гнойным перитонитом. Всего было отобрано 55 образцов печени.
После фиксации в 10%-ом растворе нейтрального забуференного формалина и стандартной гистологической проводки готовили серийные срезы. Иммуногистохимическое окрашивание проводили с использованием антител к макрофагам Anti-Macrophage antibody [MAC387]-ab49408 («Abcam», Великобритания) с разведением 1:100.
В качестве визуализирующей системы использовали Bond Polymer Refine Detection (Leica, Великобретания), включающую комплекс вторичных антител, диаминобензин (ДАБ) в качестве хромогена и гематоксилин для докрашивания препаратов. Иммуногистохимическое окрашивание препаратов проводили с использованием роботизированной станции по иммуногистохимическому окрашиванию препаратов BondTM - MAX ProcessingModule (производства BiosystemsMelbournePtyLtd, Австралия) с использованием протоколов окрашивания и рекомендаций Leica. После автоматизированного окрашивания препараты промывали под проточной водой, проводили обезвоживание в спирте и просветление препаратов в карбол-ксилоле и ксилоле. Затем срезы заключали в среду «Biomount» и накрывали покровным стеклом. Иммуногистохимическое окрашивание оценивали по характеру экспрессии ИГХ маркера MAC387 (ab49408) (табл. 1).
Для анализа изображений использовали компьютерную систему (микроскоп Leica DM 2000 с цифровой камерой и лицензионной программой Leica Application Suite, version 3.6.0).
При исследовании срезов печени, окрашенных антителами к МАС387-позитивным макрофагам, при увеличении микроскопа х100 определяли места с наиболее выраженной экспрессией маркера. Затем, используя генератор случайных чисел, производили выборку 10 полей зрения, которые в дальнейшем подлежали количественной оценке. При увеличении х400
Таблица 1 - Характер экспрессии МАС387 в печени
ИГХ маркер (клон) Характер экспрессии
MAC387 (ab49408) (MRP-14) Мелкогранулярное или гомогенное цитоплазматическое и мембранное окрашивание МАС387+-макрофагов в коричневый цвет различной интенсивности (от светло- до темно-коричневого)
производили цифровые фотографии в 10 полях зрения. Фотографирование гистопрепаратов проводили в одинаковых условиях. Дальнейшую обработку цифровых изображений проводили с использованием лицензионной программы WCIF ImageJ 1.45s. С помощью данного программного обеспечения количественно оценивали интенсивность иммуногистохимического окрашивания препаратов. Для этого выраженность экспрессии маркеров рассчитывали по формуле:
ИЭ
кол-во
позитивных
клеток
общая площадь
х площадь позитивных клеток
х100%,
где ИЭ - интенсивность экспрессии маркера МАС387 в ткани печени.
Визуальная оценка выраженности экспрессии проводилась на мониторе LG FLATRON 22EN33S-BA в условиях одинаковых настроек параметров и разрешения экрана.
Статистическая обработка данных проведена в соответствии с требованиями, предъявляемыми к исследованиям в области
медицины с использованием электронных пакетов анализа «STATISTICA 6.0», «MedCalc 10.2.0.0» и «MS Excel». Для оценки данных применены методы непараметрической (расчет медианы (Ме), доверительного интервала для медианы с вероятностью 95%, размаха минимальных и максимальных значений (размах min-max), межквартильного интервала (2575 процентиль), критериев Wilcoxon, Mann-Whitney (уровень достоверности р<0,05)) статистики.
Результаты
Проведена морфометрическая оценка выраженности экспрессии маркера МАС387 в ткани печени. Распределение образцов по группам и выраженность экспрессии МАС387 в каждой из групп экспериментальных животных представлена в таблице 2.
Иммуногистохимическое исследование МАС387+ макрофагов показало их присутствие в печени как при экспериментальном перитоните, так и в образцах без патологии (рис.
1). Однако уже через 6 часов после моделирования перитонита происходило резкое увели-
А
Б
Рисунок 1 - Экспрессия МАС387 в паренхиме печени интактных животных (А), при 6-часовом экспериментальном распространенном гнойном перитоните (Б). Окраска Anti-Macrophage antibody [MAC387]-ab49408. Увеличение х400.
Таблица 2 - Динамика экспрессии МАС387-позитивных макрофагов печени при экспериментальном гнойном перитоните и на фоне применения метаболической иммунокоррекции
Группа МАС-387+ клетки, отн.ед.
Медиана, % Размах (Min-Max), % 95%ДИ для медианы, % 25-75 процентиль, %
Норма (n=5) 0,043 0-0,154 0,024-0,054 0,027-0,052
6-часовой перитонит (n=5) 0,138 р1<0,0001 0,029-0,508 0,117- 0,235 0,116-0,241
Контрольная (n=15) 1-е сутки (n=5) 0,185 р1<0,0001 0,024-2,361 0,061-0,334 0,063-0,324
3-и сутки (n=5) 0,357 р1<0,0001 р2=0,011 0,013-1,785 0,256-0,420 0,248-0,436
5-е сутки (n=5) 0,298 р1<0,0001 0,076-1,154 0,1622-0,366 0,162-0,363
С применением препарата Неотон (n=15) 1-е сутки (n=5) 0,105 р1=0,015 0,035-0,594 0,052-0,290 0,056-0,258
3-и сутки (n=5) 0,321 р1<0,0001 р2=0,013 0,049-1,560 0,215-0,484 0,259-0,498
5-е сутки (n=5) 0,359 р1<0,0001 р2=0,027 0,102-0,968 0,195-0,450 0,195-0,453
С применением препарата Цитофлавин (n=15) 1-е сутки (n=5) 0,096 р1=0,0004 0,016-0,370 0,070-0,134 0,067-0,161
3-и сутки (n=5) 0,084 р1=0,0136 р3<0,0001 р4=0,001 0,025-0,166 0,039-0,109 0,042-0,108
5-е сутки (n=5) 0,068 р1=0,017 р3<0,0001 р4<0,0001 0,016-0,213 0,048-0,128 0,048-0,127
Примечание: р1-статистически значимо по сравнению с нормой; р2-статистически значимо по сравнению с предыдущими сутками данной группы; р3-статистически значимо по сравнению с аналогичными сутками контрольной группы; р4- статистически значимо по сравнению с аналогичными сутками группы с применением препарата Неотон.
чение количества реактивных макрофагов с 0,043 (Ме) до 0,138 (Ме, р1<0,0001), причем на
1-е сутки после операции данный показатель достигал 0,185 (Ме, р1<0,0001), достоверно отличаясь от нормальных значений.
В контрольной группе на 3-и сутки послеоперационного периода активность внутрипеченочного воспаления продолжала нарастать, что проявлялось повышением экспрессии реактивных макрофагов до 0,357 (Ме, р1<0,0001) (рис. 2).
На 5-е сутки после операции экспрессия МАС387+ макрофагов составила 0,298 (Ме, р 1 <0,0001), статистически значимо от-
личаясь от нормальных значений в 6,93 раза
(рис. 3).
В группе животных, получавших Неотон, наблюдались аналогичные изменения экспрессии маркера внутрипеченочного воспаления МАС387. На 1-е сутки после операции данный показатель составил 0,105 (Ме, р 1 =0,015) и не отличался от группы контроля. В дальнейшем наблюдалось увеличение экспрессии МАС387-позитивных макрофагов от 0,321 (Ме, р 1 <0,0001) на 3-и сутки послеоперационного периода до 0,359 (Ме, р 1 <0,0001) на 5-е сутки, при этом статистически значимых отличий по сравнению с группой контроля не отмечалось (рис. 4).
А
Б
Рисунок 2 - Экспрессия МАС387 в паренхиме печени на 1-е сутки (А) и 3-и сутки (Б) послеоперационного периода при экспериментальном распространенном гнойном перитоните, контрольная группа. Окраска Anti-Macrophage antibody [MAC387]-ab49408. Увеличение х400.
Рисунок 3 - Экспрессия МАС387 в паренхиме печени на 5-е сутки послеоперационного периода при экспериментальном распространенном гнойном перитоните, контрольная группа. Окраска Anti-Macrophage antibody [MAC387]-ab49408 (обработка в программе ImageJ 1.45s). Увеличение х400.
В группе животных, получавших Цитофлавин, уже с 3-х суток послеоперационного периода отмечался иммунопротекторный эффект, что выражалось в снижении интенсивности внутрипеченочного воспалительного ответа по сравнению с группой контроля. Так, экспрессия МАС387+ макрофагов на 1-е сутки в данной группе статистически значимо не отличалась от группы контроля и животных, получавших Неотон, составляя 0,096 (Ме, р1=0,0004). Однако на
Рисунок 4 - Экспрессия МАС387 в паренхиме печени на 5-е сутки послеоперационного периода при экспериментальном распространенном гнойном перитоните, применение препарата Неотон. Окраска Anti-Macrophage antibody [MAC387]-ab49408 (обработка в программе ImageJ 1.45s). Увеличение х400.
3-и сутки данный показатель составил 0,084 (Ме, р1=0,0136, р3<0,0001, р4=0,001), что было в 4,25 раза меньше, чем в группе контроля, а на 5-е сутки показатель экспрессии МАС387+ приблизился к нормальным значениям и составил 0,068 (Ме, р 1 =0,017, р3<0,0001, р4<0,0001), что было в 4,38 раза ниже по сравнению с аналогичным сроком в контрольной группе и в 5,28 раза ниже, чем в группе животных, получавших Неотон
(рис. 5).
ъ
> - - Ъ *
Рисунок 5 - Экспрессия МАС387 в паренхиме печени на 5-е сутки послеоперационного периода при экспериментальном распространенном гнойном перитоните, применение препарата Цитофлавин. Окраска Anti-Macrophage antibody [MAC387]-ab49408 (обработка в программе ImageJ 1.45s). Увеличение х400.
Обсуждение
Проведенное исследование показало наличие МАС387-позитивных макрофагов в печени как в норме, так и при экспериментальном гнойном перитоните, причем при перитоните уровень экспрессии маркера внутрипеченочного воспаления МАС387 значительно возрастает. Данный механизм, возможно, является предиктором дальнейшего развития деструктивных процессов в печени с нарушением ее функции, а также системного воспаления и полиорганной недостаточности. Препарат, содержащий янтарную кислоту, Цитофлавин, по сравнению с препаратом креатинфосфата Неотон, более эффективно снижает уровень экспрессии МАС387+ клеток в печени. На 5-е сутки послеоперационного периода у животных, получавших Цитофлавин, интенсивность внутрипеченочного воспаления была в 4,38 и 5,28 раза ниже, чем в группе контроля и группе животных, получавших Неотон соответственно.
Заключение
1. МАС387-позитивные макрофаги обнаруживаются в печени как в норме, так и при экспериментальном гнойном перитоните.
2. Для экспериментального распространенного гнойного перитонита характерно зна-
чительное увеличение уровня экспрессии маркера внутрипеченочного воспаления МАС387 в ткани печени.
3. Изменение экспрессии маркера внутрипеченочного воспалительного ответа при экспериментальном распространенном гнойном перитоните, возможно, является предиктором дальнейшего развития деструктивных процессов в печени с нарушением ее функции, а также системного воспаления и полиорганной недостаточности.
4. Препарат, содержащий янтарную кислоту, Цитофлавин, по сравнению с препаратом креатинфосфата Неотон, более эффективно снижает уровень экспрессии МАС387+ клеток в печени, корригирует интенсивность внутрипеченочного воспалительного клеточно-опосредованного ответа, что в результате способствует уменьшению степени альтерации ткани печени и оказывает цитопротекторный эффект.
Литература
1. Complicated intra-abdominal infections in a worldwide context: an observational prospective study (CIAOW Study) / M. Sartelli [et al.] // World J. Emergency Surgery. - 2013 Jan. - Vol. 8, N 1. - P. 1.
2. Basic principles of diagnosis and treatment of secondary peritonitis - recommendations of experts with the support of SIS / R. Gurlich [et al.] // Rozhl. Chir. - 2014 Jun. - Vol. 93, N 6. - P. 334-348, 359-352.
3. Ефименко, Н. А. Иммунопатогенез и концепция современной иммунотерапии перитонита у пострадавших с тяжёлой сочетанной травмой живота / Н. А. Ефименко, В. Е. Розанов, А. И. Болотников. - Москва : Автограф, 2008. - 302 с.
4. Activated liver macrophages in human liver diseases / K. Yamamoto [et al.] // J. Gastroenterol. Hepatol. - 1995. - Vol. 10, Sup. 1. - Р. 72-76.
5. Immunohistochemical phenotyping of liver macrophages in normal and diseased human liver / M. Tomita [et al.] // Hepatology. - 1994 Aug. -Vol. 20, N 2. - Р. 317-325.
6. Increases in intrahepatic CD68 positive cells, MAC387 positive cells, and proinflammatory cytokines (particularly interleukin 18) in chronic hepatitis C infection / P. McGuinness [et al.] // Gut. - 2000 Feb. - Vol. 46, N 2. - Р. 260-269.
7. Carotid artery brain aneurysm model: in vivo molecular enzyme-specific MR imaging of active inflammation in a pilot study / M. J. DeLeo [et
al.] // Radiology. - 2009 Sep. - Vol. 252, N 3. - Р. 696-703.
8. The detection of CD2+, CD4+, CD8+, and WC1 + T lymphocytes, B cells and macrophages in fixed and paraffin embedded bovine tissue using a range of antigen recovery and signal amplification techniques / M. Gutierrez [et al.] // Vet. Immunol.
Immunopathol. - 1999 Nov. - Vol. 71, N 3/4. - Р. 321-334.
9. Technical advance: liposomal alendronate depletes monocytes and macrophages in the nonhuman primate model of human disease / B. J. Burwitz [et al.] // J. Leukoc. Biol. - 2014 Sep. - Vol. 96, N 3. - Р. 491-501.
Поступила 30.03.2015 г. Принята в печать 03.04.2015 г.
Сведения об авторах:
Матусевич Е.А. - соискатель кафедры госпитальной хирургии с курсами урологии и детской хирургии УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет», заместитель главного врача по медицинской части УЗ «Браславская ЦРБ»;
Косинец В.А. - д.м.н., профессор кафедры госпитальной хирургии с курсами урологии и детской хирургии УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет».
Адрес для корреспонденции: Республика Беларусь, 2211970, Витебская область, г. Браслав, ул. Советская, 138. Тел.моб.: +375 (29) 714-19-10, e-mail: burat@km.ru - Матусевич Евгений Анатольевич.
