Механокомпозит диацетата бетулина и его противоопухолевая активность Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Journal of Siberian Federal University. Chemistry 2 (2013 6) 192-202

УДК 547.914.4+539.2:54+615.7

Механокомпозит диацетата бетулина и его противоопухолевая активность

С.А. Кузнецова3'5, Т.П. Шахтшнейдерв,г, М.А. Михайленков,г*, Ю.Н. Маляра, А.С. Замайа д, В.В. Болдыреввг

аИнститут химии и химической технологии СО РАН, Россия 660049 Красноярск, ул. К. Маркса, 42 бСибирский федеральный университет, Россия 660041, Красноярск, пр. Свободный, 79 вИнститут химии твердого тела и механохимии СО РАН, Россия 630128, Новосибирск, ул. Кутателадзе, 18 Научно-образовательный центр «Молекулярный дизайн и экологически безопасные технологии» при НГУ, Россия 630090, Новосибирск, ул. Пирогова, 2-125 дКрасноярский государственный медицинский университет

им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого, Россия 660022, Красноярск, ул. Партизана Железняка, 1

Received 24.11.2012, received in revised form 04.02.2013, accepted 19.02.2013

С использованием гельпроникающей хроматографии показано, что механохимическая обработка арабиногалактана (АГ) в смеси с диацетатом бетулина (ДАБ) в шаровой мельнице приводит к изменению молекулярно-массового распределения (ММР) АГ. После растворения механоактивированной (МА) смеси в воде и испарения растворителя присутствие ДАБ способствует восстановлению ММР. Предположено образование межмолекулярного комплекса ДАБ с АГ при растворении исходных и МА смесей в воде. Показано, что механокомпозиты ДАБ с АГ обладают способностью индуцировать в асцитных клетках карциномы Эрлиха процессы клеточной элиминации, опосредованные нарушением ионного гомеостаза.

Ключевые слова: диацетат бетулина, арабиногалактан, механохимическая обработка, растворение, гель-проникающая хроматография, противоопухолевые свойства.

© Siberian Federal University. All rights reserved Corresponding author E-mail address: ksa@icct.ru

*

ен,

СНзСОО

ей, енз

Рис. 1. Структурная формула диацетата бетулина

СН2ОСОСН3

Сложный эфир уксусной кислоты и бетулина - диацетат бетулина (Сз4Н54О4, 3р,28-диацетокси-луп 20(29)-ен) - получают из бересты берёзы. Он проявляет гепатопротекторные, гиполипидемические, желчегонные, антиоксидантные свойства и перспективен для фармации [1-5]. Одной из причин, ограничивающей его использование, считается плохая растворимость в воде и физиологических растворах (рис. 1).

Механическая активация лекарственных субстанций в присутствии вспомогательных веществ служит одним из способов увеличения скорости растворения и растворимости лекарственных препаратов с целью повышения их биодоступности [6, 7]. В результате механической активации происходит разупорядочение кристаллической структуры лекарственных веществ и их диспергирование в матрице носителя с образованием композиционных материалов, что способствует увеличению скорости растворения и растворимости субстанций.

Ранее нами было показано [8, 9], что механическая активация бетулина в смесях с водорастворимыми полимерами - поливинилпирролидоном (ПВП) и полиэтиленгликолем (ПЭГ) -приводит к образованию композитов, для которых характерно разупорядочение структуры бетулина и взаимодействие его с носителями. При растворении механокомпозитов в воде концентрация бетулина в растворе выше, чем при растворении исходного бетулина. Однако механическая обработка ДАБ с ПВП и ПЭГ не привела к повышению его растворимости, что, возможно, связано с тем, что при механической обработке с полимерами ДАБ не переходит в разупорядоченное состояние и не образует молекулярных комплексов с ПВП и ПЭГ [8]. В связи с этим представляло интерес исследовать влияние других полимеров на свойства ДАБ в механоактивированных смесях.

Арабиногалактан (АГ) - водорастворимый природный полисахарид, выделяемый из древесины лиственницы, обладающий комплексом уникальных свойств [10]. Макромолекула АГ имеет разветвленное строение: главная цепь состоит из звеньев галактозы, соединенных гликозидными связями р-(1—>3), а боковые цепи со связями р-(1—>6) - из звеньев галактозы и арабинозы, из единичных звеньев арабинозы, а также уроновых кислот, в основном глюкуро-новой (рис. 2). Определение молекулярной массы АГ различными методами дает результаты, отличающиеся в два и более раза. Столь существенные различия позволили предположить, что макромолекулы АГ существуют в компактной, вероятно, сферической форме. АГ может

Рис. 2. Фрагмент структуры арабиногалактана

использоваться в качестве стабилизатора, наполнителя, носителя для лекарственных субстанций. При этом большое влияние на качество и свойства этого полимера оказывает его молекулярная масса.

В работах [11-13] методами гельпроникающей хроматографии и ЯМР-спектроскопии показано, что механохимическая активация АГ в планетарной мельнице АГО-2 и валковой мельнице ВМ-1 приводит к изменению молекулярно-массового распределения и степени развет-вленности его макромолекул, что не сказывается отрицательно на токсических свойствах АГ. Получение межмолекулярных комплексов АГ с некоторыми малорастворимыми лекарственными веществами позволило улучшить их фармакологические характеристики. Показано, что в случае механохимического синтеза получаются более устойчивые комплексы по сравнению с жидкофазным способом.

Целью данной работы являлось исследование влияния механохимической активации на физико-химические свойства смесей диацетата бетулина с арабиногалактаном и изучение их противоопухолевых свойств.

В работе использовали ДАБ и АГ, полученные по разработанным оригинальным методикам [14, 15].

Механохимическую обработку проводили в мельнице SPEX 8000 (CertiPrep Corp., США) в стальных барабанах объемом 40 мл. Режим обработки: мелющие тела - стальные шары диаметром 6 мм, ускорение мелющих тел 8-10 g, загрузка 30 г, масса обрабатываемой смеси 1 г, максимальное время обработки 30 мин. Соотношение ДАБ : АГ составляло 1 : 9 (по массе).

Растворение АГ и его смесей с ДАБ в воде проводили в тестере растворимости Varian 705 DS. В сосуд с водой помещали 200 мг АГ или 180 мг АГ и 20 мг ДАБ и выдерживали при постоянном перемешивании при 37 °С в течение 2 сут. После чего раствор отфильтровывали

Экспериментальная часть

с помощью фильтров с диаметром пор 0,2 мкм. Фильтраты подвергали выпариванию при пониженном давлении и температуре 35-40 °С (ротационный испаритель ИР-1М, Россия).

Рентгенофазовый анализ (РФА) проводили с использованием дифрактометра D8 DISCOVER с двухкоординатным детектором (Bruker), СпК^-излучение, 29=5^40.

ИК-спектры получали методом нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО) в диапазоне частот 4000-500 см-1 на Фурье ИК-спектрометре Digilab Excalibur 3100 (Varian) без прессования образцов.

Электронные микрофотографии получены на растровом электронном микроскопе ТМ-1000 HITACHI (Япония).

Молекулярно-массовое распределение образцов исследовали методом гельпроникающей хроматографии на хроматографе Agilent 1200 с рефрактометрическим детектором 1260 Infinity (30 °С, PL aquagel-OH 40 300*7,5 мм, 0,1 М LiNO3, 1 мл/мин). Калибровка колонки осуществлялась с помощью стандартных образцов декстранов (Sigma-Aldrich) с молекулярными массами 10 600, 20 000, 41 272, 70 000. Хроматограммы нормированы на максимум поглощения рефрактометрического детектора.

Для определения содержания ДАБ навеску образца 9-10 мг подвергали трехкратной экстракции 1 мл хлороформа. Полученный экстракт выпаривали и твердый остаток растворяли в 1 мл этанола. Содержание ДАБ определяли хроматографически с помощью хроматографа «Милихром А-02» (ЗАО «ЭкоНова», Россия) (35 °С, ProntoSIL 120-5C18 AQ 2,0*75 мм, Н2О (А) -CH3CN (В), 80-100-100 % В, 100 мкл/мин). Содержание ДАБ определяли на длинах волн 200 и 210 нм.

Методика определения противоопухолевой активности исследуемых веществ на клетках асцитной аденокарциномы Эрлиха в экспериментах in vitro. Противоопухолевую активность ДАБ, АГ и механокомпозита ДАБ с АГ устанавливали, оценивая долю апоптоти-ческих и некротических асцитных клеток через 24 ч после воздействия препаратов. Механизм биологического эффекта препаратов исследовали, определяя концентрацию ионов натрия, калия, кальция через 3 ч после добавления препаратов.

ДАБ, АГ и механокомпозит ДАБ с АГ растворяли в питательной среде Хенкса на термо-шейкере при температуре 40 °С в течение 4 ч. Затем к пяти миллионам клеток АКЭ в 200 мкл среды Хенкса добавляли предварительно растворенные вещества в концентрации 0,5 мг/мл. Каждую пробу исследовали в трех повторностях.

Для определения влияния механокомпозита ДАБ с АГ и исходных чистых веществ на параметры ионного гомеостаза отмытые асцитные клетки инкубировали в готовой среде для культивирования с концентрацией исследуемых веществ 0,5 мг/мл в течение 3 ч при температуре 37 °С, 5 % СО2 и влажности 6 %. Для определения уровня внутриклеточного кальция использовали флуоресцентный зонд GreenCa2+, натрия - SBFI-AM, калия - PBFI-AM. Отмытые бесцветным раствором Хенкса клетки инкубировали с зондом в конечной концентрации 0,05 мг/мл в течение 30 мин при 37 °С, после чего их отмывали от избытка красителя. Интенсивность флуоресценции измеряли на проточном цитометре Beckman Coulter FC500. Собственную флуоресценцию клеток без красителя принимали за нулевую.

Идентификацию апоптотических и некротических клеток проводили в зависимости от их окрашивания флуоресцентными красителями - Hoechst 33342 и Propidium iodide. Флуоресцент-

ный голубой краситель Hoechst 33342 окрашивает конденсированный хроматин апоптотиче-ских клеток ярче, чем хроматин живых. Красный флуоресцентный краситель Propidium iodide проходит через поврежденную плазматическую мембрану некротических клеток и окрашивает ДНК. Фракцию клеток со смешанным окрашиванием (содержащих апоптотическое ядро и окрашенных Propidium iodide) относили к некрозу. Для определения доли апоптотических и некротических клеток отмытые асцитные клетки инкубировали в растворе Хенкса, содержащем Hoechst 33342 (1 мг/мл) и Propidium iodide (1 мг/мл), 10-15 мин при комнатной температуре. Количество апоптотических (ярко-голубых), некротических (красных и красно-голубых) и слабо светящихся голубым живых клеток подсчитывали в режиме флуоресценции, общее количество клеток - в световом режиме в том же поле зрения. Затем рассчитывали процентное соотношение всех трех фракций клеток.

Результаты и обсуждение

Исследование влияния механохимической активации на физико-химические свойства смесей диацетата бетулина с арабиногалактаном. Гель-хроматограмма АГ (рис. 3а, кривая 1) имеет основной максимум с lg M = 4,2 и небольшой пик с lg M = 2,8 (времена выхода 8,9 и 11,3 мин соответственно).

Механическая активация в течение 10 мин приводит к расщеплению основного пика вследствие появления нового максимума с lg M = 3,9 (время выхода 9,35-9,4 мин) и росту интенсивности минорного пика. При этом значительного сдвига основного максимума исходного АГ не наблюдается (рис. 3а, кривая 2). Механическая активация в течение 30 мин приводит к

0,80,60,40,20,05,0 4,8 4,6 4,4 4,2 4,0 3,8 3,6 3,4 3,2 3,0 2,8 2,6

^ М б)

Рис. 3. Гель-хроматограммы АГ и его смесей с ДАБ: а) 1 - исходного АГ, 2 - АГ после МА 10 мин, 3 - АГ после МА 30 мин; б) 1 - АГ после МА 10 мин, растворения в воде и последующего испарения растворителя, 2 - смесь ДАБ с АГ после МА 10 мин, растворения в воде и последующего испарения растворителя

--"-"- 2

( \

!

I л f \\

\

, \ • •. \

полному сдвигу максимума с ^М = 4,2 до ^ М = 3,9 (рис. 3а, кривая 3). Это говорит о том, что у части молекул АГ происходит уменьшение молекулярной массы примерно в 2 раза: с ~16000 до ~8000, как это наблюдалось в [13] при механической обработке в других мелющих аппаратах. Соотношение площадей пиков ^ М = 3,9 / ^ М = 4,2 (в координатах интенсивность - время выхода) после 10 и 30 мин механической активации составляет 1,2 и 6,3, что соответствует «степени превращения» АГ в низкомолекулярное состояние ~ 55 и 87 %.

Растворение механоактивированных образцов АГ в воде с последующим испарением растворителя приводит к частичному «восстановлению» молекулярной массы (рис. 3 б, кривая 1). В случае смесей АГ с ДАБ хроматограммы механоактивированных образцов (рис. 3 б, кривая 2) после растворения их в воде и выпаривания растворителя приобретают вид хроматограмм исходного АГ.

Присутствие ДАБ в смеси положительно сказывается на устойчивости клубков с большей молекулярной массой. Причиной этого может быть комплексообразование в растворе. Обнаружено, что ДАБ не извлекается из водного раствора смеси ДАБ с АГ при экстракции гекса-ном. Это говорит о том, что в водном растворе, по-видимому, образуется межмолекулярный комплекс АГ с ДАБ. Поскольку не наблюдается существенного сдвига полос в ИК-спектрах, молекулы ДАБ, вероятно, находятся внутри полисахаридной оболочки и связаны с молекулами АГ за счет Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий. Известно, что ДАБ в воде практически нерастворим, но благодаря комплексообразованию ДАБ с АГ были получены растворы с концентрацией ДАБ 0,15 - 0,18 мг/мл.

Линейные размеры молекулы ДАБ позволяют предполагать возможность образования комплекса с участием нескольких макромолекул АГ. Сопоставляя молекулярную массу ДАБ с молекулярной массой комплекса, можно предположить, что на одну макромолекулу АГ приходится менее 1 молекулы ДАБ. Это подтверждает, что ДАБ может взаимодействовать с несколькими макромолекулами АГ.

Исчезновение рефлексов ДАБ на рентгенограммах механоактивированных смесей подтверждает распределение тонко диспергированного вещества в матрице носителя с образованием механокомпозита [16]. В ИК-спектрах механоактивированных смесей не наблюдается сдвига максимумов полос, относящихся к колебаниям у(С=О) и (С-О), т.е. групп, которые могут принимать участие в образовании водородных связей, по сравнению с физической смесью компонентов, что может свидетельствовать о распределении ДАБ в матрице АГ без образования межмолекулярных водородных связей. Возможно образование комплекса со слабыми не-ковалентными неионными взаимодействиями [12]. Снижение количества разветвлений АГ при механической активации, наблюдаемое в [13], может положительно сказаться на подвижности цепей АГ, что должно способствовать образованию комплексов с ДАБ, снимая стерические затруднения для присоединения цепей АГ к молекуле ДАБ.

На рис. 4 представлены электронно-сканирующие изображения диацетата бетулина, а также его механоактивированного композита с арабиногалактаном. Кристаллы диацетата бетулина имеют пирамидальную форму размерами от 10 до 100 мкм (рис. 4а). В результате механической обработки кристаллы ДАБ измельчаются до размеров 5-10 мкм и представляют собой агрегаты частиц размером 5-30 мкм (рис. 4б). Можно предполагать, что смеси гомогенизируются в результате диспергирования и перемешивания компонентов.

Рис. 4. Электронно-сканирующие изображения образцов диацета бетулина (а) и механокомпозита диацетата бетулина с арабиногалактаном (б)

Учитывая повышение растворимости ДАБ в воде после получения механокомпозита с АГ, можно было ожидать улучшения его биодоступности, поэтому представляло интерес изучить противоопухолевые свойства МА композитов в сравнении с чистым ДАБ.

Токсикологическое исследование. Токсикологическое исследование на базе аккредитованного испытательного центра г. Красноярска показало, что полученные механокомпозиты ДАБ с АГ, так же как и индивидуальные вещества, в дозе 2000 мг/кг не являются ядовитыми и согласно международной токсикологической классификации их можно отнести к 4-му классу малотоксичных веществ.

Изучение противоопухолевой активности комплекса диацетата бетулина с арабиногалактаном на клетках асцитной аденокарциномы Эрлиха в экспериментах in vitro. Известно, что внутриклеточный кальций является наиболее важным внутриклеточным мессенджером, уровень которого изменяется под влиянием внешних сигналов, и, таким образом, он регулирует функциональное состояние клетки и предопределяет путь ее развития [17-20]. Многократное увеличение внутриклеточной концентрации катионов кальция стимулирует клеточное деление [21].

В наших исследованиях популяция асцитных клеток в контрольных образцах делилась на две фракции: с высокой и пониженной концентрацией катионов кальция. Содержание клеток с высокой концентрацией кальция (клетки перед делением) составляло (42±1,3) %, а число клеток с пониженной концентрацией кальция (поделившихся или покоящихся клеток) - (58±2,2) % (рис. 3 а). ДАБ, АГ и механокомпозит ДАБ с АГ уменьшали долю клеток с высокой концентрацией кальция, что служило косвенным свидетельством подавления уровня пролиферации асцитных клеток.

Уже через 3 ч после добавления ДАБ, АГ или их механокомпозита доля клеток с высокой концентрацией кальция уменьшалась до (22±1,0) % (рис. 5 а), что свидетельствовало о переходе части клеток в состояние покоя. Следовательно, исходные вещества ДАБ и АГ и механокомпо-зит ДАБ с АГ практически одинаково подавляли клеточную пролиферацию клеток асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ).

Натрий и калий - основные внутриклеточные катионы, участвующие в поддержании осмотического давления, кислотно-щелочного баланса, некоторых функций клеток, особенно

Л

Выеаж» Iй*1*]

Н'яжол |С*"] 1 .

1

3 —

1 '1 я || 1Д\

Интенсивность флуоресценции

б

Рис. 5. Изменение концентрации катионов кальция (а), натрия (б) и калия (в) в клетках АКЭ под влиянием механокомпозита ДАБ с АГ (2), ДАБ (3) и АГ (4) в сравнении с контролем (1)

а

в

нервных и мышечных. Увеличение или уменьшение концентрации ионов натрия ведет к изменению размеров клеток. Как известно, уменьшение размеров клетки может запустить процессы апоптоза, а их увеличение - процессы некроза. Все исследуемые вещества снижали концентрацию внутриклеточного калия и натрия, однако в большей степени содержание катионов калия в клетке снижалось под воздействием механокомпозита ДАБ с АГ. Одновременное снижение содержания калия и натрия в клетке (рис. 5б, в) свидетельствует о запуске апоптоза в клетках. При этом можно предположить, что комплекс ДАБ с АГ активировал апоптоз клеток АКЭ в большей степени, чем исходные вещества ДАБ и АГ.

Таким образом, механоактивированные комплексы ДАБ с АГ изменяют ионный гомео-стаз клетки, снижая концентрацию кальция, натрия и калия в клетке. Поскольку известно, что синхронное уменьшение содержания натрия, калия и кальция приводит к индукции апоптоза, можно предположить, что комплекс ДАБ с АГ стимулирует процесс элиминации асцитных клеток.

Данные по влиянию механокомпозита ДАБ с АГ и исходных веществ на уровень элиминации асцитных клеток карциномы Эрлиха представлены в табл. 1.

Под влиянием всех исследуемых веществ увеличилась доля клеток АКЭ в состоянии апоп-тоза: в присутствии АГ более чем в 5 раз, в присутствии ДАБ более чем в 7 раз, а в присутствии механокомпозита ДАБ с АГ почти в 12 раз. Полученные данные по оценке апоптоза и некроза в асцитных клетках под влиянием исследуемых веществ показывают возможный противоопухолевый эффект диацетата бетулина и арабиногалактана, но в большей степени механокомпозита ДАБ с АГ, что полностью согласуются с данными ионного гомеостаза, представленными на рис. 5.

Таким образом, в данной работе методом гельпроникающей хроматографии установлено, что механохимическая обработка арабиногалактана в шаровой мельнице SPEX 8000 приводит к изменению его молекулярно-массового распределения. Присутствие диацетата бетулина способствует восстановлению ММР после растворения механоактивированной смеси в воде и испарения растворителя. Механической обработкой смесей диацетата бетулина с арабинога-лактаном получены механокомпозиты в результате распределения ДАБ в матрице полимера.

Таблица 1. Влияние механокомпозита ДАБ с АГ и исходных веществ ДАБ и АГ на уровень элиминации асцитных клеток карциномы Эрлиха

Показатели выживаемости клеток АКЭ Образец

АГ ДАБ Механокомпозит ДАБ+ АГ (1:9, масс.) Контроль

Некроз, % 6,6±0,8 5,0 ±0,6 6,6±0,9 7,3±0,5

Апоптоз, % 16,7±1,8* 23±2,5* 36±3,8* 3,1±2,8

Общая доля элиминирующихся клеток 23,3±2,8 28,0±3,0 42,6±5,8 10,4±1,3

Примечание: * - достоверность отличий от контроля, Р<0,05.

Показано, что при использовании механокомпозита диацетата бетулина с арабиногалактаном наблюдается апоптоз асцитных клеток карциномы Эрлиха, причем количество апоптотиче-ских клеток возрастает почти в 12 раз по сравнению с контролем. На основании данных ионного гомеостаза предположено, что причиной апоптоза опухолевых клеток может быть снижение внутриклеточного содержания катионов натрия и калия, приводящее к уменьшению клеточных размеров и, следовательно, запуску апоптоза.

Благодарности

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (11-03-12114-офи-м), Совета по грантам при Президенте РФ по поддержке ведущих научных школ (НШ-221.2012.3) и программы Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине». Авторы благодарят А.В. Душкина и Л.И. Деменкову за съемку гель-хроматограмм (ИХТТМ СО РАН), В.Ф. Каргина (Центр коллективного пользования Красноярского научного центра) за снятие электронно-сканирующих изображений образцов) и Г.П. Скворцову за проведенные синтезы (ИХХТ СО РАН).

Список литературы

1. Патент РФ № 2150473. Способ получения диацетата бетулинола / Кислицын А.Н., Трофимов А.Н., Патласов В.П., Чупрова В.А. 2000. Бюл. 16.

2. Трофимов А.Н., Кислицын А.Н., Чупрова В.А., Рябова Е.Н., Иоффе Г.А. Кинетика переэте-рификации бутилацетата бетулинолом // Химия растительного сырья. 2001. №1. С. 69-73

3. Masayoshi T., Yoshihiro S. and Akio I. Polymer obtained from betulin and its production method// Patent Japan №2001-288222. 2001.

4. Сымон А.В., Веселова Н.Н., Каплун А.П. и др. Синтез циклопропановых производных бетулиновой и бетулоновой кислот и их противоопухолевая активность // Биоорганическая химия. 2005. Т. 31, №3. С. 320-325.

5. Patent US №20090318719. Method of preparation and isolation of betulin diacetate from birch bark from paper mills and its optional processing to betulin / Sarek J., Svoboda M., Haiduch M. 2009.

6. Shakhtshneider T.P., Boldyrev V.V. Mechanochemical synthesis and mechanical activation of drugs. "Reactivity of Molecular Solids". Ed. E. Boldyreva, V. Boldyrev. John Wiley & Sons LTD. England. 1999. P. 271-312.

7. Colombo I., Grassi G., Grassi M. Drug mechanochemical activation // Journal of Pharmaceutical Sciences. 1998. V. 98. № 5. P. 3961-3986.

8. Михайленко М.А., Шахтшнейдер Т.П., Дребущак В.А., Кузнецова С.А., Скворцова Г.П., Болдырев В.В. Влияние механической обработки на свойства бетулина и их смеси с водорастворимыми полимерами // Химия природных соединений. 2011. №2. С.211-214.

9. Шахтшнейдер Т. П., Кузнецова С. А., Михайленко М. А., Маляр Ю. Н., Скворцова Г. П., Болдырев В. В. Получение нетоксичных композитов бетулина с поливинилпирролидоном и полиэтиленгликолем // Журнал Сибирского федерального университета. Химия. 2012. Т.5, № 1. С. 52-60.

10. Медведева Е. Н., Бабкин В. А., Остроухова Л.А. Арабиногалактан лиственницы -свойства и перспективы использования (обзор) // Химия растительного сырья. 2003. № 1. С. 7-37.

11. Метелева Е.С., Душкин А.В., Толстикова Т.Г., Толстиков Г.А., Поляков Н.Э., Медведева Е.Н., Неверова Н.А., Бабкин В.А. Механохимическое получение и фармакологическая активность водорастворимых комплексов арабиногалактана и лекарственных веществ // Известия РАН, серия химическая. 2008. №6. С. 1274-1282.

12. Патент РФ № 2337710. Водорастворимая лекарственная композиция и способ ее получения / Душкин А.В., Толстикова Т.Г., Толстиков Г.А., Метелева Е.С. 2008. Бюл. 31.

13. Медведева Е.Н., Неверова Н.А., Федорова Т.Е., Бабкин В.А., Метелева Е.С., Душкин А.В., Толстикова Т.Г., Хвостов М.В., Долгих М.П. Структурные превращения арабиногалак-тана из лиственницы сибирской при механохимической обработке и биологические свойства продуктов // Химия растительного сырья. 2009. №3. С. 49-56.

14. Патент РФ № 2324700. Способ получения диацетата бетулинола / Кузнецова С.А., Кузнецов Б.Н., Редькина Е.С., Соколенко В.А., Скворцова Г.П. 2008. Бюл. № 14.

15. Кузнецова С.А., Кузнецов Б.Н., Михайлов А.Г., Скворцова Г.П. Способ получения арабиногалактана// Патент РФ № 2273646. 2006. Бюл. № 10.

16. Boldyrev V.V. Mechanochemistry and mechanical activation// Materials Science Forum.1996. Vols. 225-227. P. 511 520.

17. Zamay A. S., Zamay T. N. Change in Physicochemical Parameters of Membranes of Ehrlich Ascite Adenocarcinoma in the Course of Tumor Growth // Doklady Biochemistry and Biophysics. 2005. Vol. 402. P. 197-199.

18. Liu Z.M., Chen G.G., Vlantis A.C., Tse G.M., Shum C.K., van Hasselt C.A. Calcium-mediated activation of PI3K and p53 leads to apoptosis in thyroid carcinoma cells // Cellular and Molecular Life Sciences. 2007. Vol. 64, № 11. P. 1428-1426.

19. Clapham D.E. Calcium Signaling // Cell. 2007. Vol. 131, № 6. P. 1047-1058.

20. Neher E., Sakaba T. Multiple roles of calcium ions in the regulation of neurotransmitter release // Neuron. 2008. Vol. 59, № 6. P. 861-872.

21. Замай Т.Н., Замай А.С. Влияние АТР на концентрацию катионов кальция в асцитных клетках карциномы Эрлиха в динамике ее роста // Биохимия. 2006. Т. 71, № 10. С. 1347-1353.

The Mechanocomposite of Betulin Diacetate and its Antitumor Activity

Svetlana A. Kuznetsovaa,b, Tatyana P. Shakhtshneidercd, Mikhail A. Mikhailenkocd, Yuriy N. Malyara, Anna S. Zamaya,e and Vladimir V. Boldyrevc,d

aInstitute of Chemistry and Chemical Technology SB RAS 50/24, Akademgorodok, Krasnoyarsk, 660036 Russia

bSiberian Federal University, 79 Svobodny, Krasnoyarsk,660041 Russia cInstitute of Solid State Chemistry and Mechanochemistry SB RAS 18 Kutateladze St., Novosibirsk, 630128 Russia dResearch and Educational Center "Molecular Design and Ecologically Safe Technologies" 2 Pirogov St., Ch. Building, 125, Novosibirsk, 630090 Russia e Krasnoyarsk State Medical University named after Professor V.F. Voyno-Yasenetsky, 1 Partizan Jeleznyak St., Krasnoyarsk, 660022 Russia

Using gel-penetrating chromatography, it has been shown that mechanochemical treatment of a mixture of arabinogalactan (AG) with betulin diacetate (DAB) in a ball mill led to change of the molecular weight distribution (MWD) of AG. The presence of DAB in the mixture promoted restoration of MWD after dissolving the mechanically activated mixture in water and solvent evaporation. The formation of intermolecular complex DAB with AG at dissolution of initial and mechanically activated mixtures in water was suggested. It was shown that the mechanocomposites DAB with AG had the ability to induce cells in ascites Ehrlich carcinoma cell elimination processes mediated disturbance of ion homeostasis.

Keywords: betulin diacetate, arabinogalactan, mechanochemical treatment, dissolution, gel-penetrating chromatography, antitumor properties.