CC BY
43
УДК 614.87:547.491.4:616 — 06
М.М. Тарских
МЕМБРАНОТОКСИЧНОСТЬ АКРИЛАМИДА:
РОЛЬ ЕГО ОКИСЛИТЕЛЬНОГО МЕТАБОЛИЗМА В РАЗВИТИИ МЕМБРАНОТОКСИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ И ИХ МЕХАНИЗМОВ
ГОУ ВПО Красноярская государственная медицинская академия
В работе доказана взаимосвязь между метаболизмом промышленного мономера акриламида и механизмом развития его токсических эффектов: показана роль перекисного окисления липидов в развитии мембранотоксического эффекта яда, а также влияние окислительных превращений мономера в системе микросомальных оксидаз на прооксидантное действие яда в печени и крови опытных крыс. Витамин Е предотвращал развитие повреждающих эффектов акрилата и предлагается в качестве средства химиопрофилактики мембранотоксичности ак-риламида.
Ключевые слова: акриламид, мембранотоксичностъ, окислительный метаболизм, перекиси-ое окисление липидов
Акриламид (АА) широко используется в различных отраслях промышленности, лабораторных и медицинских исследованиях [11]. В литературе указывается на его высокую нейротоксичность и мембранотоксичность [7, 11] Однако нет сведений о конкретных патогенетических механизмах повреждающего действия яда, неизвестна роль метаболизма АА в системе микросомальных ок-сидаз в развитии его токсических эффектов и их патогенетические механизмы.
Установлено, что большую практическую ценность представляет взаимосвязь между выраженностью острой и хронической патологии печени, сопровождающейся цитолизом гепатоцитов, и снижением резистентности эритроцитов к гемолизу [10]. На основании этих данных рекомендовано исследование функционального состояния биомембран эритроцитов как неспецифического, интегрального показателя действия на организм мембранотоксинов. Такой подход был использован и нами для оценки токсических свойств АА [2]. Следует отметить, что согласно литературным данным АА и его аналоги — NN — метилен-бисакриламид и ^изопропилакриламид, которые в процессе биотрансформации превращаются в акриламид, вызывали снижение содержания количества эритроцитов и гемоглобина, показателей гематокрита у мышей и крыс [10]. При этом уровень порфиринов в моче повышался, а активность дегидрогеназы дельта-аминолевули-новой кислоты в крови снижалась, что связывалось с нарушением эритропоэза [11]. Учитывая тот факт, что при воздействии АА на организм опытных животных в высоких дозах (2/3 LD50)
молекулярно-клеточные изменения возникают в органах с наиболее высокой активностью обменных процессов — печени, центральной нервной системе, в кроветворной системе [5, 9, 10], нами была предпринята попытка оценить воздействие АА на эритроцитарную мембрану.
Цель работы: оценка мембранотоксичности АА, изучение влияния его метаболизма в системе микросомальных оксидаз на механизмы мембра-нотоксичности и поиск средств химиопрофилактики мембранотоксического действия АА.
Методика
Работа выполнена на белых беспородных кры-сах-самцах массой 150-200 г. Содержание, питание, уход за животными и выведение их из эксперимента осуществляли в соответствии с требованиями «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР от 12.08.1977г. №755). АА вводили однократно внутрибрюшинно в дозе 1,4 ммоль/кг. Оценку состояния биомембран эритроцитов проводили методом кислотных эритрограмм [3] с помощью компьютеризированного измерительного комплекса. В качестве гемолитика использовали
0,002 N раствор НС1. Исследование проводили при постоянной температуре 24 °С. Максимальную скорость гемолиза определяли по наибольшему значению разности оптических плотностей раствора между двумя «соседними» измерениями с момента добавления гемолитика. Количество гемоглобина в эритроцитах крыс определяли гемиг-лобинцианидным методом, предложенным в качестве стандартного Международным комитетом по стандартизации в гематологии [6]. Активность пе-
рекисного окисления липидов (ПОЛ) биомембран определялась по накоплению малонового диальдегида (МДА) в плазме и эритроцитах контрольных и отравленных крыс и выражалась в нмоль МДА на мл плазмы или мг гемоглобина, соответственно [8]; 0,1 мл упакованных эритроцитов (1000 g в течение 10 мин) и 0,5 мл плазмы разводили равными объемами физиологического раствора, после чего без инкубации определяли содержание МДА. Интенсивность процессов перекисного окисления липидов в гомогенате печени определяли по скорости образования МДА, выражавшейся в нмоль на мг белка за 30 мин при 37 °С. Инкубационная смесь, термостатируемая при 37 °С, в 2,1 мл объема содержала 100 мМ трис-НС1 буфер, рН 7,4; 4 мг/мл белка гомогената печени. Скорость образования МДА в гомогенате печени и содержание МДА в крови определяли через 3 часа после введения АА. Как и при исследовании ПОЛ в крови, для изучения кислотного гемолиза эритроцитов кровь забирали из нижней полой вены у контрольных и опытных крыс спустя 5-7 мин после внутрибрю-шинного введения им гексенала в дозе 0,35 ммоль/ кг (80 мг/кг). Масляный раствор альфа-токоферола ацетата вводился трехкратно, внутрибрюшинно в эквимолярной с АА дозе — 1,4 ммоль/кг (593,4 мг/кг) за 48, 24 и 2 часа до введения акрилата. С целью индукции цитохрома Р-450 использовали отечественный препарат фенобарбитал, который вводилЬ по классической схеме: внутрибрюшинно в дозе 0,31 ммоль/кг (80 мг/кг) трехкратно — за 72, 48 и 24 часа до АА. Для ингибирования синтеза цитохрома Р-450 применяли СоС12, вводимый подкожно в дозе 0,46 ммоль/кг (60 мг/кг) по схеме: двукратно — за 48 и 24 часа до АА. Полученные результаты обрабатывали статистически с помощью вычисления средней арифметической (М) и стандартной ошибки средней арифметической (т). Достоверность различий сравниваемых параметров рассчитывали с использованием t-критерия Стьюдента. Различия считались значимыми при Р<0,05. Математический расчет выполнялЬ с помощью статистической программы «Microsoft Excel».
Результаты
Опыты показали, что снижение гемолитической стойкости эритроцитов развивается у отравленных животных уже через 3 часа после однократного внутрибрюшинного введения крысам АА в дозе 4/5 от LD50 (1,4 ммоль/кг): при этом время развития максимального гемолиза равняется 3,4±0,2 мин. против 4,4±0,3 мин в контроле (Рис. 1). Таким образом, показанное в наших опытах более раннее наступление максимальной скорости гемолиза эритроцитов у опытных животных свидетельствует в пользу того, что АА, подобно дру-
К АА
Рис. 1. Влияние острого отравления акрилатом (АА) на время наступления максимального гемолиза эритроцитов крыс.
Примечание: время наступления максимального гемолиза эритроцитов опытных крыс определялось через 3 часа после введения АА. К — время наступления максимальной скорости гемолиза у контрольных животных. АА — время наступления максимальной скорости гемолиза у отравленных животных
гим мембранотоксинам, оказывает повреждающее действие на мембрану эритроцитов, а использованный нами метод кислотных эритрограмм позволяет обнаруживать нарушения физико-химического состояния эритроцитарных мембран.
Учитывая то, что индукторами гемолиза эритроцитов являются продукты перекисного окисления [10], можно предположить, что именно стимуляция ПОЛ в эритроцитах при остром отравлении АА может лежать в основе его гемолитического действия. Исходя из этого, нами проводилось изучение ПОЛ в эритроцитах и плазме крови отравленных АА крыс. Результаты экспериментов показали, что после однократного внутрибрюшинного введения АА в дозе 4/5 LD50 (1,4 ммоль/кг) содержание МДА увеличивалось в плазме крови отравленных крыс уже через 1 час с момента введения яда, оставаясь на высоком уровне спустя 3 часа от введения акрилата (Таблица 1). Аналогичный эффект отмечался и в эритроцитах спустя 3 часа с начала затравки (Таблица 1). Характерно, что предварительное введение ви-
Таблица 1
Влияние острого отравления акриламидом (АА) на содержание МДА в крови крыс
Время после введения AA, час Содержание MДA нмоль/мл плазмы Содержание МДА, нмоль/мг гемоглобина эритроцитов
Контроль 10,0±1,0 0,24±0,05
1 15,7±0,6° 0,34±0,03
3 16,3±2,5° 0,38±0,03°°
12 9,3±1,2 0,20±0,01
24 10,9±1,0 0,40±0,11
Таблица 2
Влияние фенобарбитала (ФБ) и хлористого кобальта (СоС12) на скорость образования малонового диальдегида (МДА) в гомогенате печени крыс при остром отравлении акриламидом (АА)
тамина Е замедляло наступление максимального гемолиза эритроцитов отравленных животных с высокой степенью достоверности и составляло 5,0±0.08 мин (Р<0,001). Данный результат является важным аргументом в пользу прооксидант-ного механизма действия АА на мембрану эритроцитов.
С целью изучения влияния метаболитов АА на ПОЛ в следующей серии экспериментов оценивали скорость образования МДА в гомогенате печени, а также накопления МДА в плазме крови и эритроцитах отравленных АА крыс на фоне индукторов и ингибиторов системы микросомаль-ных оксидаз. Результаты продемонстрировали увеличение скорости образования МДА в печени отравленных АА крыс через 3 часа после затравки на фоне предварительного введения им фенобарбитала по сравнению с опытами, где им вводился один АА (Таблица 2). Предварительное введение животным хлористого кобальта по вышеописанной схеме хотя и не предотвращало развитие прооксидантного эффекта яда, но и достоверно не увеличивало скорости образования МДА в печени крыс данной группы по сравнению с теми, которым вводился один АА (Таблица 2). Характерно, что введение одного хлористого кобальта также оказывало прооксидантное действие, что согласуется с литературными данными. [1]
Далее проводилась оценка прооксидантного действия АА на фоне предварительного введения фенобарбитала по накоплению МДА в плазме и эритроцитах отравленных животных. Как видно из таблицы 3, предварительное введение фенобарбитала стимулировало образование МДА в плазме крови и эритроцитах отравленных животных спустя 3 часа после введения им АА.
Заключение
Таким образом, полученные нами результаты подтверждают тот факт, что АА оказывает мембранотоксическое действие, а также важную роль метаболизма АА в системе микросомальных
Таблица 3
Влияние фенобарбитала на содержание МДА в крови крыс при остром отравлении акриламидом (АА)
Серия опытов Содержание MДA нмоль/мл плазмы Содержание MДA, нмоль/мг гемоглобина эритроцитов
Контроль 10,0±1,0 0,24±0,05
AA 17,8±0,8°° 0,38±0,03°
ФБ+AA 21,7±0,7°°§§ 0,49±0,03°°§
ФБ 15,5±2,6 0,34±0,03
Примечание: ° — достоверность различий по сравнению с контролем; ° — р < 0,05 ; °° — р < 0,01; °°° — р < 0,001; § — достоверность различий по сравнению с опытами, где животным вводился один АА; §-р<0,05; §§-р<0,01; §§§-р< 0,001.
оксидаз печени отравленных крыс в развитии механизмов его токсичности, что согласуется с результатами более ранних исследований, показавших образование реакционноспособных метаболитов АА на цитохроме Р-450. [4] По-видимому, образующиеся в системе микросомаль-ных оксидаз печени токсичные метаболиты, стимулирующие ПОЛ в этом органе с развитием цитолитического эффекта, могут выходить за пределы органеллы, органа, накапливаться в других органах и тканях и оказывать повреждающие эффекты. В нашем случае это проявляется накоплением продуктов ПОЛ в плазме крови, а в последующем в печени и эритроцитах отравленных акрилатом животных. Подобный механизм действия показан в настоящее время для целого ряда других ксенобиотиков [12]. Следует отметить, что альфа-токоферол достоверно увеличивал время наступления максимального гемолиза эритроцитов, что подтверждает прооксидантный эффект ксенобиотика и позволяет рекомендовать витамин Е в качестве химиопротектора мембранотоксического действия АА. Развивающиеся при интоксикации АА и его аналогами гематологические изменения [11] обусловлены, по всей вероятности, как нарушением эритропо-эза, так и повреждающим действием акрилата на мембрану эритроцитов.
ACRYLAMIDE MEMBRANOTOXICITY:
ROLE OXIDATIVE METABOLISM OF ACRYLAMIDE IN MEMBRANOTOXICITY EFFECT AND MECHANISMS DAMAGE
M.M. Tarskich
The article deals with correlation between oxidative metabolism industrial monomer acrylamide and mechanism toxicity effects in rats. The author examined role lipid peroxidation biomembranes for mem-branotoxicity of acrylamide and possibility of using antioxidant — vitamin E in the chemoprophilaxis poisonings with acrylamide.
Серия опытов Скорость образования MДA. нмоль/мг белка за 30 мин.
Контроль 0,23±0,03
AA 0,34±0,03°
ФБ + AA 0,91±0,25°§
ФБ 0,42±0,18
СоС12 + AA 0,59±0,15°
СоС!, 0,52±0,02°°°
Литература
1. Влияние кобальта на динамику иммунологических и метаболических показателей / В.П. Нефедов, В.В. Кулис, А.В. Лауринавичус и др. // Анализ регуляции гомеостатических процессов в изолированных системах и организме. — Красноярск, 1986. — С. 3-16.
2. Голиков С.Н. Общие механизмы токсического действия / С.Н. Голиков, И.В. Саноцкий, Л.А. Тиунов.
— Ленинград, 1986. — С. 202-203.
3. Гительзон И.И. Эритрограммы как метод клинического исследования крови / И.И. Гительзон, И.А. Терсков. — Красноярск, 1959. — С. 10-35.
4. Котловский Ю.В. Взаимодействие метилмета-крилата и акриламида с системой микросомального окисления печени крыс / Ю.В. Котловский, А.Ю. Гришанова, В.В. Иванов // Вопросы медицинской химии.
— 1984. — Т. 30. — Вып. 5. — С. 44-46.
5. Котловский Ю.В. Гепатотоксичность и возможный механизм действия акриламида. Влияние ак-риламида на активность печеночно-специфических ферментов в сыворотке крови крыс / Ю.В. Котловс-кий, М.М. Тарских, В.В. Иванов // Фармакология и токсикология. Деп. в ВИНИТИ 24.02.88. — № 1490 —
В. 88. С.Н.
6. Меньшиков В.В. Лабораторные методы исследо-
вания в клинике / В.В. Mеньшиков. — M., 1987. — С. 107-108.
7. Новикова Е.Е. О токсическом действии акриламида при поступлении через кожные покровы / Е.Е. Новикова // Гигиена и санитария. — 1979. — № 10. —
С. 73-74.
8. Стальная И.Д. Ыетод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты / И.Д. Стальная, Т.Г. Гаришвили // Современные методы в биохимии. — M., 1977. — С. 63-64.
9. Тарских М.М. Роль процессов перекисного окисления липидов биомембран и цитохрома Р-450 в патогенезе отравления акрилатами / M.M. Тарских, С.Б. Большаков, Ю.П. Лужков, В.Е. Педяшов // Ыеханиз-мы патологических реакций. — Томск, 1988. — Т. 5.
— С. 156-159.
10. Функциональная характеристика эритроцитов при острых и хронических поражениях печени / Л.Ф. Блюгер, Э.З. Крупникова, В.Ю. Сондоре // Успехи ге-патологии. — Рига, 1983. — Т. 11. — С. 53-66.
11. Acrilamide / Environmental Health Criteria 49.
— Geneva: WHO, 1985. — P. 42-61.
12. Guengerich P.P. Enzymatic activation of chemicals to toxic metabolites / F.P. Guengerich, D.S. Lieber // CRC Crit. Rev. Toxicol. — 1985. — Vol. 14. — № 3. -P. 259-307.
