CC BY
68
Экспериментальная биология и медицина УДК 616-092.18;616-092.9
МЕКСИДОЛ КАК РЕГУЛЯТОР КАСПАЗОЗАВИСИМОЙ АПОПТОТИЧЕСКОЙ ГИБЕЛИ КЛЕТОК МИОКАРДА ПРИ АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИИ РАЗЛИЧНОГО ГЕНЕЗА
© Азова М.М., Благонравов М.Л., Гигани О.Б., Гигани О.О., Фролов В.А.
Кафедра общей патологии и патологической физиологии медицинского факультета Российского университета дружбы народов, Москва
E-mail: azovam@mail. ru
Исследована активность каспазы 3 и каспазы 8 в миокарде левого желудочка сердца кроликов с вазоренальной артериальной гипертензией и спонтанно -гипертензивных крыс после 10-дневного применения мексидола. Обнаружено, что мексидол предупреждает активацию каспаз, наблюдаемую при вторичной и генетически обусловленной артериальной гипертензии. Следовательно, применение антигипоксантов и антиоксидантов может стать важным звеном профилактики и лечения хронической сердечной недостаточности при артериальной гипертензии.
Ключевые слова: апоптоз, каспаза, артериальная гипертензия, миокард, мексидол.
MEXIDOL AS A REGULATOR OF CASPASE-DEPENDENT APOPTOSIS OF MYOCARDIAL CELLS
IN ARTERIAL HYPERTENSION Azova M.M., Blagonravov M.L., Gigani O.B., Gigani O.O., Frolov V.A.
Department of General Pathology & Pathophysiology of the Medical Faculty of the Peoples’ Friendship University of Russia, Moscow Caspase 3 and caspase 8 activities were investigated in the left ventricular myocardium of rabbits with vasorenal arterial hypertension and spontaneously hypertensive rats after 10- day administration of Mexidol. It was revealed that Mexidol prevented caspase activation which was observed under secondary and genetic hypertension. Thus, administration of antihypoxic and antioxidant drugs could become an important part of prevention and treatment of heart failure in arterial hypertension. Keywords: apoptosis, caspase, arterial hypertension, myocardium, Mexidol.
В последнее время все большее внимание уделяется исследованию механизмов формирования сердечной недостаточности при тех или иных видах гипертензивного повреждения сердца. Так, существует мнение, согласно которому одним из факторов, способствующих развитию ХСН, является апоптоз кардиомиоцитов (КМЦ) [3]. Результаты наших собственных исследований и данные других авторов свидетельствуют о повышении интенсивности апоптотических процессов в миокарде желудочков сердца при различных формах артериальной гипертензии (АГ) [1, 9, 13].
Всестороннее изучение механизмов инициации и регуляции программированной гибели клеток (ПКГ) миокарда необходимо для разработки новых подходов к лечению заболеваний сердечнососудистой системы. На сегодняшний день предложено несколько способов прямого подавления апоптоза: ингибирование каспаз, блокада Ра8-рецепторов и др. [12]. Однако неселективная супрессия апоптотической гибели может привести к сохранению в организме генетически дефектных и функционально неполноценных клеток. Следует учитывать и тот факт, что усиление ПКГ указывает на существенные нарушения внутриклеточных процессов, поэтому подавление не самой гибели клеток, а механизмов, создаю-
щих условия для индукции данного процесса, представляется более целесообразным.
Известно, что повышение интенсивности апоптоза КМЦ может быть вызвано различными факторами, в том числе хронической перегрузкой желудочков сердца, обусловленной АГ, гипоксией, действием свободных радикалов и т.д. [13]. В этой связи мы полагаем, что одним из эффективных методов воздействия на клетки миокарда при АГ может быть применение антигипоксантов и антиоксидантов.
В настоящее время для преодоления последствий гипоксии применяются, в частности, медикаментозные средства, обеспечивающие высокую активность сукцинатоксидазного звена энергетического обмена. Антигипоксическое действие сукцината было доказано как в эксперименте, так и при клинических исследованиях [2, 8]. Однако экзогенный сукцинат с трудом проникает через клеточные мембраны, в связи с чем необходимо использование препаратов, представляющих собой комплекс сукцината с этилметилгидроксипи-ридином, облегчающим его транспорт в клетку. К их числу относится мексидол, который является не только мощным антигипоксантом [5, 7, 10], но и обладает присущими 3-оксипиридинам антиок-сидантными свойствами [2, 4]. Он подавляет свободнорадикальное окисление липидов, а также
повышает активность антиоксидантных ферментов, в частности супероксиддисмутазы [6]. Мек-сидол используется в клинической практике при остром нарушении мозгового кровообращения, черепно-мозговых травмах, дисциркуляторной энцефалопатии, синдроме вегетативной дистонии, абстинентном синдроме при алкоголизме и др. Также следует отметить, что в эксперименте было показано выраженное кардиопротекторное действие препарата при моделировании инфаркта миокарда у крыс [5].
Целью данной работы является изучение влияния мексидола на активность каспазы 3 и каспа-зы 8, относящихся к проапоптотическим ферментам, в клетках миокарда левого желудочка (ЛЖ) сердца при генетически обусловленной и вторичной вазоренальной АГ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследование выполнялось на 24 самцах кроликов шиншилла массой тела 3-3,5 кг и 24 самцах крыс линий 8НЯ и '^81аг-Куо1;о 15-недельного возраста.
На кроликах изучали влияние мексидола на активность отдельных звеньев каспазного каскада в клетках миокарда ЛЖ при вторичной вазоре-нальной АГ. Эксперимент проводился в двух параллельных сериях, каждая из которых включала 2 группы животных: 1. кролики с вазоренальной АГ сроком 4 недели (опытная группа); 2. интакт-ные кролики (контроль). АГ у кроликов опытных групп моделировали по Н. ОоЫЫай [14] путем сужения брюшной аорты на 1/3 от исходного диаметра над местом отхождения от нее почечных артерий. В I серии эксперимента животные не получали лечения. Во II серии кроликам опытной группы начиная с 18 суток АГ вводился внутримышечно мексидол (действующее вещество этилметилгидроксипиридина сукцинат) в дозе 5 мг/кг веса 1 раз в сутки в течение 10 дней.
По аналогичной схеме проводился эксперимент на крысах, цель которого заключалась в исследовании действия мексидола на активность каспаз в миокарде ЛЖ при генетически обусловленной АГ. Опытные группы были представлены 15-недельными спонтанно-гипертензивными крысами линии 8НИ, а контрольные группы -нормотензивными крысами линии '^81аг-Куо1;о того же возраста. Во II серии крысам опытной группы за 10 дней до достижения ими 15недельного возраста начинали ежесуточное внут-рибрюшинное введение мексидола в дозе 5 мг/кг.
Каждая исследованная группа включала в себя 6 животных.
У животных контрольных и опытных групп (в соответствующие сроки эксперимента) под общим обезболиванием вскрывали грудную клетку и проводили экстирпацию сердца. Далее из стенки ЛЖ выделяли фрагмент миокарда массой 200250 мг для биохимического исследования.
Содержание животных и работа с ними проводились в соответствии с приказом Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977 г.
Лизаты ЛЖ сердца кроликов и крыс, полученные посредством гомогенизации фрагмента миокарда в среде выделения (20 мМ HEPES, pH 7.5, 10 мМКС1, 1.5 мМ MgCl2, 1 мМ ДТТ), к которой добавляли коктейль ингибиторов протеаз (104 мМ AEBSF, 0.08 мМ апротинин, 1.5 мМ пеп-статин А, 2 мМ лейпептин, 4 мМ бестатин, 1.4 мМ Е-64) в соотношении 100:1 (все реактивы были произведены фирмой "Sigma", США), с последующим центрифугированием при 15000 g в течение 30 минут при температуре +4° С, использовали для оценки активности каспазы 3 и каспазы
8. Активность данных ферментов определяли колориметрическим методом с помощью наборов "Caspase 3 AssayKit, Colorimetric" и "Caspase 8 AssayKit, Colorimetric" ("Sigma", США).
Исследования проводились на оборудовании Центра коллективного пользования (НОЦ) РУДН и кафедры общей патологии и патологической физиологии медицинского факультета РУДН.
Для оценки достоверности различий изучаемых выборок применяли критерий Манна-Уитни.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В табл. 1 представлены результаты оценки активности каспаз в миокарде ЛЖ сердца кроликов контрольных и опытных групп.
Как видно из табл. 1, активность каспазы 3 в клетках миокарда ЛЖ значимо повышается у кроликов с 4-недельной АГ, активность же каспазы 8, хотя и проявляет выраженную тенденцию к повышению, достоверно от контрольного значения не отличается (I серия эксперимента), что указывает на индукцию каспазного каскада преимущественно по внутреннему сигнальному пути. В этой связи во II серии эксперимента при оценке влияния мексидола на программированную гибель клеток миокарда мы определяли только активность каспазы 3.
У крыс линии SHR с генетически обусловленной АГ к 15-недельному возрасту по сравнению с контролем достоверно повышается активность как каспазы 3, так и каспазы 8 (табл. 2, I серия эксперимента), что свидетельствует об участии внешнего (рецепторного) пути в активации
Таблица І
Активность каспазы 3 и каспазы S в миокарде левого желудочка сердца кроликов при вазоренальной артериальной гипертензии (M±m)
Показатель I серия эксперимента II серия эксперимента
Контроль 4-недельная артериальная гипертензия Контроль 4-недельная артериальная гипертензия + мексидол
Каспаза 3, нмоль/(мин*мл) 0,27±0,0З 0,36±0,02* 0,2З±0,02 0,2З±0,02
Каспаза S, нмоль/(мин*мл) 0,99±0,І6 i,39±0,ii не определяли не определяли
Примечание: * - показатель достоверно отличается от контроля при р<0,05
Таблица 2
Активность каспазы 3 и каспазы 8 в миокарде левого желудочка сердца крыс (М±т)
Показатель I серия эксперимента II серия эксперимента
Контроль 15-нєдєльньіє SHR Контроль 15-недельные SHR + мексидол
Каспаза 3, нмоль/(мин*мл) 0.iS±0.02 0.27±0.03* 0,20±0,03 0,23±0,03
Каспаза S, нмоль/(мин*мл) І.06±0.ІЗ i.6i±0.06* 0,5І±0,І0 0,76±0,09
Примечание: * - показатель достоверно отличается от контроля при р<0,05
каспазозависимого апоптоза КМЦ у спонтанно-гипертензивных крыс.
Отсутствие во II серии эксперимента достоверных отличий в активности каспазы 3 у животных контрольных и опытных групп указывает на способность мексидола предупреждать повышение интенсивности каспазозависимой апоптоти-ческой гибели клеток миокарда желудочков сердца при вазоренальной и генетически обусловленной АГ. Более того, у спонтанно-гипертензивных крыс мексидол препятствует активации рецепторного сигнального пути индукции ПКГ, что подтверждается отсутствием статистически значимого увеличения активности каспазы 8.
На основании результатов, полученных в ходе выполнения эксперимента, можно предположить, что энергетический дефицит в КМЦ, связанный с увеличением нагрузки на сердечную мышцу и развивающейся гипертрофией, способствует снижению мембранного потенциала митохондрий и, как следствие, открытию пор и высвобождению проапоптотических факторов, стимулируя апоптотическую гибель клеток миокарда. Наряду с этим, как гипоксия, так и перегрузка сердца сопровождаются образованием свободных радикалов и повышенной экспрессией Fas-рецептора на поверхности КМЦ [11], что создает условия для инициации рецепторно-опосредованной клеточной гибели [15].
Таким образом, окислительный стресс, возможно, в большей степени активирует внешний
(рецепторный) путь индукции каспазного каскада, в то время как энергодефицит способствует возникновению внутреннего (митохондриального) апоптогенного сигнала. Следовательно, применение антигипоксантов и антиоксидантов, к числу которых относится мексидол, может стать важным слагаемым профилактики и лечения хронической сердечной недостаточности при АГ различного генеза.
Работа выполнена в рамках Федеральной целевой программы «Научные и научнопедагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг.
ЛИТЕРАТУРА
1. Азова М.М., Благонравов М.Л., Фролов В.А. Активность каспазы 3 и каспазы 8 в клетках миокарда правого желудочка при экспериментальной артериальной гипертензии // Вестник РУДН. Серия Медицина. - 2011. - № 4. - С. 44-47.
2. Андреева Н.Н. Экспериментальные и клинические аспекты применения мексидола при гипоксии // Медицинский альманах. - 2009. - Т. 4, № 9. -С. 193-197.
3. Бершова Т.В., Монаенкова С.В., Гасанов А.Г. Патогенетическое значение апоптоза кардиомиоци-тов при сердечной недостаточности // Педиатрия. - 2009. - Т. 88, № 1. - С. 147-154.
4. Воронина Т.А. Антиоксидант мексидол. Основные нейропсихотропные эффекты и механизм дей-
ствия // Психофармакол. Биол. Наркол. - 2001. -Т. 1, № 1. - С. 2-12.
5. Гацура В.В., Пичугин В.В., Сернов Л.Н. Противо-ишемический кардиопротекторный эффект мексидола // Кардиология. - 1996. - Т.36, № 11. - С. 5962.
6. Дюмаев К.М., Воронина Т.А., Смирнов Л.Д. Антиоксиданты в профилактике и терапии патологий ЦНС. - М.: 1995. - 272 с.
7. Лукьянова Л.Д. Фармакологическая коррекция митохондриальной дисфункции при гипоксии. В кн.: Проблемы гипоксии: молекулярные, физиологические и медицинские аспекты / Под ред. Л.Д. Лукьяновой, И.Б. Ушакова. - Воронеж: Изд-во Истоки. - 2004. - С. 456-484.
8. Мутускина Е.А., Заржецкий Ю.В., Трубина И.Е. О возможности уменьшения постреанимационной патологии посредством препаратов янтарной кислоты. В кн.: Экспериментальные, клинические и организационные проблемы общей реаниматологии / Под ред. В.А. Неговского. - М.: Изд-во НИИ общей реаниматологии РАМН. - 1996. - С. 195205.
9. Фролов В.А., Дроздова Г.А., Мустяца В.Ф., Благонравов М.Л. Гипотензивная терапия и сердце. -М.: Издательство РУДН. - 2009. - 292 с.
10. Чернобаева Г.Н., Романова В.Е., Дудченко А.М., Германова Э.Л.Антигипоксические эффекты и механизмы действия некоторых производных 3 -оксипиридинов. В кн.: Итоги науки и техники. Серия Фармакология. Химиотерапевтические средства / Под ред. Л.Д. Лукьяновой. - М.: ВИНИТИ. -1991. - Т. 27. - С. 26-39.
11. Cheng W., Li B., Kajstura J et al. Stretch-induced programmed myocyte cell death // J.Clin. Invest. -1995. - N 96. - Р. 2247-2259.
12. Fischer U., Schulze-Osthoff K. New approaches and therapeutics targeting apoptosis in disease // Pharmacol. Rev. - 2005. - N57. - Р. 187-215.
13. Fortuno M.A., Ravassa S., Fortuno A. et al. Cardio-myocyte apoptotic cell death in arterial hypertension. Mechanisms and potential management // Hypertension. - 2001. - N38. - P. 1406-1412.
14. Goldblatt H., Kahn J.R. Experimental hypertension: construction of the aorta at various levels // J. A.M.A. - 1938. - N 9. - P. 685.
15. Nitobe J., Yamaguchi S., Okuyama M. et al. Reactive oxygen species regulate FLICE inhibitory protein (FLIP) and susceptibility to Fas-mediated apoptosis in cardiac myocytes // Cardiovasc. Res. - 2003. - Vol. 57, N 1. - Р. 119-128.
