CC BY
51
УДК 621.318.4:616
МЕХАНОМАГНІТНИЙ РЕАКТОР ДЛЯ АКТИВАЦІЇ ПРОТИПУХЛИННИХ ПРЕПАРАТІВ
B. Е. Орел1 2
0. Ю. Рихальський1 2 А. Д. Шевченко3
Ю. А. Кондратова4 А. П. Бурлака5
C. М. Лукін5
1. Б. Щепотін1
Національний інститут раку МОЗ України, Київ 2Національний технічний університет України «Київський політехнічний інститут»
3Інститут металофізики ім. Г. В. Курдюмова НАН України, Київ 4ПАТ «Фармак», Київ
5Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р. Є. Кравецького НАН України, Київ
E-mail: v-orel@voliacable.com
Отримано 01.08.2013
Використання механомагнітохімічної активації дає змогу підвищити концентрацію парамагнітних центрів (вільних радикалів) у протипухлинному препараті, наприклад доксорубіцині, що уможливлює безпосередній вплив на його магнітні властивості під дією зовнішнього електромагнітного поля і, як результат, поліпшення магнітної чутливості та протипухлинної активності. У роботі викладено принципи конструкції та роботи механомагнітного реактора для реалізації цієї технології, що полягає у комбінації впливу механомагнітохімічної активації та електромагнітного опромінення. Досліджуючи вплив механомагнітохімічної активації на доксорубіцин, використовували методи вібраційної магнітометрії, спектроскопії електронного парамагнітного резонансу та високоефективної рідинної хроматографії.
Результати проведених досліджень показали, що в конструкції механомагнітного реактора доцільно використовувати генератор електромагнітного поля із синусоїдальною формою сигналу, робочі камери з капролактану, фторопласту або з органічних матеріалів із металевими вставками, а також робочі тіла зі сталі або агату залежно від необхідних магнітних властивостей доксорубіцину. Під впливом механомагнітохімічної активації доксорубіцин, який є діамагнетиком, набуває властивостей парамагнетика, не змінюючи розподілу д-фактора у спектрах електронного парамагнітного резонансу. Одержані результати свідчать про перспективу використання технології механомагнітохімічної активації доксорубіцину в терапії злоякісних новоутворень, зокрема її цілеспрямованого застосування у разі нанорозмірних магнітних структур та зовнішнього електромагнітного опромінення.
Ключові слова: вільні радикали, доксорубіцин, механомагнітохімічна активація.
Експериментальні та клінічні дослідження, що їх здійснено за останнє десятиріччя, свідчать про перспективу використання як протипухлинних препаратів магніточутливого нанокомплексу (НК) на основі нано-частинок оксидів заліза магнетиту (Ее304) і протипухлинного антибіотика антрациклі-нового ряду доксорубіцину (ДР) [1, 2].
Найпоширеніші способи синтезу НК — окиснення, хемосорбція на поверхні нано-частинок, спрямована модифікація поверхні, термоліз, механохімічна активація тощо. Для підвищення стійкості колоїдної системи в розчині та біосумісності ядра наночас-тинки оксиду заліза покривають органічною речовиною для зв’язування за допомогою електростатичних (іонних) зв’язків з ДР. Тому модифікований поверхневий шар НК може мати зовсім інші магнітні характеристики, ніж ядро, що може спричинити знач-
ні зміни фізико-хімічних характеристик препарату [3].
У раніше проведених пілотних дослідженнях було показано, що механохімічно активований ДР у комбінації з електромагнітним опроміненням за фізіологічних температур має значно вищий протипухлинний ефект, ніж офіцинальний препарат, унаслідок утворення додаткових цитотоксичних вільних радикалів [4]. На основі цього було розроблено технологію механомагніто-хімічної активації (ММХА) наночастинок Ее304 і ДР, що полягає у комбінації впливу механохімічної активації та електромагнітного опромінення композиту магнітних мікро- і наночастинок та протипухлинного препарату [5]. Використання цієї технології сприяє підвищенню концентрації парамагнітних центрів (вільних радикалів) у препараті, що дає змогу безпосередньо впливати на
магнітні властивості ДР під дією зовнішнього електромагнітного поля та поліпшувати його магнітну чутливість. Це, у свою чергу, уможливлює краще цілеспрямоване достав-лення препарату в пухлину та підвищення його ефективності.
У першому варіанті приладу для активації та створення нанокомплексу було використано механомагнітний реактор на базі лабораторного мікровібромлина MMVE-0.005 (Гефест, Росія). Однак його конструкція мала низку недоліків. По-перше — недостатня точність встановлення частоти вібрації та амплітуди коливань. По-друге — невелика надійність пристрою внаслідок застосування механічного принципу коливань. Окрім того, робочі камери та робочі тіла не були оптимальними з погляду максимізації магнітної чутливості НК під час ММХА.
У роботі описано модернізований механо-магнітний реактор і проведено дослідження матеріалів робочих тіл та камер, що їх використовують за ММХА, а також зміни фізико-хімічних властивостей ДР, який є протипухлинною субстанцією в НК.
Матеріали і методи
ММХА нанокомплексу проводили за допомогою модифікованого механомагнітного реактора (рис. 1) на базі медичного мікровіб-ромлина для механохімічної модифікації лікарських засобів «Лотос-3» («Лотос», Україна), в якому використано лінійний двигун [6]. Механомагнітний реактор складається з таких структурних блоків: механохіміч-ного реактора (мікровібромлина), постійних магнітів, індуктора, ВЧ-генератора, частотоміра, робочої камери та робочих тіл.
В реакторі було використано й досліджено робочі камери трьох типів і два типи робочих тіл, які зображено на рис. 2.
Як матеріали робочих камер для механо-магнітного реактора застосовували капро-лактан (Quadrant, Бельгія ), фторопласт Ф-4 («ЗАТ Фторопластовые технологии», Росія) та нержавіючу сталь 12Х18Н19Т. Робочими тілами слугували кульки з нержавіючої сталі марки 1.4112 та з агату (Retsch, Німеччина). Сталеві кульки мали твердість 55-57 HRC і такий хімічний склад: Fe — 76,5%, Cr — 19%, Mo — 1,3%, Mn — 1%, Si — 1%, C — 0,95%, V — 0,12%, P — 0,04%, S — 0,03%. Твердість агатових кульок становила 6,5-7 Mohs; хімічний склад: SiO2 — 99,91%, Al2O3 — 0,02%; Na2O — 0,02%, Fe2O3 — 0,01%, K2O — 0,01%, MnO — 0,01%, MgO —
0,01%, CaO — 0,01%.
Протипухлинний препарат доксорубі-цин-КМП («Артеріум, Київмедпрепарат», Україна) піддавали ММХА з інтенсивністю підводу механічної енергії 20 Вт/г за допомогою просторового коливання камери з кульками й одночасному електромагнітному опроміненню синусоїдальної форми з частотою 42 МГц і вихідною потужністю генератора 6 Вт та постійним магнітним полем 12 мТл протягом 5 хв або імпульсним електромагнітним полем з частотою 600 кГц та вихідною потужністю генератора 2 Вт і постійним магнітним полем 12 мТл також упродовж 5 хв.
Магнітні характеристики препарату досліджували методом магнітометрії на вібра-
Рис. 1. Механомагнітний реактор:
1 — механохімічний реактор (мікровібромлин); 2 — постійні магніти; 3 — індуктор; 4 — ВЧ-генератор; 5 — частотомір
Рис. 2. Робочі камери і тіла:
а — сталеву камеру вставлено в оболонку з поліметилметакрилату; б — фторопластова камера; в — капролактанова камера; г — камери у розібраному вигляді; д — сталеві робочі тіла; е — агатові робочі тіла
ційному магнітометрі Vibrating Magnetometer 7404 VSM (Lake Shore Cryotronics, Inc., США) у магнітних полях з напруженістю до 13 кЕ. Чутливість магнітометра становила 10 7 емо, що давало змогу виконувати виміри магнітного моменту на зразках масою до одиниць міліграмів. Масу досліджуваних зразків визначали за допомогою електронних мікроваг AB135-S/FACT з ав-токомпенсацією (METTLER TOLEDO, Швейцарія) чутливістю 10-5 г.
З метою дослідження стабільних вільних радикалів вивчали спектри та інтенсивність сигналу електронного парамагнітного резонансу (ЕПР) [7], які реєстрували на модернізованому спектрометрі марки РЕ1307 (ЗЕПС АН) за температури рідкого азоту (77 К) у циліндричному резонаторі з модою Н011, на частоті 9,15±0,01 ГГц. Потужність надвисокочастотного випромінювання становила 40 мВт. Використовували модуляцію магнітного поля частотою 100 кГц. Пробу розміщували у кварцовому дюарі з внутрішнім діаметром 4,5 мм. Об’єм проби — 500 мл.
Для перевірки можливої зміни фізико-хі-мічних властивостей ДР після ММХА проводили хроматографічні дослідження. Для доксорубіцину гідрохлориду їх здійснювали згідно з методикою [8]. Використовували хроматографічну колонку Kromasil 100 C-18 розміром 250х4 мм з розміром пор 5 мкм. Рухома фаза складалася з ацетонітрилу та буферного розчину, приготованого з 2,88 г/л натрію лаурилсульфату та 2,25 г/л фосфорної кислоти, 1:1. Зразки (5 мкл) досліджува-
ли на рідинному хроматографі Agilent 1200 (Agilent Technologies, США) за потоку рухомої фази 1 мл/хв та довжини хвилі 254 нм.
Для дослідження брали 1 мг ДР і розчиняли його у 2 мл дистильованої води, тобто концентрація речовини становила 0,5 мг/мл. Досліджувані методом хроматографії зразки було розділено на 4 групи: 1 — офіцинальний ДР; 2 — ДР після ММХА у капролактановій камері; 3 — ДР після ММХА у фторопластовій камері; 4 — ДР після ММХА у камері з органічних матеріалів із металевими вставками.
Результати та обговорення
Хроматографічні дослідження показали, що всі досліджувані зразки містять одну й ту саму речовину, оскільки час утримування основного піка збігався з контрольним зразком. Типові хроматограми розчинів, підготованих за різних умов, подано на рис. 3.
Результати вмісту ДР у досліджуваних зразках наведено в табл. 1.
Різниця в концентрації розчинів була зумовлена передусім технічними особливостями під час приготування зразків різними методами.
На хроматограмах розчинів після ММХА в капролактановій (Б) та фторопластовій (Б) камерах спостерігалося утворення домішки
з відносним часом утримання 0,9, відносна концентрація якої становила менше 1%.
У табл. 2 наведено зміни магнітних характеристик ДР під впливом ММХА з різними факторами механічного та електромагнітно-
Б
Рис. 3. Хроматограми розчинів: офіцинальний ДР (А) та після ММХА в капролактановій (Б), фторопластовій (В)
і розбірній камері з органічних матеріалів із металевими вставками (Г)
Таблиця 1. Вміст ДР у мг/мл після ММХА за результатами хроматографії
№ зразка Матеріал робочої камери Площа основного піка, mAU Вміст основної речовини (ДР), мг/мл
1. ОФ ДР — контроль - 3415,5±83 0,5±0,01
2. ММХА ДР Капролакт 3227,6±71 0,47±0,01
3. ММХА ДР Фторопласт 1437,4±24* 0,21±0,005*
4. ММХА ДР Камера із органічних матеріалів з металевими вставками 1941,4±31* 0,28±0,006*
Тут і далі: * — статистично значущі відмінності порівняно з офіцинальним ДР із рівнем значущості Р < 0,05. Таблиця 2. Зміни магнітних характеристик ДР під впливом ММХА
Матеріал Форма сигналу електромагнітного поля Питомий магнітний момент*, емо/г
камери робочих тіл
Контроль офіцинальний ДР (без ММХА) діамагнетик - - -0,012
Капролактан, парамагнетик Сталь Синусоїдний +0,024
Сталь, парамагнетик Сталь Синусоїдний +0,071
Фторопласт, парамагнетик Сталь Синусоїдний +0,053
Капролактан, парамагнетик Сталь Імпульсний +0,019
*Н = 3000 ерстед (напруженість магнітного поля).
го впливу. Аналіз цих результатів свідчить, що ДР у нативному стані є діамагнетиком. Після ММХА він набуває властивостей парамагнетика, магнітні властивості якого залежать від факторів механічного та електромагнітного впливу. Так, мінімальний питомий магнітний момент (+0,024 емо/г) був після активації ДР у камері з капролак-тану, а максимальний (+0,071 емо/г) — після використання сталевих кульок у сталевій камері. Зміна форми сигналу електромагнітного поля із синусоїдальної до імпульсної форми призводила до зниження питомого магнітного моменту ММХА ДР у капролак-тановій камері до +0,019 емо/г.
Проведені раніше пілотні дослідження магнітних характеристик ДР під впливом ММХА показали, що застосування як робочих тіл агатових кульок у камері з капролак-тану зумовлювало зниження питомого магнітного моменту досліджуваних зразків на 50% порівняно з ММХА у цій камері з використанням сталевих кульок (питомі магнітні моменти зразків становили +0,034 емо/г
з агатовими та +0,068 емо/г зі сталевими кульками). Оскільки зміни магнітного моменту мають однакові тенденції зі змінами концентрації парамагнітних центрів (вільних радикалів) у досліджуваних зразках [5], зниження питомого магнітного моменту за ММХА з агатовими кульками, у свою чергу, супроводжувалося зменшенням кількості парамагнітних центрів (вільних радикалів).
Як наслідок, це призводить до зміни цито-статичної активності препарату. Виходячи
із цього, у наступних дослідах не проводили повторне вимірювання магнітних характеристик зразків після ММХА з використанням агатових кульок. Питомий магнітний момент насичення був більший у разі використання сигналу електромагнітного поля синусоїдальної форми порівняно з імпульсною.
Для детальнішого вивчення набутих парамагнітних властивостей ММХА ДР було досліджено його ЕПР-спектри (рис. 4 і 5). Аналіз наведених даних свідчить, що ЕПР-спектри ДР були подібні, незалежно від використаних матеріалів кульок для ММХА. Вони мали типові для офіцинального ДР д-фактори 2,005, 2,003 та 1,97. Оскільки інтенсивність сигналу ЕПР ДР з д-фактором 2,003 була найбільшою порівняно із ДР з д-факторами 1,97 та 2,005 [4], наступні дослідження проводили саме із цим д-фактором. Інтенсивність сигналу ЕПР, яка залежить від кількості парамагнітних центрів після ММХА з використанням сталевих кульок, була на 22% вища, а з агатовими кульками — на 65% нижча, ніж в офіцинального ДР.
В основі зміни магнітних властивостей ДР, на нашу думку, лежать багатофактор-ні фізико-хімічні процеси. По-перше, це фазові переходи, що зумовлені впливом електричних і магнітних полів та механічних напружень [9]. По-друге — виникнення вихрових струмів між тілами, що контактують [10], з ефектом утворення вільних радикалів та іонів [11]. І, нарешті, третє — можливе перенесення молекулярних фрагментів сполук, що контактують між собою [12].
Рис. 4. Спектри ЕПР ДР:
офіцинальний ДР (1), ММХА з використанням сталевих (2) та агатових (3) кульок
У проведених експериментальних доклі-нічних дослідженнях показано, що ММХА ДР мав вищий протипухлинний ефект, ніж офіцинальний [10]. Це свідчить про можливу перспективу застосування технології ММХА ДР з наномагнітними структурами у терапії злоякісних пухлин за зовнішнього впливу локального електромагнітного поля [13].
Таким чином, у конструкції механомаг-нітного реактора доцільно використовувати лінійний двигун, генератор електромагнітного поля із синусоїдальною формою сигналу, а також капролактанові, фторопласто-
Рис. 5. Інтенсивність сигналу ЕПР ^-фактор 2,003):
офіцинальний ДР (1 ), ММХА з використанням сталевих (2) та агатових (3) кульок
ві або з органічних матеріалів з металевими вставками робочі камери зі сталевими або агатовими робочими тілами залежно від необхідних магнітних властивостей протипухлинного препарату (наприклад, ДР).
Під впливом ММХА офіцинальний ДР, який є діамагнетиком, набуває властивостей парамагнетика, не змінюючи розподілу д-фактора в спектрах ЕПР та фармакопейних властивостей за результатами високоефективної рідинної хроматографії, що свідчить про перспективу його використання для нанотерапії злоякісних новоутворень.
REFERENCES
1. Peng X. H., Qian X., Mao H,, Wang A. Y., Chen Z. G., Nie S., Shin D. M. Targeted magnetic iron oxide nanoparticles for tumor imaging and therapy. Int. J. Nanomed. 2008, 3(3), 311-321.
2. Chekhun V. F., Todor I. N., Lukyanova N. Y., Shpyleva S. I., Naleskina L. A., Khaetsky I. K., Kulik G. I. The use of nanoferromagnetics to increase the cytotoxic effect of antitumor drugs. Exp. Oncol. 2009, 31(3), 163-166.
3. Nicolais L., Carotenuto G. Metal-Polymer Nanocomposites. New York: Wiley Interscience. 2005,300 p.
4. Orel V. E., Kudryavets Yu. I., Bezdenezhnih N. N., Satz S., Danko M. I., Khranovskaya N. N.,Ro-manov A. V., Dzyatkovskaya N. N., Burlaka A. P. Mechanochemically activated doxorubicin nanoparticles in combination with 40 MHz frequency irradiation on A-549 lung carcinoma cells. Drug Deliv. 2005, N 12, 171-178.
5. Orel V. E., Shevchenko A. D., Mel’nik Yu. G., Nikolov N. A., Dzyatkovska I. I., Romanov A. V., Burlaka A. P., Lukin S. M., Uvarov V. N., Schepotin I. B. Physicochemical Characteristics of Magnetosensitive Nanocomplex Obtained by Mehanomagnetochemical Technology of Dry Synthesis. Metallofiz. Noveishie. Tekhnol. 2010, 32(9), 1157-1167. (In Ukrainian).
6. Patent № 80456, UA, A61J 3/02. Magneto-mechano-chemical nanoreactor. Orel V. E.,
RykhalskiyA. Y. Applied 27.12.2012; Published: 27.05.2013, Journal N 10. (In Ukrainian).
7. Gilbert B. C., Davies M. J. Electron Paramagnetic Resonance. — Cambridge: Royal society of Chemistry. 2006, 414 p.
8. European Pharmocopoeia 7.0. European Directorate for the Quality of Medicines & Health Care. Doxorubicin Hydrohloride. 2011, 1897-1898.
9. Glinchuk M. D., Ragulya A. V. Nanoferroics. Kyiv.: Naukova dumka. 2010, 311p. (In Russian).
10. Omote Y. An experimental attempt to potentiate therapeutic effects of combined use of pulsing magnetic fields and antitumor agents. Nippon Geka Gakkai Zasshi. 1988. 89(8), 1155-1166.
11. Orel V. E., Movchan B. O., Dzyatkovska I. I., Nikolov M. O., Romanov A. V., Mel’nik Yu. G., Dzyatkovska N. M., Burlaka A P., Lukin S. M. Research of influencing mechano- and mag-netochemically synthesized magnetosensitive complex on the basis of nanoparticles of Fe3O4, doxorubicin and electromagnetic irradiation on animals with Guerin carcinoma. Dopovidi Natsionalnoi Akademii Nauk Ukraini. 2010, N 8, 207-212.(In Ukrainian).
12. Makarova T. L. Magnetic properties of carbon structures. Semiconductors. 2004, 38(6), 615-638.
13. Cohen A. E. Nanomagnetic Control of Intersystem Crossing. J. Phys. Chem. 2009, V. 113,11084-11092.
МЕХАНОМАГНИТНЫЙ РЕАКТОР ДЛЯ АКТИВАЦИИ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ
В. Э. Орел1, 2, А. Ю. Рыхальский1 2,
А. Д. Шевченко3, Ю. А. Кондратова4,
А. П. Бурлака5, C. Н. Лукин5, И. Б. Щепотин1
Национальный институт рака МЗ Украины, Киев Национальный технический университет Украины «Киевский политехнический институт» 3Институт металлофизики им. Г. В. Курдюмова НАН Украины, Киев
4ПАО «Фармак», Киев 5Институт экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р. Е. Кравецкого НАН Украины, Киев
E-mail: v-orel@voliacable.com
Использование механомагнитохимической активации позволяет повысить концентрацию парамагнитных центров (свободных радикалов) в противоопухолевом препарате, например доксорубицине, что дает возможность непосредственно влиять на его магнитные свойства под действием внешнего электромагнитного поля и, как следствие, улучшить магнитную чувствительность и противоопухолевую активность. В работе изложены принципы конструкции и работы механомагнитного реактора для реализации этой технологии, заключающейся в комбинации влияния механомагнитной активации и электромагнитного облучения. При исследовании влияния механомагнитохимической активации на доксорубицин были использованы методы вибрационной магнитометрии, спектроскопии электронного парамагнитного резонанса и высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Результаты проведенных исследований показали, что в конструкции механомагнитного реактора целесообразно использовать генератор электромагнитного поля с синусоидальной формой сигнала, рабочие камеры из капролактана, фторопласта или из органических материалов с металлическими вставками, а также рабочие тела из стали или агата в зависимости от требуемых магнитных свойств доксорубицина. Под влиянием механомагнитохимической активации доксорубицин, являющийся диамагнетиком, приобретает свойства парамагнетика, не изменяя распределения g-факторов в спектрах электронного парамагнитного резонанса. Полученные результаты свидетельствуют о перспективе использования технологии механо-магнитохимической активации доксорубицина для терапии онкологических заболеваний, в частности ее целенаправленного применения в случае наноразмерных магнитных структур и внешнего электромагнитного облучения.
Ключевые слова: свободные радикалы, доксору-бицин, механомагнитохимическая активация.
MECHANOMAGNETIC REACTOR FOR ACTIVATION OF ANTICANCER DRUGS
V. E. Orel1,2, A. Y. Rykhalskiy1 2,,
A. D. Shevchenko3, Yu. A. Kondratova4,
A. P. Burlaka5, S. N. Lukin5, I. B. Schepotin1
1National Cancer Institute, Ministry of Medical Health, Kyiv, Ukraine
2National Technical University of Ukraine «Kyiv Polytechnic Institute», Kyiv 3Kurdyumov Institute for Metal Physics of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv
4PAC «Farmac», Department of Research and Development, Kyiv, Ukraine
5Kavetsky Institute of Experimental Pathology, Oncology and Radiobiology of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv
E-mail: v-orel@voliacable.com
Mechanomagnetochemical activation can increase the concentration of paramagnetic centers (free radicals) in the anticancer drug, for example, doxorubicin that enables to influence its magnetic properties under external electromagnetic field and improve its magnetic sensitivity and antitumor activity. The principles of design and operation of mechanomagnetic reactor for implementation of this technology which includes mechanomagnetochemical activation and electromagnetic radiation of the drug are described in the paper. The methods of vibration magnetometry, electron paramagnetic resonance spectroscopy and high-performance liquid chromatography were used for studying of doxorubicin mechanomagnetic activation effects.
The studies have shown that a generator of sinusoidal electromagnetic wave, working chambers from caprolactam, fluoroplastic or organic materials with metal inserts and working bodies made from steel or agate depending on the required doxorubicin magnetic properties are expedient to use in the designed mechanomagnic reactor. Under influence of mechanomagnetochemical activation doxorubicin, which is diamagnetic, acquires the properties of paramagnetic without changing g-factors in the spectra of electron paramagnetic resonance. Mechanomagnetochemical activation of doxorubicin satisfies pharmacopoeia conditions according to the results of liquid chromatography that points on perspective of this method using in technology of tumor therapy with nanosized structures and external electromagnetic radiation.
Key words: free radicals, doxorubicin,
mechanomagnetochemical activation.
