CC BY
133
МЕМБРАННОЕ ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ БИОМОЛЕКУЛ ПРИ ПРОМЫШЛЕННОМ ИЗГОТОВЛЕНИИ БИОПРЕПАРАТОВ
В.М. Безгин, В.Е. Козлов
Аннотация. Представлены материалы исследований технологических параметров процесса мембранного фракционирования туберкулинов. Показано, что удаление высокомолекулярной фракции из препарата повышает удельное содержание белка и специфичность диагностикума, одновременно снижая реактогенность аллергена. Продемонстрирована перспективность применения методов мембранной технологии в целях увеличения экономической эффективности и экологической безопасности производства.
Ключевые слова: биотехнология, аллергены, белки, высокомолекулярная фракция туберкулина, специфичность, реактогенность, ультрафильтрация, диафильтра-ция, микрофильтрация.
Одной из наиболее распространённых стадий процесса промышленного производства препаратов на основе биологического сырья является фракционирование целевого продукта и удаление низкомолекулярных или высокомолекулярных примесей. До конца прошлого столетия указанный этап осуществлялся, как правило, дробным осаждением с использованием этилового спирта, трихлоруксусной кислоты, сульфатов, полиэти-ленгликоля.
В настоящее время арсенал традиционных методов очистки биологически активных веществ значительно расширился за счёт применения мембранной технологии [2, 4]. Безреагентность, исключение фазовых переходов и применения дополнительных растворителей, энергосбережение, экологическая чистота, простота технологического оформления обусловили высокую конкурентоспособность и широкое применение мембранных процессов в таких секторах индустрии, как фармацевтической, пищевой, биотехнологической [1, 3].
Большинство внедрённых в промышленность мембранных технологий основано на ультрафильтрации, диафильтрации и микрофильтрации. Ультрафильтрация позволяет разделять высокомолекулярные и низкомолекулярные компоненты смеси с молекулярной массой от 1 кДа до 1000 кДа, проводить фракционирование и концентрирование высокомолекулярных компонентов, и таким образом охватывает практически все сепараци-онные проблемы, возникающие при очистке белков. Наиболее эффективно применение ультрафильтрации в тех случаях, когда исходный продукт необходимо разделить на два целевых, значительно различающихся по молекулярной массе соединения. Однако чаще в биотехнологических процессах при использовании ультрафильтрации целевой продукт остаётся в концентрате. При этом варианте на установке концентрирования можно проводить очистку продукта в режиме диа-фильтрации - приёме мембранного фракционирования, при котором в препарат постоянно или периодически подают растворитель, одновременно осуществляя отвод пермеата, содержащего примеси с размером ниже номинальной отсекаемой молекулярной массы (НОММ) используемой мембраны.
Микрофильтрационные процессы в биотехнологии широко применяют при отделения крупных коллоидных частиц или взвешенных микрочастиц размером от 0,1 до 10,0 мкм. Соответственно микрофильтрация используется в качестве основной стадии при стерилизации растворов методом фильтрования или в качестве предварительной стадии фракционирования растворов методом ультрафильтрации - в целях повышения эффективности работы мембран с невысокими показате-
лями НОММ и соответственно производительности процесса.
Широкое внедрение мембранных процессов в биотехнологическое производство позволило предложить новые подходы к выделению и очистке вирусов, белковых фракций, иммунологически значимых компонентов микроорганизмов.
Наши исследования были направлены на разработку комплекса методов мембранного фракционирования микобактериальных аллергенов, включающего ультрафильтрацию, диафильтрацию и микрофильтрацию.
Экспериментальную часть работы проводили на базе научно-производственного центра и производственных подразделений ФГУП «Курская биофабрика».
Реализация метода мембранной технологии получения туберкулинов обусловила необходимость создания аппаратурного обеспечения процесса, состоящего из трёх блоков: реакторного блока, установки микрофильтрации и блока ультрафильтрации-диафильтрации.
Микрофильтрацию исходной культуральной жидкости микобактерий осуществляли на половолоконных модулях «Микроза» с размером пор 0,1 мкм и поверхностью мембран 6 м2. Полученный пермеат мог быть использован на следующем этапе - ультрафильтрационном концентрировании белков на кассетных модулях с мембранами НОММ 3 кДа. После осаждения белка трихлоруксусной кислотой и сульфатом аммония на этих же кассетных модулях проводили диафильтрацию концентрата туберкулина. Вышеперечисленные методы мембранного фракционирования позволили получить препарат, соответствующий требованиям НТД, при этом снижен расход химических реагентов (трихлорук-сусной кислоты) более чем на 80 %, исключены из технологии асбестоцеллюлозные шихтные фильтры, сокращено время очистки белкового препарата, на 25 % увеличен выход конечной продукции.
Дополнительно применение методов мембранного фракционирования позволило улучшить основные качественные характеристики аллергенов: специфичность и реактогенность.
За развитие неспецифических иммунных реакций в значительной степени ответственна высокомолекулярная фракция туберкулина [5]. Для очистки раствора концентрата туберкулина от высокомолекулярной фракции был разработан процесс ультрафильтрационного фракционирования белков туберкулина. Данный этап проводили в режиме прямого концентрирования при постоянном отводе пермеата, при этом выявили преимущества мембран с НОММ 100 и 300 кДа.
При анализе биохимического состава и иммунобиологических свойств различных вариантов туберкулиновых фракций (таблица 1) установлено, что туберкулины, освобождённые от высокомолекулярных соединений, характеризовались достоверно большим удельным содержанием белка и более низкой активностью в гетеро-логичной системе. В соответствии с международными нормативными документами [6] специфичность аллергенов оценивается как отношение активности препарата в гетерологичной системе к его активности в гомологичной системе. Максимально допустимая величина данного показателя - 10 %. Как видно из данных таблицы 1, препараты № 2 и 3, не содержавшие высокомолекулярных фракций, продемонстрировали уровень специфичности - 3 % - 5 %, тогда как высокомолекулярные фракции с высоким содержанием полисахаридов и липидов (№№ 5 - 7) характеризовались уровнем специфичности в пределах - 10 % - 17 %.
Одним из важных методов контроля качества ту-беркулинов является определение их реактогенности. Он заключается в оценке диаметров ответных реакций, развивающихся у интактных морских свинок на введение завышенной дозы туберкулина. Здоровым морским свинкам внутрикожно вводили 500 МЕ туберкулина (дозу туберкулина, соответствующую 25 % величины дозы для крупного рогатого скота). При введении животным туберкулинов, полученных с применением мембранной технологии, выраженность ответных реак-
Показано достоверное различие биохимического состава туберкулиновых препаратов, полученных с использованием мембранного фракционирования по сравнению с туберкулином, изготовленным без применения мембранной технологии. Установлено, что применение методов мембранной технологии при изготовлении туберкулина позволяет повысить его специфичность, при этом в препарате достоверно увеличивается доля белковых соединений и снижается содержание липидов и полисахаридов.
Список использованных источников
1 Горячий Н.В., Свитцов А.А. Использование мембранной технологии в производстве пектина // Крит. технол. мембраны. - 2006. - № 1. - С. 34 - 37.
2 Дубяга В.П., Бесфамильный И.Б. Нанотехнологии и мембраны // Крит. технол. мембраны. - 2005. - № 3. - С. 11 -16.
3 Использование мембранной технологии для концентрирования и очистки ферментных растворов пектинлиазы / А.Ю. Ежова, Э.А. Шишкова, Г.Б. Бравова, Е.А. Нестеренко // Биотехнология. - 2001. - № 5. - С. 45-50.
4 Использование мембранной технологии для концентрирования и очистки ксиланазы Trichoderma viride и некоторые свойства ферментного препарата / Л.Н. Ларина, Н.М. Павлова, Э.А. Шишкова и др. // Биотехнология. - 2005. - № 4. - С. 38 - 46.
5 Мясоедов Ю.М. Изучение биохимических и биологических свойств ППД туберкулина для млекопитающих и его стандартизация: дис. ... канд. биол. наук: 03.00.04, 16.00.03 / Курская государственная сельскохозяйственная академия им. проф. И.И. Иванова. - Курск, 2006. - 115 с.
6 Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. - 7th ed. - Vols. 1 and 2, 2012. - 1187 p.
Информация об авторах
Безгин Вячеслав Михайлович, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой ветеринарно-санитарной экспертизы и биотехнологии ФГБОУ ВПО «Курская ГСХА», тел. (4712) 53-91-68, е-mail: biok@biok.ru
Козлов Владимир Егорович, доктор биологических наук, профессор кафедры ветеринарно-санитарной экспертизы и биотехнологии ФГБОУ ВПО «Курская ГСХА», тел. (4712) 5391-77, е-mail: biok@biok.ru
ций на указанную дозу у животных была достоверно ниже (2,6 мм + 0,7 мм) уровня реакций, развивавшихся на введение аналогичных доз туберкулинов, изготовленных по традиционной технологии (7,1 мм + 1,1 мм).
Таким образом, применение комплекса методов мембранного фракционирования белков позволяет, за счёт снижения содержания в туберкулине балластных антигенов, повысить специфичность и уменьшить реак-тогенность аллергена с одновременным повышением выхода конечного продукта.
Таблица 1 - Сравнительный анализ биохимических и биологических характеристик туберкулиновых фракций, полученных ^ промышленным способом с применением метода мембранного фракционирования_
Номер Наименование препарата Содержание (% к сухому веществу) Биологические показатели
белки полисахариды липиды активность, МЕ/мг специфичность, %
1 Концентрат белка, изготовленный по традиционной технологии, -контроль, п = 7 74,0 4,9 6,0 10000 ± 750 9,5 ± 1,9
2 Концентрат белка с м.м. 3-100 кДа, п = 7 86,0 2,5 3,0 12500 ± 520 3,5 ± 0,7
3 Концентрат белка с м.м. 3-300 кДа, п = 7 84,5 2,5 3,0 12800 ± 424 4,0 ± 0,8
4 Концентрат белка с м.м. 3-1000 кДа, п = 8 81,0 3,0 3,5 13200 ± 590 6,0 ± 0,6
5 Высокомолекулярная фракция с м.м. > 100 кДа, п = 7 69,5 9,0 9,5 14680 ± 552 14,0 ± 3,5
6 Высокомолекулярная фракция с м.м. > 300 кДа, п = 7 69,0 9,0 9,0 14900±612 13,5 ± 3,5
7 Высокомолекулярная фракция с м.м. > 1000 кДа, п = 8 66,9 8,0 10,0 15870 ± 670 12,0 ± 2,5
