CC BY
14
лечебного действия розмариновой кислоты, лютеоли-на и его сульфатированных производных // Биомедицинская химия. 2016; 62(1): 22-30.
10. Крылова Н.В., Попов А.М., Леонова Г.Н. Ан-тиоксиданты как потенциальные противовирусные препараты при флавивирусных инфекциях // Антибиотики и химиотерапия. 2016; 61(5-6): 25-31.
11. Крылова Н.В., Леонова Г.Н., Майстровская О.С., Макаренкова И.Д., Попов А.М., Ермакова С.П. Характеристика противовирусной активности препаратов по отношению к вирусу клещевого энцефалита. База данных №2016620150. Заявка № 2015621556 от 10.12.2015. Дата государственной регистрации в Реестре баз данных 02.02.2016.
12. Крылова Н.В., Леонова Г.Н., Попов А.М., Артюков А.А. Вирус клещевого энцефалита - как модель для изучения противовирусной активности биологически активных веществ // Здоровье. Медицинская экология. Наука. 2014; 57(3): 35-36.
13. Bastos J.C.S., de Menezes C.B.A., Fantinatti-Garboggini F., et al. Antiviral Activity of Marine Acti-nobacteria against Bovine Viral Diarrhea Virus, a Surrogate Model of the Hepatitis C Virus. RRJMB 2015; 4(4): 55-62.
14. Миронов А.Н., Бунятян Н.Д. и др. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.
Сведения об авторах
Крылова Наталья Владимировна - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории флавивирусных инфекций НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова; 690087, Владивосток, ул. Сельская 1; моб. тел. 8(908)448-64-23 е-mail: krylovanatalya@gmail.com (автор-корреспондент);
Леонова Галина Николаевна - д.м.н., профессор, главный научный сотрудник лаборатории флавивирусных инфекций НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова; 690087, Владивосток, ул. Сельская 1;
Попов Александр Михайлович - доктор биологических наук, профессор, руководитель группы изучения биологически активных добавок Тихоокеанского института биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, 690022, Владивосток, пр-т 100-летия Владивостока, 159; профессор кафедры биохимии, микробиологии и биотехнологии Школы Естественных наук Дальневосточного Федерального Университета, 690000, Владивосток, Октябрьская, 27;
Артюков Александр Алексеевич - доктор химических наук, заведующий лабораторией биотехнологии Тихоокеанского института биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, 690022, Владивосток, пр-т 100-летия Владивостока, 159.
Майстровская Ольга Сергеевна - младший научный сотрудник лаборатории флавивирусных инфекций НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова; 690087, Владивосток, ул. Сельская 1;
Зыкова Мария Владимировна - младший научный сотрудник лаборатории флавивирусных инфекций НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова; 690087, Владивосток, ул. Сельская 1.
© Коллектив авторов, 2017 г doi: 10.5281/zenodo.817817
Удк 579.61:57.085.23:577.27+616.9-092.9:612.017.11
И.Н. Ляпун1, Н.Г. Плехова1'2, Е.И. Дробот1
метаболическая активность дендритных клеток при их взаимодействии с хантавирусом
1 НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова, Владивосток
2 Тихоокеанский государственный медицинский университет, Владивосток
В данной работе было установлено, что выраженность функционального состояния дендритных клеток на 9-е сутки инкубирования зависят от вносимого индуктора созревания. Хантавирус не оказывал активирующего эффекта на незрелые дендритные клетки, тогда как в отношении индуцированных проявлялось его выраженное действие, о чем свидетельствовали показатели активности АТФазы, подавление лактатдегидрогеназной активности и повышение сукцинатоксидазной и нитроксидобразующей систем клеток.
Ключевые слова: дендритные клетки, хантавирус, ферменты.
I.N. Lyapun1, N.G. Plekhova12, E.I. Drobot1
metabolic activity of dendritic cells as they interact with hantavirus
1 Somov Institute of Epidemiology and Microbiology, Vladivostok, Russia
2 Pacific State Medical University, Vladivostok, Russia
HEALTH. MEDICAL ECOLOGY. SCiENCE 3 (70) - 2017 27
• Материалы Научно-практической конференции «Фундаментальная дальневосточная наука - медицине»
In this paper, it was found that the severity of the functional state of dendritic cells on the 9th day of incubation depends on the insertion inducer of maturation. Hantavirus did not exert an activating effect on immature dendritic cells, whereas in relation to the induced ones, its pronounced effect was manifested, as evidenced by the indices of ATPase activity, suppression of lactate dehydrogenase activity and increase in succinate oxidase and nitroxide-forming cell systems.
Keywords: dendritic cells, hantavirus, enzymes
Для формирования полноценного иммунного ответа, в том числе и противоинфекционного, необходимо наличие антигенпредставляющих клеток, среди которых наиболее важными являются дендритные клетки (ДК). Их морфология, фенотип и функции претерпевают значительные изменения в процессе дифференцировки гемопоэтических CD34+ клеток-предшественников из костного мозга. На первом этапе незрелые ДК циркулируют в крови, где приобретают способность к захвату и процессингу антигенов. В дальнейшем ДК мигрируют в органы, где впоследствии индуцируется их антигенпредставля-ющая функция, что определяет их ключевую роль в развитии иммунных реакций организма [1, 2].
M.J. Raftery с соавторами [3] обнаружили, что хан-тавирус способен проникать и размножаться в ДК, полученных из моноцитарных дериватов пуповинной и периферической крови человека. Причем эти ДК обладали способностью стимулировать пролиферацию Т-лимфоцитов в той же степени, что и ДК после TNF-а-опосредованного созревания [4]. Сообщалось, что антиген хантавируса может локализоваться в фолликулярных ДК селезенки и лимфатических узлов [5].
Цель работы: исследование метаболической активности дендритных клеток при их взаимодействии с хантавирусом.
Материалы и методы
В качестве инфекционного агента использовался штамм Аа 60343 (ПМ-79-95) геноварианта Far East вируса Hantaan из Семейства Bunyaviridae род Hantavirus из рабочей коллекции лаборатории хантавирусных инфекций НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова. В экспериментах использовали суперна-тантную вируссодержащую жидкость, включавшую не менее 5 инфекционных единиц на клетку, исходя из посадочной концентрации клеток и величины титра (2,5 lg фокус-формирующих единиц/мл) вируса, используемого для заражения [6].
Первичную культуру недифференцированных клеток миелоидного пула получали по методу М.В. Lutz с соавторами [7] из костного мозга бедренной кости морских свинок путем промывания костномозгового канала средой RPMI-1640 (БиолоТ). Костный мозг гомогенизировали в среде RPMI-1640 (БиолоТ), трижды промывали с центрифугированием (1000 об/мин) и переносили в обогащенную среду культивирования. Конечная концентрация клеток составила 2х106 в 1 мл среды RPMI-1640, содержащей 0,1 мг/мл гентамицина-К (KRKA) и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (БиолоТ). Клеточную
суспензию разносили в плоскодонные 96-луночные микропланшеты по 100 мкл на лунку, затем инкубировали 3 ч в СО2-инкубаторе при 37°С. После чего удаляли неадгезированные клетки путем промывания средой RPMI-1640.
Для индукции созревания дендритных клеток (ДК), к суспензии клеток костного мозга добавляли 80 нг/мл GM-CSF (Sigma) и 20 нг/мл IL-4 (Sigma). На третьи сутки проводили повторную цитоки-новую стимуляцию. На шестые сутки инкубации производили смену среды и добавляли следующие индукторы созревания: 1) вирус Hantaan не менее 5 инфекционных единиц на клетку (1 ч контакта, затем отмывали от неадгезированных вирусных частиц); 2) TNF-a (Sigma); 3) 20 нг/мл IL-4 (Sigma). На девятые сутки монослой ДК использовали в экспериментальных целях. Качество культуры оценивалось методом прижизненного наблюдения клеток с помощью фазово-контрастной микроскопии [8].
Время контакта первичной культуры ДК с ви-руссодержащей жидкостью составило 60 мин. Для удаления внеклеточных вирусных частиц монослой клеток дважды промывали средой RPMI-1640 (БиолоТ), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (БиолоТ), 0,1 мг/мл гентамицина-К (KRKA). Затем продолжали инкубацию в течение 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 18, 24, 48, 72, 96 ч.
Определяли активность АТФазы, 5-нуклеотидазы, сукцинатдегидрогеназы (СДГ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), миелопероксидазы (МПО) и цитохромоксида-зы (ЦХО) на спектрофотометре при внесении соответствующих для каждого из ферментов субстратов. Результаты спектрофотометрического анализа активности ферментов выражали в виде унифицированного показателя - индекса стимуляции (Т), в процентах, который вычисляли по формуле: Т = (No - Nk)/ Nk х 100; где Nk - средний показатель оптической плотности исследуемого субстрата в нестимулированных ДК; No - средний показатель оптической плотности исследуемого субстрата в стимулированных ДК.
Результаты и обсуждение
В рамках настоящей работы установлены особенности влияния хантавируса на процесс дифферен-цировки ДК, полученных из костного мозга морских свинок. С помощью нМФА установлено, что при заражении хантавирусом ДК в начальной стадии диф-ференцировки без внесения индуктора, количество антигенсодержащих клеток составило 6±0,4%, тогда как в популяции клеток, после воздействия индуктора созревания TNF-a, это количество составило 25±0,2%.
Наибольший процент антигенсодержащих ДК наблюдался в популяции, инфицированных хантавирусом (рис. 1). При этом через 3 суток после заражения вирусом, специфический антиген выявлялся как на поверхности ДК, так и в дендритных отростках.
т,% 65
45
25
а)
-15
40 п
PI Е3 2 ОЗ Н4 15 П6 И7 D8 а24 £343 Время инкубации,ч
б)
Рис. 1. Дендритные клетки, индуцированные хантавирусом: а) антигенсодержащие клетки через 1 ч после заражения хантавирусом, внутриклеточное свечение в виде глыбок; б) 2 сут после заражения. Непрямой МФА, ЛСКМ, увеличение х 800
При изучении ферментативной активности популяций ДК, дифференцированных под влиянием различных индукторов, а затем зараженных хантавиру-сом, была выявлена наибольшая стимуляция клеток, дифференцированных под влиянием вируса. Также, в этих клетках наблюдалась активация сукцинатде-гидрогеназной кислородобразующей системы, тогда как в ДК без воздействия индуктора и после внесения ТОТ-а, обнаруживалась активность лактатдеги-дрогеназы (рис. 2).
Из литературы известно, что неспецифические эстеразы экспрессируются только в незрелых предшественниках ДК [1]. Нами определено повышение активности неспецифической эстеразы в ДК в ответ на внесение хантавируса. Так, в популяции клеток, индуцированной хантавирусом, активация данного фермента наблюдалась через 24 ч, тогда как в ДК без внесения индуктора - через 48 ч после заражения. В то же время в популяции, индуцированной ТОТ-а, активация фермента не выявлялась. Эти данные указывают на участие фермента неспецифической эсте-разы в процессе дифференцировки клеток по пути, отличному от процесса, наблюдаемого в ДК под влиянием индуктора ТОТ-а.
В литературе нами не обнаружено работ по исследованию нитроксидобразующей активности ДК, инфицированных вирусом. На начальных сроках после заражения хантавирусом в популяции недифференцированных и индуцированных вирусом ДК установлена внутриклеточная продукция нитритов, с последующим выделением их во внеклеточное пространство. В ДК, предварительно индуцированных ТОТ-а, внутриклеточная продукция нитритов не выявлялась, что объяснялось деградацией культуры вследствие цитотокси-ческого действия хантавируса.
Итак, исследования последних лет показали существенную значимость факторов врожденного имму-
20 ■
■20
т,% 25 ■
15
Время инкубации, ч
в)
-5 J
Время инкубации, ч
Рис. 2. Активность ферментов кислородзависимого метаболизма дендритных клеток, инфицированных хантавирусом: а) ЛДГ; б) СДГ; в) ЦХО. А - незрелые дендритные клетки; Б - дендритные клетки, индуцированные TNF-a; В - дендритные клетки, индуцированные хантавирусом
нитета в гомеостазе организма, при формировании его ответа на воздействие патогенов. Основой врожденного иммунитета являются процессы воспаления и фагоцитоза и его факторы обладают генетическими неклональными механизмами распознавания и элиминации патогенов. Эти свойства определяют важнейшую инициирующую и регулирующую роль клеточных факторов врожденной защиты организма в развитии специфических иммунных реакций при вирусных инфекциях. Наряду с вышеизложенным, необходимо отметить, что на настоящий момент неоправданно мало внимания уделяется исследователями проблеме изучения процессов, связанных с функциональными изменениями, происходящими в инфицированных вирусами клетках.
Анализируя результаты нашего исследования, можно сделать вывод, что хантавирус индуцирует созревание ДК в большей степени, чем ТОТ-а, на
HEALTH. MEDiCAL ECOLOGY. SCiENCE 3 (70) - 2017 29
Материалы Научно-практической конференции «Фундаментальная дальневосточная наука - медицине»
что указывали показатели метаболической активности клеток. Различие в показателях функционального состояния ДК было наиболее демонстративным на 9-е сутки инкубирования с индукторами созревания. При этом хантавирус не оказывал активирующего эффекта на ДК без предварительного внесения индуктора, тогда как в отношении клеток, предварительно прошедших дифференцировку под его влиянием, отмечалось его выраженное воздействие на активность кислородзависимой и нитрок-сидобразующей систем.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование. Работа поддержана научным проектом (0545-2014-0011) ФАНО.
ЛИТЕРАТУРА
1. Прокопович С.К., Виницкий В.Б. Дендритные клетки и перспективы их использования в иммунотерапии злокачественных новообразований // Онкология. 2001; 3(2-3): 126-131.
2. Алексеенко О.И., Храновская Н.Н., Болгова Л.С., Гриневич Ю.А. Цитоморфологические особенности
дендритных клеток // Цитология и генетика. 2006; 40(1): 66-69.
3. Raftery M.J., Kraus A.A., Ulrich R., Kruger D.H., Schonrich G. Hantavirus Infection of Dendritic Cells. J. of Virology. 2002; 76(21): 10724-10733.
4. Lui G., Manches O., Angel J., Molens J.P., Chap-erot L., Plumas J. Plasmacytoid Dendritic Cells Capture and Cross-Present Viral Antigens from Influenza-Virus Exposed Cells. PLoS ONE. 2009; 4: e7111.
5. Zaki SR., Greer P.W., Coffield L.M., Goldsmith C.S., Nolte K.B., Foucar K., Feddersen R.M, Zumwalt R.E., Miller G.L., Khan A.S. Hantavirus pulmonary syndrome. Pathogenesis of an emerging infectious disease. Am. J. Pathol. 1995; 146: 552-579.
6. Плехова Н.Г., Сомова Л.М. Роль моноцитов/ макрофагов в патогенезе вирусных инфекций. Тихоокеан. мед. журн. 2010; 3: 5-9.
7. Lutz M B. Kukutsch N., Ogilvie A.L., Rossner S., Koch F., Romani N., Schuler G. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J. Immunol. Methods. 1999; 223: 77-92.
8. Адамс Р. Методы культуры клеток для биохимиков. - М.: Мир; 1983; - 264 с.
Сведения об авторах
Ляпун Ирина Николаевна, к.б.н. научный сотрудник лаборатории клеточной биологии и гистопатологии, НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова,. 690087, г. Владивосток, ул. Сельская, д. 1. e-mail: irina-lyapun@list.ru.
Плехова Наталья Геннадьевна, д.б.н. ведущий научный сотрудник лаборатории клеточной биологии и гистопатологии НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова; заведующая центральной научной исследовательской лаборатории, Тихоокеанский государственный медицинский университет; e-mail: pl_nat@hotmail.com.
Дробот Елена Игоревна, к.б.н. научный сотрудник лаборатории клеточной биологии и гистопатологии НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова,. 690087, г. Владивосток, ул. Сельская, д. 1; e-mail: eidrobot@mail.ru.
© Бузолева Л.С., 2017 г doi: 10.5281/zenodo.817772
Удк 579.24+579.26
Л.С. Бузолева
оценка биопленкобразующих свойств
LISTERIA MONOCYTOGENES в АССоЦИАЦИЯХ
с сопутствующей микрофлорой, выделенной с поверхности растений
НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г. П. Сомова, г. Владивосток Дальневосточный Федеральный Университет, г. Владивосток
Исследована способность Listeria monocytogenes формировать биоплёнки в консорциуме с сапротрофными бактериями растений с высокой способностью к биопленкообразованию с листериями. Стимулирующие рост штаммы выделены с поверхности помидора, дайкона, яблока и салата. Определены три категории взаимодействия компонентов системы Listeria monocytogenes - сапротроф: стимулирование роста, торможение роста, отсутствие влияния.
Ключевые слова: Listeria monocytogenes, биопленки, микрофлора растений.
