CC BY
68
УДК 616-018
МЕТАБОЛИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ПРИ МОДИФИКАЦИИ РН СРЕДЫ ИНКУБАЦИИ И ДЕЙСТВИИ Ь-КАРНИТИНА (краткое сообщение)
В.П. БАЛАШОВ*, И.А. ИСАЕВА*, А.С. ГОРШКОВ**, А.А.КОСЫХ**
Мордовский Государственный Университет им. Н.П. Огарева, ул. Большевистская, д. 68, г. Саранск, Республика Мордовия,Россия, 43000 **Кировская Государственная Медицинская Академия, ул. К. Маркса, 112, г. Киров, Кировская область, Россия, 610027
Аннотация. Культуры клеточных линий традиционно используются для оценки лекарственной цитотоксичности. Целью нашей работы была оценка влияния L-карнитина на метаболическую активность мультипотентных мезенхимальных стромаль-ных клеток. Методы исследования. Объектом исследования служила культура мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток 6-го пассажа, полученные из адипоцитов крысы. Культивирование данной клеточной линии осуществляли при оптимальной pH среды (7,37) и в условиях модификации данного показателя (4,0; 5,5 и 9,0). МТТ-тест проводили по методу M. Niks и M.Otto в модификации. Результаты. На исследуемой культуре клеток, показано, что моделирование ацидоза (рН 4,0 и 5,5) и алкалоза (рН 9,0) сопровождается снижением интенсивности их метаболизма по тесту МТТ. Выраженность угнетения активности митохондриальных дегидрогеназ существенно зависела от величины отклонения рН от нормальных значений. Внесение в среду культивации L-карнитина в диапазоне концентраций 10'3-10'10 Моль/л повышает интенсивность образования солей фор-мазана во всем диапазоне рН среды инкубации. Оптимальный эффект L-карнитин проявляет в концентрациях 10'5-10'6 Моль/л и при наименьшем отклонении рН среды от нормальных значений. Обсуждение. Полученные результаты подтверждают гипотезу о способности L-карнитина поддерживать метаболизм клеток в условиях нарушения внутри- и внеклеточной рН, обусловленных стрессом, гипоксией, интенсивной физической нагрузкой и ишемией. В условиях и ацидоза и алкалоза L-каринитин стимулирует синтез АТФ благодаря участию в окислении свободных жирных кислот в митохондриях. Данное свойство препарата может объяснять ряд его фармакологических эффектов и представляет интерес для специалистов в области спортивной медицины.
Ключевые слова: мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, МТТ-тест, L-карнитин.
METABOLIC ACTIVITY OF MULTIPOTENT MESENCHYMAL STROMAL CELLS BY MEANS OF MOIFICATION OF PH-CONDITION OF INCUBATION AND THE L-CARNITINE EFFECTS
V.P. BALASHOV*, I.A. ISAEVA*, A.S. GORSHKOV**, A.A.KOSYH*
Mordovia N.P. Ogarev State University, 3000, Russia, Republic of Mordovia, Saransk, Bolshevik street, 68 **Kirov State Medical Academy, 610027, Russia, Kirov region, Kirov, street Karl Marx, 112
Abstract. Culture of cell lines have been used traditionally to evaluate medicinal cytotoxicity. The aim of this study was to evaluate the effect of L-carnitine on the metabolic activity of multipotent mesenchymal stromal cells. Research methods. The object of the study was the culture of multipotent mesenchymal stromal cells of the 6th passage derived from adipocytes in rat. Cultivation of this cell line was carried out at the optimum pH-condition (7.37) and at the modification of the values (4.0, 5.5 and 9.0). The MTT-test was performed by the method of M. Niks and M.Otto in modification. Results. The research culture of cells, it is shown that the simulation acidosis (pH 4.0 and 5.5) and alkalosis (pH of 9.0) accompanied by a decrease in the intensity of their metabolism by MTT test. The severity of oppression activity of mitochondrial dehydrogenases significantly depended on the magnitude of deviations from normal pH values. Introduction in the environment of cultivation L-carnitine in the range of concentrations 10-3-10-10 Mol/l increases the intensity of formation of theformazan salts all over the pH range of incubation medium. The optimal effect of L-carnitine manifests in concentrations 10-5-10-6 Mol/l and with the least deviation of the pH of the environment from the normal values.
The discussion. The obtained results confirm the hypothesis about the ability of L-carnitine to maintain the metabolism of cells in the failure of intra - and extracellular pH caused by stress, hypoxia, strenuous and ischemia. In the conditions and acidosis and alkalosis L- carnitine stimulates the synthesis of ATP through participation in the oxidation of free fatty acids into the mitochondria. This property of the drug may explain some of its pharmacological effects and is of interest for specialists in the field of sports medicine.
Key words: multipotent mesenchymal stromal cells, the MTT-test, L-carnitine.
В настоящее время, в эпоху спортивных достижений остается наиболее актуальным вопрос о повышении адаптационных возможностей организма спортсменов к последствиям изнурительного тренировочного процесса. Для решения этой важной задачи предлагаются разные подходы, в том числе применение лекарственных средств из группы «препаратов метаболического типа действия». В частности одним из наиболее эффективных средств, по мнению ведущих специалистов в области спортивной медицины, является Ь-карнитин - недопинговое энергообеспечивающее средство [1,2]. Ь-карнитин (Ь-р-гидрокси-у-Ы,Ы,Ы-
триметиламиномасляная кислота, витамин Вт) выполняет важную роль в транспорте жирных кислот в митохондриальный матрикс и регулирует метаболизм ацил-КоА [3,4,5]. В клинической практике Ь-карнитин успешно применяется в комплексной терапии широкого спектра заболеваний, таких как синдром хронической усталости, сердечнососудистая патология, гипогликемия и др. [6]. Учитывая механизм терапевтического действия Ь-карнитина (как в плане стимуляции работоспособности, так и коррекции дисфункций организма, вызванных интенсивной физической нагрузкой и стрессоррным перенапряжением) неко-
торые исследователи предлагают использовать его у спортсменов с целью повышения выносливости, в том числе при сопутствующей патологии миокарда [7]. Тем не менее, в настоящее время действие L-карнитина на клеточном уровне изучено достаточно слабо. Для изучения влияния карни-тина на клеточный метаболизм мы применили МТТ-тест на культуре мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК).
Материалы и методы исследования. Объектом исследования служила культура мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток 6 пассажа, полученные из адипоцитов крысы, одной из линий развития которых являются миобласты [8]. Культивирование данной клеточной линии осуществляли при оптимальной pH среды (7,37) и в условиях модификации данного показателя (4,0; 5,5 и 9,0), с 6-часовой инкубацией клеток в фосфатно-солевом буфере Дульбекко (DPBS). Кислотность буфера регулировали при помощи 1М растворов соляной кислоты или гидроксида натрия под контролем иономера ЭВ-74, перед использованием буферы фильтровали через шприцевые фильтры с размером пор 0,22 мкм.
Оценку клеточной и лекарственной цитотоксичности проводили с помощью МТТ-теста [9]. Принцип МТТ-теста основан на способности митохондриальных дегидрогеназ преобразовывать водорастворимый 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (МТТ) в формазан, который кристаллизируется внутри клеток. Добавление диме-тилсульфоксида (ДМСО) позволяет лизировать культивированные клетки, перевести формазан в растворимую форму и провести его полуколичественное определение.
ММСК засевали в 96-луночный планшет и культивировали в течение 48 часов до образования монослоя, после чего среду культивирования полностью удаляли. Препарат L-карнитина растворяли в буфере DPBS до концентрации 1М. В опытные лунки вносили DPBS в одном из вариантов рН, в параллельную серию лунок вносили DPBS в одном из вариантов рН и L-карнитин, чтобы его конечная концентрация составляла от 10'3 до 10'10М. Клетки инкубировали 6 часов, после чего в среду инкубации вносили 10 мкл раствора МТТ в концентрации 5 мг/мл. Для восстановления тетразолия клетки с красителем инкубировали еще 60 минут при 37°С, затем надосадочную жидкость (содержащую краситель и среду культивации) осторожно удаляли, а в лунки вносили по 100 мкл ДМСО. Кристаллы формазана растворяли при помощи встряхивателя для планшетов в течение 20 минут. Содержание окрашенного формазана определяли на ИФА-радере при длине волны 492 нм по отношению к соответствующему контролю. Результат выражали в единицах оптической плотности (ОП). При этом показатели ОП были прямо пропорциональны метаболической активности клеток.
Результаты и их обсуждение. В контрольных сериях экспериментов мы исследовали активность митохондриальных дегидрогеназ по тесту образования формазана при различных уровнях рН среды инкубации ММСК. При оптимальной рН (7,37) интенсивность метаболической активности клеток, выраженная в единицах оптической плотности составила 0,060±0,004 опт.ед. При моделировании выраженного ацидоза (рН 4,0 и рН 5,5) метаболическая активность существенно снижалась (p<0,05), соответственно до 0,001±0,0007 опт.ед. и 0,004±0,0018 опт.ед. соответственно (табл.).
В условиях алкалоза (рН 9,0) значение средней величины оптической плотности составило 0,015±0,004 опт.ед., что также свидетельствует о заметном, хотя и менее выра-
женном, чем при ацидозе, снижении клеточного метаболизма в тестируемой клеточной культуре.
Таблица
Активность митохондриальных дегидрогеназ (по данным МТТ-теста) при культивировании ММСК при различных значениях рН среды (в опт.ед.)
Концентрация карни-тина моль/л рН 4,0 рН 5,5 рН 9,0
Контроль (0) 0,001±0,0007 0,004±0,0018* 0,015±0,004*
10-3 0,020±0,014 0,037±0,006* 0,064±0,014*
10-4 0,011±0,008* 0,021±0,003* 0,057±0,015*
10-5 0,014±0,008* 0,047±0,002* 0,069±0,013*
10-6 0,015±0,008* 0,042±0,014* 0,060±0,013*
10-7 0,014±0,009* 0,024±0,009 0,067±0,014*
10-8 0,011±0,008* 0,027±0,003* 0,062±0,017*
10-9 0,014±0,009* 0,031±0,006* 0,060±0,012*
10-10 0,011±0,010 0,028±0,003* 0,065±0,013*
Примечание: * - отличия от соответствующих значений в контрольных сериях опытов достоверны при р<0,05
Рис. Зависимость интенсивности МТТ-теста (в оптических единицах) от степени отклонения рН среды инкубации от физиологической нормы и концентрации Ь-карнитина. АрН - отклонение рН среды инкубации от нормы (рН 7,37); М/л - концентрация Ь-карнитина в инкубационной среде в диапазоне 10-п (от 10-3 до 10-10); ОП - интенсивность образования солей формазана в единицах оптической плотности при Л=492 нм; стрелка указывает на показатели оптической плотности лизатов в МТТ-тесте при рН 7,37
Внесение Ь-карнитина в культуру ММСК в условиях экспериментального ацидоза и алкалоза существенно изменяет показатели активности митохондриальных дегидрогеназ. При рН 4,0 Ь-карнитин в диапазоне концентраций 10' 10-10-3 М повышает метаболическую активность ММСК в 1120 раз. В условиях инкубации культуры клеток при рН 5,5 получены однонаправленные результаты, но степень компенсации метаболической дисфункции ММСК под влиянием Ь-карнитина была более выраженной. Максимальную эффективность в этой серии опытов энерготрофик проявил в концентрациях Ю^-Ю-6 М. В условиях алкалоза (рН=9,0) протекторный эффект Ь-карнитина оказался максимальным. Способность культуры ММСК восстанавливать ММТ до солей формазана статистически соответствовала (0,057±0,015 - 0,069±0,013) активности клеток в оптимальных условиях рН (0,060±0,004).
Анализ полученных результатов позволяет подчеркнуть интересную закономерность: эффективность Ь-
карнитина существенно зависит от степени отклонения рН среды культивирования от нормальных условий. Данная закономерность проиллюстрирована на рис. Из представленных данных видно, что чем меньше АрН, тем в большей степени реализуется протекторный эффект Ь-карнитина. Данный эффект энерготрофика проявляется во всех диапазонах изученных концентраций.
Полученные результаты могут служить объяснением эффективности Ь-карнитина при таких физиологических и патологических условиях как активация локомоции, ишемия, стресс [10-12]. При указанных состояниях обычно развивается метаболический ацидоз различной степени выраженности и положительные эффекты энерготрофика, представленные в литературе, реализуются при накопле-
нии в клетках лактата и ингибировании пируватдегидроге-назного комплекса.
Выводы:
1. Моделирование ацидоза (рН 4,0 и 5,5) и алкалоза (рН 9,0) в культуре мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток сопровождается снижением интенсивности их метаболизма по тесту МТТ.
2. L-карнитин в диапазоне концентраций 10'3-10'10 Моль/л повышает интенсивность образования солей формазана в культуре ММСК во всем диапазоне рН среды инкубации.
3. Оптимальный эффект L-карнитин проявляет в дозах 10'5-10'6 Моль/л и при наименьшем отклонении рН среды от нормальных значений.
Литература
1. ISSN exercise and sport nutrition review: research and recommendations / R. Kreider [et al.] // Journal of the Society of Sports Nutrition.- 2010.- V. 7.- P.7.
2. Балыкова, Л.А. Опыт применения метаболических кардиопротекторов в детской спортивной медицине / Л.А. Балыкова, С.А. Ивянский, A.tt Урзяева // Российский кардиологический журнал.- 2011.- № 5 (91).- С. 52-57.
3. Karlic, H. Supplementation of L-carnitine in athletes: does it make sense? / H. Karlic, A. Lohninger // Nutrition-2004.- 20(7-8).- Р. 709-715.
4. Stephens, F.B. New insights concerning the role of carnitine in the regulation of fuel metabolism in skeletal muscle / F.B. Stephens, D. Constantin-Teodosiu, P.L. Greenhaff // J. Physiol.- 2007.- 581(2).- Р. 431^44.
5. Титов, В.Н. Функция митохондрий, карнитин, коэн-зим-А, жирные кислоты, глюкоза, цикл рендла и инсулин (лекция) / В.Н. Титов // Клиническая лабораторная диагностика.- 2012.- №2.- С. 32^3.
6. Monograph. L-carnitine. // Altern. Med. Rev.- 2005.-V. 10.- № 1.- P. 42-50
7. Ивянский, С.А. Современные представления о ремоделировании миокарда у юных спортсменов / С.А. Ивян-ский, Л.А. Балыкова, А.Н. Урзяева, Н.В. Щёкина // Наука и спорт: современные тенденции.- 2013.- №1.- С. 80-88.
8. Владимирская, Е.Б. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) в клеточной терапии / Е.Б. Владимирская // Онкогематология.- 2007.- № 1.- С. 4-16.
9. Горшков, А.С. Морфофункциональное состояние опухолевых и неопухолевых клеток под влиянием хорионического гонадотропина и эмбихина: дисс. ... кандидата медицинских наук / А. С. Горшков.- Киров, 2013.- 131 с.
10. Метаболическая терапия L-карнитином при переднем остром инфаркте миокарда с подъемом сегмента ST: рандомизированное клиническое исследование / G. Ta-rantini [и др.] // Российский кардиологический журнал.-2011.- № 4.- С. 77-84.
11. Балыкова, Л.А. Подходы к диагностике и коррекции патологических изменений сердца у юных спортсменов с использованием препаратов метаболического действия / Л.А. Балыкова, И.А. Маркелова // Практическая медицина.- 2Q1Q.- № 44.- С. бб-72.
12. Новые аспекты применения L-карнитина в спортивной практике / С.А. Ивянский [и др.] // Ульяновский медико-биологический журнал.- 2Q12.- № 3.- С. 97-1Q3.
References
1. Kreider R, Wiiborn CD, Taylor L, Campbell B, Alma-da AL. ISSN exercise and sport nutrition review: research and recommendations. Journal of the Society of Sports Nutrition. 2Q1Q;7:7.
2. Balykova LA, Ivyanskiy SA, Urzyaeva AN. Opyt pri-meneniya metabolicheskikh kardioprotektorov v detskoy spor-tivnoy meditsine. Rossiyskiy kardiologicheskiy zhurnal. 2Q11;91(5):52-7. Russian.
3. Karlic H, Lohninger A. Supplementation of L-carnitine in athletes: does it make sense? Nutrition. 2QQ4;2Q(7-B):7Q9-15.
4. Stephens FB, Constantin-Teodosiu D, Greenhaff PL. New insights concerning the role of carnitine in the regulation of fuel metabolism in skeletal muscle. J. Physiol. 2QQ7;5B1(2):431-44.
5. Titov VN. Funktsiya mitokhondriy, karnitin, koenzim-A, zhirnye kisloty, glyukoza, tsikl rendla i insulin (lektsiya). Klinicheskaya laboratornaya diagnostika. 2Q12;2:32-43. Russian.
6. Monograph. L-carnitine. Altern. Med. Rev. 2QQ5;1Q(1):42-5Q.
7. Ivyanskiy SA, Balykova LA, Urzyaeva AN, Shchekina NV. Sovremennye predstavleniya o remodelirovanii miokarda u yunykh sportsmenov. Nauka i sport: sovremen-nye tendent-sii. 2Q13;1:BQ-B. Russian.
В. Vladimirskaya EB. Mezenkhimal’nye stvolovye kletki (MSK) v kletochnoy terapii. Onkogematologiya. 2QQ7;1:4-16. Russian.
9. Gorshkov AS. Morfofunktsional’noe sostoyanie opuk-holevykh i neopukholevykh kletok pod vliyaniem khorioni-cheskogo gonadotropina i embikhina [dissertation]. Kirov (Kirov region ); 2Q13. Russian.
1Q. Tarantini G, Scrutinio D, Bruzzi P. Metabolicheskaya terapiya L-karnitinom pri perednem ostrom infarkte miokarda s pod"emom segmenta ST: randomizirovannoe klinicheskoe issledovanie. Rossiyskiy kardiolo-gicheskiy zhurnal. 2Q11;4:77-В4. Russian.
11. Balykova LA, Markelova IA. Podkhody k diagno-stike i korrektsii patologicheskikh izmeneniy serdtsa u yunykh sportsmenov s ispol’zovaniem preparatov metabo-licheskogo deystviya. Prakticheskaya meditsina. 2Q1Q;44:66-72. Russian.
12. Ivyanskiy SA, Soldatov OM, Shchekina NV. Novye aspekty primeneniya L-karnitina v sportivnoy praktike. Ul’ya-novskiy mediko-biologicheskiy zhurnal. 2Q12;3:97-1Q3. Russian.
УДК 616.831.31-005.4-036.12-091.81-076.5:577.112.6
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКАЯ МОРФОМЕТРИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЫРУ-СОДЕРЖАЩИХ НЕЙРОНОВ РАЗЛИЧНЫХ ПОЛЕЙ КОРЫ БОЛЬШОГО МОЗГА ЧЕЛОВЕКА ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ ИШЕМИИ
А.В. СЕРГЕЕВ, С.С. СТЕПАНОВ, В.А. АКУЛИНИН, А.В. МЫЦИК
ГБОУ ВПО Омская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения РФ, ул. Ленина, 12, г. Омск, Россия, 644043
Аннотация. Проведено иммуногистохимическое (NPY - нейропептид Y) и морфометрическое изучение распределения и
