CC BY
147
process occurs asynchronously in rumen, reticulum, omasum and abomasum and causes covers and layers heterogeneity in stomach wall from the birth to four and half months of age.
УДК 619:612.017.1:616-006.446:636.22/.28
МЕТАБОЛИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ НЕЙТРОФИЛОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПРИ ЛЕЙКОЗЕ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
Власенко В.С. - д.б.н., с.н.с.; Иванов А.И. - аспирант; Дудоладова Т.С. - к.б.н., м.н.с.
ГНУ ВНИИБТЖ Россельхозакадемии, г. Омск e-mail: vvs-76@list.ru
Ключевые слова: лейкоз, крупный рогатый скот, НСТ-тест, нейтрофилы, левамизол.
Keywords: leukosis, cattle, NBT-test, neutrophils, levamisole.
Среди интегральных показателей иммунобиологической защиты наиболее адекватным параметром является фагоцитарная активность нейтрофилов крови. Системой фагоцитоза фиксируются многочисленные изменения внутренней среды организма. Особенно показательны в этом отношении нейтрофилы. Обмениваясь в циркуляции каждые 4-5 часов, они как бы фотографируют сдвиги, происходящие в этот период, являясь зеркалом гомеостаза [1].
О функциональном состоянии ключевой клетки системы антимикробной резистентности организма, реагирующей на любые изменения гомеостаза позволяет судить исследование кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов. Одним из основных и наиболее объективных методов исследования кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов является тест с нитросиним тетразолием (НСТ-тест), который основан на способности гранулоцитов фагоцитировать бесцветный краситель тетразолиевого ряда - НСТ и затем восстанавливать его в нерастворимый формазан темно-синего цвета с помощью НАД Н- и НАДФ Н-оксидаз [2, 3].
В практической иммунологии широкое распространение получили нагрузочные тесты, в которых определяют чувствительность клеток, чаще всего нейтрофилов, к антигенам, аллергенам и лекарственным препаратам. Обычно для этого используют реакции розеткообразования, фагоцитоза и хемилюминесценции [4]. Некоторые исследователи для оценки чувствительности лимфоцитов в реакции спонтанного розеткообразования применяли левамизол, в том числе при лимфогранулематозе человека и лейкозе животных. Основное его действие проявлялось в усилении
активности Т-лимфоцитов в иммунологически дефектном организме, но не у здоровых [5, 6].
Вместе с тем в научной литературе недостаточно сведений о воздействии левамизола in vitro на функциональное состояние нейтрофилов крови при лейкозе крупного рогатого скота, в связи с чем предметом нашего исследовательского интереса стало изучение метаболической активности нейтрофилов в НСТ-тесте в присутствии левамизола у здоровых коров и носителей вируса лейкоза крупного рогатого скота.
Материалы и методы исследований. С целью выбора оптимальной концентрации для изучения действия левамизола in vitro на функциональную активность нейтрофилов было отобрано 5 коров. У животных отбирали периферическую кровь и оценивали функциональную активность нейтрофилов в НСТ-тесте фотометрическим методом с использованием в качестве индуктора различных концентраций левамизола (0,01; 0,1; 0,5; 5 и 50 мкг/мл) последовательно определяя показатели оптической плотности опытных проб. Результаты реакции фиксировали с помощью многоканального иммунохимического анализатора «Fluorofot STDLess-486-М». Оценку концентрации образовавшегося диформазана в нейтрофилах определяли по разнице экстинкций при длине волны 630 нм и 490 нм.
Для сравнительного испытания метаболической активности нейтрофилов периферической крови у здоровых и инфицированных ВЛКРС животных был проведен эксперимент на 20-и головах крупного рогатого скота в возрасте 3-5 лет из неблагополучного по лейкозу хозяйства, которых по результатам серологических исследований разделили на 2 группы: 1-ю группу составили 7 коров отрицательно реагирующих в реакции иммунодиффузии (РИД) с гликопротеидным антигеном ВЛКРС (интактные), 2-ю группу - 13 положительно реагирующих в РИД с гликопротеидным антигеном ВЛКРС (носители ВЛКРС). Реакцию иммунодиффузии (РИД) применяли в соответствии с Методическими указаниями по диагностике лейкоза крупного рогатого скота, утвержденными ДВ МСХ РФ [7]. При постановке НСТ-теста в качестве индуктора использовали левамизол в оптимальной концентрации. Оценку концентрации образовавшегося диформазана в нейтрофилах определяли по разнице экстинкций при длине волны 630 нм и 490 нм с последующим подсчетом коэффициента стимуляции (К ст.). К ст. = оптическая плотность в стимулированных лунках / оптическая плотность в контрольных лунках [8].
Математическая обработка цифровых данных включала определение средней арифметической (М), ошибки средней арифметической (m). Для оценки существенности различий между двумя средними величинами Мх и Му использовали t-критерий по Стьюденту. Различие между контролем и
опытом считалось статистически достоверным только для Р<0,05.
Результаты исследований и их обсуждение. При изучении влияния различных концентраций левамизола на оптическую плотность раствора диформазана при определении уровня индуцированной активности (в присутствии препарата) было установлено, что линейное увеличение плотности наблюдается при повышении концентрации левамизола от 0,01 до 0,5 мкг/мл. Дальнейший подъем концентрации левамизола приводил к нелинейному изменению оптической плотности и даже ее уменьшению. Таким образом, для оценки восстановительно-окислительного метаболизма нейтрофилов у животных предпочтительно использовать левамизол в конечной концентрации не превышающей 0,5 мкг/мкл.
В ходе следующего эксперимента установлено, что у носителей ВЛКРС происходит усиление функциональной активности нейтрофилов в спонтанном варианте (268,33±9,84, 207,6±32,66 у.е. оп. пл.; Р>0,05), тогда как при постановке НСТ стимулированном левамизолом отмечается несущественное изменение показателей (табл. 1).
1. Результаты оценки метаболической активности нейтрофилов в тесте с нитросиним тетразолием у РИД-отрицательных и инфицированных ВЛКРС животных, М±т
Группа животных вариант постановки НСТ
спонтанный Индуцированный
у.е. оп. пл. у.е. оп. пл. КС
РИД-отрицательные 207,6±32,66 238,2±20,9 1,44±0,20
Носители ВЛКРС 268,33±9,84 229,3±13,7 0,86±0,07
Достоверность, Р >0,05 >0,05 <0,05
Следует отметить, что важным показателем НСТ-теста явилось не столько его изменение в спонтанном и индуцированных вариантах, сколько соотношение между стимулированным и спонтанным, т.е. коэффициент стимуляции (КС). Так, у носителей ВЛКРС этот коэффициент с высокой степенью достоверности (Р<0,05) уменьшался.
В последующем мы сопоставили результаты диагностических исследований на лейкоз со значениями КС. Полученные данные представлены в таблице 2.
Из таблицы 2 видно, что снижение коэффициента стимуляции ниже отметки 0,95 было отмечено у 11 из 13-и животных (84,6 %), у которых при диагностическом исследовании обнаружен вирус лейкоза. В то же время КС превышал значение 1,11 у 4-х животных, из них 3 являлись РИД-отрицательными и только у одного были обнаружены специфические антитела к антигенам ВЛКРС, при этом КС был резко повышен и составил 11,1. Дополнительным исследованием это животное было признано
больным в гематологической стадии. Резкое повышение НСТ-положительных нейтрофилов и как следствие, коэффициента стимуляции у больного лейкозом животного, на наш взгляд, связано с развитием инфекционно-воспалительного осложнения.
2. Значения коэффициента стимуляции у животных в зависимости от результатов диагностических исследований на лейкоз
Группа животных п Значения КС (% от числа животных в группе)
<0,95 >1,11 от 0,96 до 1,10
РИД-отрицательные 7 4 (57,1) 3 (42,9) -
Носители ВЛКРС 13 11 (84,6) 1(7,7) 1 (7,7)
Выводы: 1. Применение левамизола в качестве индуктора в тесте с нитросиним тетразолием (НСТ), основанном на оптическом измерении экстрагированного диформазана с автоматизированным учетом реакции, позволяет проводить более объективную оценку функционально-метаболической активности нейтрофилов у крупного рогатого скота при лейкозе. 2. Вычислением коэффициента стимуляции (КС) для оценки готовности нейтрофила к завершенному фагоцитозу установлено снижение КС от 0,95 и ниже у носителей вируса лейкоза крупного рогатого скота. Низкий показатель стимулированной реакции по отношению к спонтанной у 57,1 % РИД-отрицательных животных свидетельствует о снижении резистентности организма и низкой микробицидной активности нейтрофилов и как следствие - высокой чувствительности к инфекции ВЛКРС.
ЛИТЕРАТУРА: 1. Сабанчиева Ж.Х. Состояние фагоцитарной системы крови в НСТ-тесте у больных ВИЧ-инфекцией / Ж.Х. Сабанчиева // Успехи современного естествознания. - 2006. - №3. - С. 44-45. 2. Власенко В.С. Оценка функциональной активности нейтрофилов крови морских свинок, инфицированных Я-формой бруцелл / В.С. Власенко, Л.В. Дегтяренко, А.И. Иванов // Теоретические и практические аспекты развития современной ветеринарной науки: Тр. КазНИВИ. - 2012. - Т. 58. - С. 67-72. 3. Пацула Ю.И. Ускоренный метод визуализации восстановленного нитросинего тетразолия для оценки функциональной активности нейтрофилов / Ю.И. Пацула, В.С. Власенко // Ветеринария и кормление. - 2009. - №4. - С. 20-21. 4. Лебедев К.А. Иммунная недостаточность (выявление и лечение) / К.А. Лебедев, И.Д. Понякина. -М: Медицинская книга, Н. Новгород: Издательство НГМА, 2003. - 443 с. 5. Иванов А.И. Особенности экспрессии Е-рецепторов на Т-лимфоцитах периферической крови у коров, инфицированных ВЛКРС / А.И. Иванов, О.В. Морозова, В.С. Власенко // Обеспечение ветеринарного благополучия
в животноводстве и птицеводстве: Матер. Матер. Междунар. науч.-практич. конф., посвященной ветеранам ветеринарной науки (Омск, 2-3 октября 2013 г.). - Омск, 2013. - С. 99-101. 6. Последние достижения в клинической иммунологии: Пер. с англ. / Под ред. Р.А. Томпсона. - М.: «Медицина», 1983. - 496 с. 7. Методические указания по диагностике лейкоза крупного скота / Департамент ветеринарии, Минсельхоз России. 2000. №13-7-2/2130. 8. Оценка иммунного статуса у крупного рогатого скота при лейкозе / В.С. Власенко, М.А. Бажин, Т.С. Дудоладова, В.А. Мироненко, А.Н. Новиков // Методические рекомендации. / ГНУ ВНИИБТЖ Россельхозакадемии; ГНУ СО Россельхозакадемии. - Омск, 2010. - 31 с.
МЕТАБОЛИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ НЕЙТРОФИЛОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПРИ ЛЕЙКОЗЕ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
Власенко В.С., Иванов А.И., Дудоладова Т.С.
Резюме
В статье представлены результаты исследования функционально-метаболического статуса нейтрофилов у носителей вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) фотометрическим методом в НСТ-тесте. Установлено, что коэффициент стимуляции (КС), определяемый как соотношение между индуцированным и спонтанным вариантом, является наиболее важным показателем. Исходно низкий показатель КС был отмечен у 57,1% РИД-отрицательных животных из неблагополучного по лейкозу стада и свидетельствовал о снижении резистентности и низкой микробицидной активности нейтрофилов.
THE METABOLIC ACTIVITY OF PERIPHERAL BLOOD NEUTROPHILS
IN LEUKOSIS CATTLE
Vlasenko V.S., Ivanov A.I., Dudoladova T.S.
Summary
The article are presents the results of a study of functional-metabolic status of neutrophil leukemia virus in cattle (BLV) photometric method in HCT-test. There was found that stimulation factor (SF), defined as the ratio between the induced and spontaneous variants, is the most important indicator. There was noted initially lowest SF in 57,1% of the RID-negative animals from unfavorableherds by leukosis and was testified to reduce resistance and low microbicidal activity of neutrophils.
