CC BY
17745. Munoz F.M., Campbell J.R., Atmar R.L. et al. Influenza A virus outbreak in a neonatal intensive care unit. Pediatr. Infect. Dis. J. 1999, 18 (9): 811-815.
46. Neu N., Plaskett T., Hutcheon G. et al. Epidemiology of human metapneumovirus in a pediatric long-term care facility. Infect. Control Hosp. Epidemiol. 2012, 33 (6): 545-550. doi: 10.1086/665727.
47. Nichols WG., Erdman D.D., Han A. et al. Prolonged outbreak of human parainfluenza virus 3 infection in a stem cell transplant outpatient department: insights from molecular epidemiologic analysis. Biol. Blood Marrow Transplant. 2004, 10 (1): 58-64.
48. Palomino M.A., Larranaga C., Avendano L.F. Hospital-acquired adenovirus 7h infantile respiratory infection in Chile. Pediatr. Infect. Dis. J. 2000, 19 (6): 527-531.
49. Park H.Y., Lee E.J., Ryu YW et al. Epidemiological investigation of MERS-CoV spread in a single hospital in South Korea, May to June 2015. Euro. Surveill. 2015, 20 (25): 1-6.
50. Qiu S., Li P., Liu H. et al. Whole-genome sequencing for tracing the transmission link between two ARD outbreaks caused by a novel HAdV serotype 7 variant, China. Sci. Rep. 2015, 5: 13617. doi: 10.1038/ srep13617.
51. Sanchez M.P., Erdman D.D., Torok TJ. et al. Outbreak of adenovirus 35 pneumonia among adult residents and staff of a chronic care psychiatric facility. J. Infect. Dis. 1997, 176 (3): 760-763.
52. Sidler J.A., Haberthur C., Dumoulin A. et al. A retrospective analysis of nosocomial viral gastrointestinal and respiratory tract infections. Pediatr. Infect. Dis. J. 2012, 31: 1233-1238.
53. Valenti WM., Menegus M.A., Hall C.B. et al. Nosocomial viral infections: I. Epidemiology and significance. Infect. Control. 1980, 1 (1): 33-37.
54. Valley-Omar Z., Nindo F., Mudau M. et al. Phylogenetic exploration of nosocomial transmission chains of 2009 Influenza A/H1N1 among children admitted at Red Cross War Memorial Children's Hospital, Cape Town, South Africa in 2011. PLoS One. 2015, 10 (11): e0141744. doi:10.1371/journal. pone.0141744.
55. Vincent A., La Scola B., Forel J.M. et al. Clinical significance of a positive serology for mimivirus in patients presenting a suspicion of ventilator-associated pneumonia. Crit. Care Med. 2009, 37 (1):111-118. doi:10.1097/CCM.0b013e318192fa8b.
56. Voirin N., Barret B., Metzger M.H., Vanhems P. Hospital-acquired influenza: a synthesis using the Outbreak Reports and Intervention Studies of Nosocomial Infection (ORION) statement. J. Hosp. Infect. 2009, 71 (1): 1-14. doi: 10.1016/j.jhin.2008.08.013.
57. von Linstow M.L., Hogh M., Hogh B. Clinical and epidemiologic characteristics of human bocavirus in Danish infants: results from a prospective birth cohort study. Pediatr. Infect. Dis. J. 2008, 27 (10): 897-902. doi:10.1097/INF.0b013e3181757b16.
58. Wald TG., Shult P., Krause P. et al. A rhinovirus outbreak among residents of a long-term care facility. Ann. Intern. Med. 1995, 123 (8): 588-593.
Поступила 17.06.19
Контактная информация: Захарова Ю.А.,
620000, Екатеринбург, ул. Летняя, 23, р.т. (343)261-99-47
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2019 М.Н.Бойченко, Е.О.Кравцова, В.В.Зверев
МЕХАНИЗМЫ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО ПАРАЗИТИЗМА БАКТЕРИЙ
Первый московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова
Алгоритм внутриклеточного паразитирования бактерий не зависит от того, является ли бактерия абсолютным или внутриклеточным паразитом. В зависимости от локализации бактериальной репликативной ниши внутриклеточные паразиты делятся на цитозольные и вакуолярные. Бактерии родов Rickettsia, Shigella, Chlamydia и вид Listeria monocytogenes используют в процессе внутриклеточного паразитирования аппарат полимеризации актина клетки хозяина. Эти бакте-
рии обладают эффекторными белками, домены которых идентичны эффекторным белкам клетки хозяина. У бактерий рода Shigella в этом процессе активное участие принимают эффекторные белки третьего типа секреторной системы (Т3СС). Listeria monocytogenes в отличии от других цито-зольных бактериальных внутриклеточных паразитов обладает двумя формами паразитирования: цитозольным и вакуолярным. У бактерий рода Brucella в создании репликативной ниши внутри клетки решающую роль выполняют эффекторные белки четвертого типа секреторной системы (Т4СС), которые также участвуют в модуляции врожденного иммунного ответа
Журн. микробиол., 2019, № 5, С. 61—72
Ключевые слова: Rickettsia, Chlamydia, Shigella, Listeria monocytogenes, Brucella, актиновая подвижность, репликативная ниша, Т3СС, Т4СС, внутриклеточный паразитизм
M.N.Boichenko, E.O.Kravtsova, V.V.Zverev
MECHANISM OF INTRACELLULAR BACTERIAL PARASITISM
Sechenov First Moscow State Medical University, Russia
Algorithm of intracellular bacterial parasitism does not depend on if bacterium is obligate or facultative intracellular parasite. Depending on replicative niche's localization intracellular bacterial parasites are divided onto cellular and vacuolated. Rickettsia spp., Shigella spp., Chlamydia spp. and Listeria monocytogenes use cell's machinery of actin polymerization during process of their intracellular parasitism. These bacteria possess some of effector's proteins which contain domains identical to effector proteins from the host cell. Shigella spp. T3SS and autotransporter protein IscA provide this process together with spreading bacteria intra colonic epithelium. In contrast other intracellular bacterial parasites, Listeria monocytogenes switches from dissemination in cytosol to persist in vacuole. In case of Brucella spp. the leading role in the creation of a replicative niche and in the modulation of the innate immune response is played by effector proteins of fourth type secretory system (T4SS).
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2019, No. 5, P. 61—72
Key words: Rickettsia, Chlamydia, Shigella, Listeria monocytogenes, Brucella, actin —based movement, replicative niche, T3SS, T4SS, intracellular parasitism
Молекулярный механизм внутриклеточного паразитирования бактерий в последнее время значительно привлекает внимание исследователей. В основе этого внимания лежит ряд факторов. Те бактерии, которые являются внутриклеточными паразитами, вызывают хронические персистирующие инфекции, заболевания, вызванные ими, протекают как в латентной форме с реактивацией, так и в форме бактерионосительства. Их паразитизм внутри клетки ограничивает доступ к ним лекарственных препаратов, что требует разработку новых антибактериальных средств для лечения этой группы заболеваний.
Следует отметить, что в развитии внутриклеточного паразитизма бактерий важную роль играют открытые в конце ХХ века неклассические факторы патогенности — секреторные системы, которые присутствуют главным образом у грамотрицатель-ных бактерий. Секреторные системы представляют собой структурные белковые образования, пролегающие от внутренней цитоплазматической мембраны с формированием канала, проходящего через периплазматическое пространство и наружную мембрану. Их функцией является доставка синтезированных бактериальной клеткой веществ (эффекторов) в клетку чувствительного организма. Типы секреторных систем различаются по строению и функциональной значимости. Типы 3(Т4СС), 4(Т4СС) и 6 (Т6СС) имеют шприцеобразную форму и принимают значительное участие в процессе внутриклеточного паразитирования бактерий [1,2].
Как известно, внутриклеточные паразиты подразделяются на абсолютные, которые не способны существовать вне клетки (риккетсии, хламидии и коксиеллы), и факультативные. Это подразделение связано с особенностями метаболизма бактериальной клетки. А вот характер взаимодействия с эукариотической клеткой не зависит от метаболической особенности бактерий, и внутриклеточных паразитов подразделяют на 2 большие группы: цитозольные и вакуолярные.
Для того, чтобы существовать внутри клетки, бактериальный паразит должен создать внутри нее репликативную нишу. Для этого он должен обладать следующими стратегиями: способностью активировать полимеризацию клеточного актина, в результате чего бактерия получает возможность проникать в клетку, которая не является профессиональным фагоцитом, путем «незаконного фагоцитоза», а также распространяться по межклеточному пласту; способностью формировать внутри клетки содержащую бактерию-паразит вакуоль, а для этого быть способной разрушать или модулировать эндосомальный каскад и ингибировать продвижение активных форм кислорода и азота; способностью противостоять факторам врожденного иммунитета.
При одном варианте как факультативные, так и облигатные паразиты формируют свою нишу в вакуоле, которая начинает диссоциировать от эндосомо-лизосомального пути созревания. Таких внутриклеточных паразитов называют вакуолярными. К ним относятся бактерии родов Salmonella, Brucella, Coxiella, Legionella, Chlamydia [1].
Альтернативная стратегия предполагает убегание бактерии из эндоцитарной вакуоли для того, чтобы использовать цитозоль клетки-хозяина в качестве сайта-репликации. Таких бактерий называют цитозольными внутриклеточными паразитами. К ним относятся рассмотренные ранее бактерии родов Francisella, Shigella [2], а также Listeria, Rickettsia [2,5]. Эта группа бактерий использует клеточный аппарат полимеризации актина как механизм межклеточного распространения и иммунного избегания [26,31]. Актиновый цитоскелет клетки представляет ключевую мишень для внутриклеточных бактериальных паразитов. Особенностью цитозольных паразитов является то, что они, инвазируя нефагоцитирующие клетки, выбегают из фагосомы в цитозоль, где полимеризуют актиновые филаменты для сборки на своей поверхности актинового хвоста, который обеспечивает развитие феномена акти-новой подвижности (АП), способствует распространению микроба через цитозоль, направляя его распространение в соседние клетки [31].
Этот процесс состоит из нескольких этапов [26].
1. После интернализации в клетку хозяина бактерии попадают в образованную мембраной клетки фагосому.
2. Через 30-60 минут фагосома разрушается бактериальными факторами, предоставляя микробу доступ в цитозоль.
3. В цитозоле клетки хозяина цитозольные паразиты реплицируются и декорируются актиновыми филаментами клетки хозяина.
4. Рекрутирование клеточного актина является результатом полимеризации ак-тиновых мономеров поверхностными белками бактерии. Актиновые филаменты организуются в хвостоподобные структуры и вызывают продвижение бактерий через цитоплазму к межклеточному соединению.
5. Происходит формирование выпячивания в соседнюю клетку, окруженного двойной цитоплазматической мембраной, которое в соседней клетке преобразуется в вакуоль. Бактериальные ферменты разрушают вакуоль, освобождая микроб, позволяя ему инфицировать следующие клетки.
Для развития актиновой подвижности необходим процесс нуклеации актина, т.е. сборка актиновых филаментов: димеров или тримеров. Этот процесс стимулируется в клетке белками нуклеаторами, к которым относятся Arp и формин.
Arp (actin related protein) представляет комплекс, состоящий из 7 белков [7], у которого белки Arp2/Arp3 (Arp2/3) обладают структурным подобием мономеру актина [7]. Arp2/3 стимулируют полимеризацию актина со стороны материнского филамента, образуя структуру Y-ветвистой формы, которая служит первой субъединицей нового актинового филамента.
Сам по себе Arp2/3 не способен вызвать сборку актина. Для этого требуется его активация факторами, способствующими нуклеации [14]. Одним из них является белок неврологического синдрома Wiscott-Aldrich (WASP). Взаимодействуя с Arp2/3, WASP вызывает их конформационные изменения, делая комплекс способным для осуществления нуклеации [14].
Формин-протеин функционирует как димер, используя свои два домена FH1 и FH2 для стимуляции сборки линейных актиновых филаментов.
Рассмотрим механизмы паразитирования у некоторых цитозольных паразитов, к которым относятся шигеллы, риккетсии и листерии.
Попав в толстый кишечник, шигеллы не инвазируют его эпителиальные клетки с апикальной стороны, а проходят трансцитозом эпителиальный слой через М-клетки. Начальный контакт между шигеллой и эпителиальной клеткой толстого кишечника происходит в участке липидного «рафта», богатого холестерином участка мембраны, который находится на базальной стороне эпителиальной клетки толстого кишечника[46]. Этот контакт опосредован рецепторами CD44 и альфа5,бета1-интегрином. С этого момента начинают активно участвовать факторы патогенности шигелл, синтез которых связан с генами «островков патогенности», расположенных на крупной плазмиде вирулентности WR 100.
Важным фактором патогенности шигелл является третьего типа секреторная система (Т3СС), синтез которой опосредуется 30-килобазным районом плазмиды pWR 100, обозначенным как район входа, «entry» район [39]. «Entry» район состоит из 2 оперонов: mxi—spa, которые кодируют структурный аппарат Т3СС и опе-рон ipa/ipg, гены которого имеют существенное значение для инвазии микроба в клетку, ipa/ipg оперон включает ipg—гены, экспрессирующие шапероны, и ipa-ге-ны, которые экспрессируют траслокаторы, являющиеся компонентами транслоко-нового комплекса, образующего поры в мембране клетки-мишени, что позволяет проводить транслокацию эффекторных молекул. Процесс проникновения шигелл в клетку требует гликозилирование ЛПС, так как это способствует более эффективному контакту компонентов транслоконового комплекса Т3СС с мембраной клетки. Белок транслоконового комплекса IpaB опосредует адгезию микроба к базальной мембране эпителиальной клетки толстого кишечника через взаимодействие гли-копротеинового рецептора CD44, который локализован в «рафт»-домене цитоп-лазматической мембраны эпителиальной клетки. Критичным компонентом Т3СС, необходимым для инвазии в клетку, является белок IpaC. Этот белок состоит из 3 районов: N-терминального, обладающего сигнальной последовательностью для связывания с шапероном, С-карбоксильного и центрального гидрофобного района, который взаимодействует с IpaB. В результате этого взаимодействия происходит проникновение иглы Т3СС в мембрану клетки, запуск реорганизации цитоскелета и микропиноцитоза. Белок IpaD выступает подложкой комплекса IpaB-IpaC, он также участвует в процессе сморщивания мембраны клетки [40]. В процессе реорганизации цитоскелета клетки принимают участие Rho-ГТФаза и тирозинкиназа.
В сайте внедрения микроба происходит индукция полимеризации актина, что приводит к образованию массивного мембранного впячивания, которое охватывает микроб, образуя первичную вакуоль, в которой находится возбудитель. Этот процесс
требует активации малой Rho-ГТФазы, которая рекрутирует актин-нуклеирующий комплекс Arp2/Arp3 [7]. В процесс регуляции впячивания мембраны вовлечен также белок IpaA за счет его взаимодействия с белком клетки хозяина, винкулином, который связывает цитоскелет клетки с экстрацеллюлярным матриксом. Мутанты по ipa—гену обладают в 10 раз сниженной инвазивной способностью [33]. В лизисе образованной первичной вакуоли принимает участие IpaB-IpaC комплекс, внедрение которого в вакуолярную мембрану является причиной ее лизиса. Это происходит через образование поры, которая приводит к дестабилизации вакуоли [40].
Цитоплазма эпителиальной клетки является главной репликативной нишей для шигелл. Главным бактериальным медиатором полимеризации актина является белок IscA (intracellular spread protein) [4,21]. IscA контролирует клеточные факторы, включая neuronal Wiskotts-Aldrich синдромный протеин и Arp2/Arp3 [18].
Белок IscA кодируется плазмидой вирулентости, но не является эффекторным белком Т3СС. Он является представителем белков — аутотранспортеров IscA, состоит из 3 доменов: N-терминальной сигнальной последовательности, С-терминального домена, формирующего бета-цилиндрический канал, который формирует пору во внешней мембране бактериальной клетки, через которую через бета-цилиндрический канал на поверхность бактерии транспортируется N-терминальный домен и центральный альфа-домен [33]. Экспонированный в цитозоль клетки-хозяина IscA активирует N-WASP. В результате этого взаимодействия происходит быстрая сборка актинового ядра и разрастание актиновой сети в области локализации N-терминального домена белка IscA, что формирует проталкивающую силу для движения бактерии по клетке.
Когда бактерия достигает межклеточного контакта, происходит образование мембранного выпячивания, проникающего в соседнюю клетку [24]. Мембранное выпячивание подвергается преобразование в вакуоль-подобное выпячивание (ВПВ). ВПВ представляет образование, состоящее из двойной мембраны, окружающей бактериальную клетку, но остается связанным с клеткой, из которой произошло выпячивание [24]. Преобразование выпячивания в вакуоль происходит через коллапс «шеи» выпячивания. Плазматическая мембрана ВПВ богата тирозиновыми остатками, поэтому предполагается, что в процессе преобразования ВПВ в вакуоль принимает участие тирозинкиназа и фосфатидил инозитол-3киназа [2,24].
В процессе разрушения вторичной вакуоли, окруженной двойной цитоплаз-матической мембраной, что способствует «побегу» из нее шигелл, участвуют сама Т3СС и ее эффекторные белки IscBVirA.
Дальнейшая внутриклеточная репликация, активная подвижность и сохранение шигелл внутри клеток зависят от эффекторной молекулы Т3СС IscB [36], который защищает бактерию от узнавания и захвата механизмом самопереваривания (ауто-фагии). Самопереваривание — процесс, при котором внутренние компоненты клетки доставляются внутрь ее лизосом, где подвергаются деградации.
На белке IscA имеется индуцирующий процесс аутофагии сайт узнавания [33], который маскируется IscB при участии шаперона IpgA для предупреждения заглатывания микроба везикулами аппарата аутофагии [36]. В ингибиции процесса самопереваривания участвует также белок VirA, обладающий цистеин протеазной активностью и способностью вызывать микротубулярную деградацию. После проникновения в соседнюю клетку повторяется новый цикл распространения шигеллы по клеточному пласту.
Бактерии рода Rickettsia, в отличие от шигелл, являются облигатными внутриклеточными паразитами, которые в организме человека преимущественно инфицируют эндотелий малых и средних сосудов [43]. Интернализация риккетсий в
клетку хозяина происходит, как предполагают, индуцированным фагоцитозом, в процессе которого принимают участие белки наружной мембраны риккетсий [43]. Оказавшись внутри внутриклеточной вакуоли, риккетсии разрушают ее мембрану, используя гемолизин и фосфолипазу D. Для дальнейшей диссеминации через эндотелий риккетсии используют актиновую подвижность, однако молекулярный механизм ее развития отличается от такового у шигелл [2].
Наиболее детально этот процесс изучен у риккетсий, входящих в группу клещевых пятнистых лихорадок (КПЛ). На поверхности бактериальной клетки риккетсий группы КПЛ имеется белок RickA, обладающий аминокислотным подобием WASP. Он способен стимулировать Arp2/3-зависимую полимеризацию в системе in vitro.
Помимо RickA на поверхности клетки риккетсий группы КПЛ имеется еще белок Sca2, который участвует в нуклеации актина [23,28]. Этот белок обладает аминокислотным подобием белку формину [23]. Подобно форминовому белку Sca2 нук-леирует сборку линейных актиновых филаментов. Это предполагает, что риккетсии группы КПЛ используют формин-подобные свойства Sca2 для первичного механизма движения как внутри клетки, так и между клетками.
Наличие на поверхности микробной клетки риккетсий группы КПЛ двух белков, способных стимулировать полимеризацию актина, привело к предположению, что они действуют в клетке на разных стадиях инфекционного процесса. RickA связан с индукцией реорганизации актина цитоскелета клетки в период интернализации рик-кетсий [23]. На примере R.parkeri из группы КПЛ было показано, что в период раннего времени инфекционного процесса экспрессируется RickA, полимеризуя короткие закругленные актиновые хвосты Arp2/3-зависимым механизмом [22,38]. В дальнейшем Sca2 начинает вызывать полимеризацию длинного прямого актинового хвоста.
Интересным циклом внутриклеточного паразитирования обладают бактерии рода Listeria. L.monocytogenes обладает способностью сохраняться и реплицироваться как в фагорцитарных, так и в нефагоцитарных клетках [16]. Поверхностные белки микроба: интерналины А и В (nlA,B) служат лигандами для рецепторов клетки хозяина для лигандо-рецепторного взаимодействия, опосредующего захват бактерии рецептор — опосредованным эндоцитозом [16]. Оказавшись в вакуоли внутри клетки, L.monocytogenes секретирует холестерин-зависимый листериолизин О (LLO), обладающий двойной функцией: ингибицией развития фагосомы и образовании поры в мембране вакуоли. Используя листериолизин совместно с двумя фосфоли-пазами С, L.monocytogenes разрушает мембрану вакуоли и выбегает в цитоплазму клетки хозяина [5,16]. Микроб реплицируется в цитозоле и приобретает актиновую подвижность, используя актиновый цитосклет клетки хозяина. В цитоплазме клетки происходит индукция поверхностного белка ActA, который, имитируя хозяйский фактор нуклеации актина, активирует Arp2/3 [6], индуцируя сборку актина в форме «актинового хвоста», напоминающего комету [32]. Актиновая подвижность дает возможность микробу распространяться из клетки в клетку через образование мембранного впячивания из первично инфицированной клетки в соседнюю, формируя двух-мембранную вакуоль, из которой микроб «убегает» и инициирует новый цикл [5,32]. L.monocytogenes, как показали последние исследования, обладает двумя формами паразитирования: цитозольным и вакуолярным.
После нескольких дней паразитирования в цитозоле бактерии резко прекращают продукцию ActA и захватываются в листерии содержащую вакуоль. В этой вакуоле происходит переход микроба в так называемое живое, но не культивируемое состояние (VBNC). В этом состоянии бактерии не удается обнаружить, используя рутинные методы культивирования [30]. При использовании модели мышиных
макрофагов в системе in vitro было показано, что при обработке инфицированных листериями клеток высокими дозами гентамицина происходил запуск образования VBNC с отбором бактериальных клеток в некультивированной форме [30]. Такой двойной цикл внутриклеточного паразитирования L.monocytogenes должен способствовать бессимптомному носительству этого микроба, что может быть очень опасным для беременных, а также сохранению микроба в организме-хозяина при проведении антибиотикотерапии.
Вакуолярные паразиты после проникновения в клетку сохраняются и размножаются в содержащих микробы вакуолях, избегая их слияния с лизосомой или изменяя окружение фаголизосомы. К ним относятся бактерии родов Salmonella, Brucella, Coxiella, Chlamydia [1]. Следует отметить, что процесс формирования фаголизосомы проходит через несколько стадий. Вскоре после проникновения микроба в клетку и формирования эндосомы наступает ранняя фаза, в течение которой связанная с ферментом ГТФазой RAB5 эндосома приобретает маркерный белок ЕЕА1. Поздняя эндосома теряет RAB5, приобретая ГТФазу RAB7, лизосомо-ассоциированные гли-копротеины LAMP1 и LAMP2 и вакулярную АТФазу, которая проталкивает протоны в развивающуюся фагосому для понижения рН. В финале фагосома сливается с ли-зосомальными участками, приобретая катепсины и гидролазы, вакулярная АТФаза понижает рН до 4,5 [1,9]. Стратегия внутриклеточного паразитизма направлена или на разрушение эндосомального каскада и ограничения созревания фагосомы на ранней стадии для избегания слияния с лизосомой, или изменения состояния фа-голизосомы в случае слияния фагосомы с лизосомой, что реализуется у этой группы бактерий.
Рассмотрим, что происходит в процессе паразитирования внутри клетки у бактерий рода Brucella. Бруцеллы, возбудители бруцеллеза, проникают в организм человека через дыхательные пути, пищеварительный тракт и конъюнктиву. Бруцеллы не обладают Т3СС, в процессе проникновения в организм прикрепляются к клеткам слизистой, связываясь с рецепторами, содержащими сиаловую кислоту и сульфатные остатки [15,42]. Связывание способствует активации ГТФазы, которая стимулирует сигнальный каскад, приводящий к реорганизации цитоскелета клетки, в результате мембрана клетки располагается вдоль поверхности бактерии. Интернализация бруцеллы в клетку происходит по zipper-подобному механизму (механизму молнии) [1]. После проникновения в фагоцитарную и нефагоцитарную клетки бруцеллы оказываются внутри мембранного образования, называемого содержащей бру-целлы вакуоли (БСВ) или (BCV). БСВ начинает продвигаться по эндосомальному пути, приобретая ранние и поздние эндосомальные мембранные маркеры, внутри ее происходит понижение рН до 4,5. На этом этапе внутриклеточного цикла она получает названии эндосомальной БСВ (эБСВ). Несмотря на приобретение маркеров поздней эндосомы, ассоциированных с лизосомой мембранных протеинов 1 и 2 (LAMP1,2), которые контролируют слияние с лизосомой, эБСВ избегает слияния с лизосомой [9,20].
Под влиянием низкого рН начинается активация VirB оперона, синтезирующего Т4СС, через которую в клетку хозяина через мембрану эБСВ поставляются эффекторные молекулы для модуляции клеточных функций и биогенеза БСВ. Т4СС бруцелл не требуется микробу для инвазии в клетку, но необходима для пролонгированной персистенции. Т4СС секретирует 15 эффекторных молекул, которые обеспечивают внутриклеточную персистенцию бруцелл. Эффекторные белки Т4СС участвуют в модификации внутриклеточного трафика, ограничивая слияние БСВ с лизосомой, а также способствуют выработке относительно низкого уровня
иммунного ответа, сигнального узнавания врожденного иммунитета [9]. Благодаря активности эффекторов Т4СС еБСВ начинает терять эндосомальные маркеры с сопутствующим поддерживающим взаимодействием со структурами эндоплазма-тического ретикулума (ЭР), приобретая его мембранные маркеры, что показывает переход еБСВ в репликативную еБСВ. Эти структурные и функциональные изменения коррелируют с началом бактериальной репликации [15]. Следует отметить, что репликация внутриклеточных вакуолярных паразитов может происходит в узких и объемных вакуолях. У бруцелл вакуолярная мембрана окружает каждую бактерию, и репликация микроба сопровождается растяжением вакуолярной мембраны при делении, вызывая «инкапсулирование» каждого потомка, формируя узкую вакуоль [9,15]. Объемные вакуоли содержат 2 и более бактерии, окруженные единой мембраной. Вслед за бактериальной репликацией наступает добавочная стадия внутриклеточного цикла бруцеллы — стадия захвата рБСВ серповидо подобными мембранными структурами, которая приводит к образованию мультимембранной вакуоли, напоминающую аутофагосому. Эта ремодулированная рБСВ получила название аутофаговой БСВ (аБСВ). Ее образование связано с выделением бактерии из инфицированной клетки и окончанием внутриклеточного цикла [9].
VirB оперон, кодирующий у бруцелл Т4СС, состоит из 12 генов и расположен во 2 хромосоме. Он высоко консервативен у всех видов рода Brucella .Т4СС секретирует 15 эффекторных молекул, которые обеспечивают внутриклеточную персистенцию бруцелл. Мутанты бруцелл, дефицитные по Т4СС, хотя и способны инвазировать клетки хозяина, но не способны поддерживать внутриклеточный жизненный цикл и устанавливать репликативную нишу [29]. В биогенезе рБСВ принимают участие такие эффекторные молекулы Т4СС, как RicA, необходимый для установления ЭР-производной репликативной БСВ, вырабатывая точное взаимодействие с органел-лами секреторных путей; BspB регулирует биогенез рБСВ и внутриклеточную репликацию; SepA регулирует эБСВ трафик [9,10]. По мнению Delevoye C. et al. [12], Т4СС требуется для выработки относительного низкого уровня иммунного ответа, сигнального узнавания врожденного иммунитета, играя, таким образом, решающую роль в ингибиции врожденного иммунитета хозяина. Следует отметить, что присутствие в липиде А ЛПС бруцеллэлонгированных молекул жирных кислот приводит, как к уменьшению токсичности эндотоксина, так и к понижению врожденного иммунного ответа, вследствие того, ЛПС служит слабым агонистом для TLR4 [41]. В добавок к этому бруцеллы вырабатывают иммунорегуляторные факторы, которые супрессируют иммунный ответ. В ингибиции врожденного иммунитета принимают участие эффекторные молекулы Т4СС VceC , BtpA.
Эффекторный белок VceC участвует в активации ответа на неправильно скрученный белок [9]. BtpA содержат TIR (toll-interleukinreceptor) домен. BtpA действует на клеточный сигнальный адапторный белок MyD88 [8], вызывая ингибицию сигнального каскада узнавания клетки хозяина, приводя к нарушению TLR опосредованной продукции провоспалительных факторов [9,29,37,45,47].
Рассмотрим поведение еще одного представителя вакулярных паразитов, который, в отличии от бруцелл, является абсолютным внутриклеточным паразитом. Это бактерии рода Chlamydia. Все хламидии обладают бифазным циклом развития, при котором они из экстрацеллюлярной инфекционной формы элементарного тельца (ЭТ) при попадании в клетку хозяина переходят в метаболически активное ретикулярное тельце (РТ) [19]. Трансформация ЭТ в РТ осуществляется внутри инфицированной хламидией клетке хозяина в образованной мембранной вакуоле, которую называют включением [11,17].
ЭТ и РТ хламидий морфологически и функционально различны. ЭТ способны сохраняться в экстрацеллюлярном пространстве, благодаря отличительному строению внешней мембраны, которая в два раза толще внешней мембраны других гра-мотрицательных бактерий. Это связано с присутствием во внешней мембране сети перекрестно связанных дисульфидными связями белков, образующих внешнемемб-ранный комплекс, который обеспечивает резистентность ЭТ к осмотическому давлению и ригидность, необходимых для их внеклеточного жизненного цикла [25].
Несмотря на то, что ЭТ считаются метаболически неактивными, они содержат избыток белков, которые могут быть использованы при «взрыве» метаболической активности в случае их проникновения в клетку хозяина и дифференцировке в РТ [44]. В процессе конвертации ЭТ в РТ внешнемембранный комплекс уменьшается в размерах, обеспечивая текучесть мембраны, что является необходимым условием для репликации РТ. РТ делятся бинарным делением. Внутри включения происходит накопление РТ, после чего наступает их реконверсия в инфекционное ЭТ. Реконверсия протекает в несколько стадий — от ранней до поздней [34]. Инфекционные ЭТ выделяются затем из клетки путем ее лизиса или выдавливания из включения [34]. Как ЭТ, так и РТ обладают третьего типа секреторной системой.
ЭТ содержит функционально активную Т3СС, и активация секреции эффек-торных молекул наступает быстро при контакте с клеткой хозяина и выключается после дифференцировки РТ в ЭТ [26].
В связи с ограниченной метаболической активностью ЭТ, секреторный аппарат и эффекторы, требуемые для процесса инвазии хламидии в клетку хозяина, должны быть предупакованы в процессе конечной стадии реконверсии РТ в ЭТ [11]. Эффекторные молекулы хламидийной Т3СС можно разделить на две категории: Tarp — связанный с процессом инвазии транслокационный актин, рекрутирующий фосфопротеин [48]; Inc класс эффекторов, которые опосредуют ключевые этапы взаимодействия хламидий с клеткой хозяина [3].
Контакт с клеткой хозяина, благодаря секреции Т3СС, индуцирует ремодулиро-вание актина, в результате чего происходит быстрая интернализация микроба [19]. Tarp секретируется в течение 1 минуты после контакта микроба с клеткой и подвергается фосфорилированию клеточными киназами. Фосфорилированный Tarp участвует в процессе нуклеации актина, который необходим для входа микроба в клетку. Этот процесс протекает с вербовкой регуляторов актина, в частности, белков семейства Wiskott-Aldrich [27,31]. Tarp синтезируется на поздней стадии конверсии РТ в ЭТ и быстро упаковывается в ЭТ [48].
После внедрения ЭТ в клетку включение начинает диссоциироваться от канонического эндосомасомального пути и передвигается к перинуклеарной области, при этом перехватывая материал из мультивезикулярных телец, липидных капель, эндоплазматического ретикулума [11]. Для создания благоприятного взаимодействия паразит-хозяин хламидиям, как и другим вакуолярным внутриклеточным паразитам [1], необходимо манипулировать мембранным трафиком. Внутриклеточное обитание хламидий требует предотвращения слияния включения с лизосомой. В то же время, происходит продвижение слияния включения с другими компонентами клетки, такими как экзоцитарные везикулы, и слияния включений друг с другом для обеспечения сильного «бактериального удара». Такое слияние включений друг с другом обозначается как гомотипное [17]. В этих процессах ведущая роль принадлежит большой группе эффекторов Т3СС, входящих в семейство Inc белков [11], которые способны связываться с мембраной включения. Inc белки являются участниками как гомотипного слияния, так и опосредованного SNARE белком мемб-
ранного слияния. SNARE представляет большую группу белков эукариотической клетки, ответственных за внутриклеточное слияние мембран [35]. Inc белки обладают состоящим из 40-60 аминокислотных остатков двудольным гидрофобным доменом с включенными в центре гидрофильными остатками. Гидрофобные домены траспортируются через Т3СС в мембрану включения [11]. У хламидий обнаружены Inc белки, обладающие SNARE-подобными доменами. В частности, C.trachomatis кодирует 3 Inc белка со SNARE-подобными доменами [13]. IncA обладает двумя гомологичными SNARE — N-терминальным и С-терминальным, которые работают независимо в процессе мембранного слияния, но оба они требуются для гомотипно-го слияния. С-терминальный необходим для осуществления IncA олигомеризации и слияния множества включений в одно.
Обобщая изложенный материал, можно сделать заключение, что алгоритм поведения бактерии-паразита внутри клетки не зависит от того, является ли бактериальный внутриклеточный паразит абсолютным или факультативным. Обращает на себя внимание тот факт, что многие внутриклеточные бактериальные паразиты обладают структурами, которые имитируют структуры клетки хозяина. Тем самым, эти структуры функционируют как функциональные блокаторы, приспосабливая клетку хозяина для своего существования в ней. К таким структурам относятся обнаруженные у хламидий Inc белки, обладающие SNARE-подобными доменами [13]; эффекторный белок Т4СС бруцелл, BtpA, который содержит TIR (toll interleukin receptor) домен [9]; белок Sca2, обладающий аминокислотным подобием белку формину у риккетсий [23]; белок RickA, обладающий аминокислотным подобием с WASP у риккетсий [38]. Эволюционное происхождение таких структур представляет интересный вопрос, который может быть разрешен в ходе дальнейших исследований.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бойченко М.Н., Кравцова Е.О., Волчкова Е.В. и др. Некоторые молекулярные механизмы па-разитирования бактерий внутри цитоплазмы клетки хозяина. Инфекционные болезни. 2018, 16(2): 92-97.
2. Бойченко М.Н., Кравцова Е.О., Волчкова Е.В., Белая О.Ф. Некоторые вопросы молекулярного патогенеза внутриклеточного паразитизма бактерий. Инфекционные болезни. 2017, 15(4):71-75.
3. Bastidas R.J., Elwell C., Engel J., Valdivia R.H. Chlamydial intracellular survival strategies.Cold Spring Harb.Perspec. Med. 2013, 3: a010256.
4. Bernardini M.L., Mounier J., dHauteville H. et al. Identification of icsA, a plasmid locus of Shigella flexneri that governs bacterial intra- and intercellular spread through interaction with F-actin.Proc.Natl. Acad.Sci.USA. 1989, 86:3867-3871.
5. Bierene H., Milohanic E., Kortebi M. To be citosolic or vacuolar.The duble life ofListeria monocytogenes. Front Cell Infection Microbiol. 2018, 9:136. doi: 10.3389|fcimb 2018.00136.
6. Oampbell-Valois F.X., Sachse M.,Sansonetti P.J., Parsot C. Escape of actively secreting Shigella flexneri from ATG8/LC3- positive vacuoles formed during cell-to-cell spread is facilitated by IcsB and VirA. MBio. 2015, 6: e02567-e2514.10.1128/mBio.02567-14.
7. Campellone K.G., Welch M.D. A molecular arms race: cellular control of action assembly. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2010, 11: 237-251. doi:10.1038/nrm2867.
8. Castaneda-Roldan E.I., Avelino-Flores F., DallAgnolM. et al. Adherence of Brucella to human epithelial cells and macrophages is mediated by sialic acid residues. Cell Microbiol. 2004, 6:435-445.
9. Celli J., de Chastellier C., Franchini D.-M. et al. Brucella evades macrophages killing via VirB-dependent sustained interactions with the endoplasmic reticulum. J. Exp. Med. 2003, 198: 545-556.
10. Dai V., Li Z. Conserved type III secretion system exerts important roles in Chlamydia trachomatis. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2014, 7(9): 5404-5414.
11. De Barsy M., Jamet A., Filopon D. et al. Identification of a Brucella spp. secreted effector specifically interacting with human small GTPase Rab2. Cell Microbiol. 2011, 13:1044-1058.
12. Delevoye C., Nilges M., Dehoux P. et al. SNARE protein mimicry by an intracellular bacterium. PLoSPatog. 2008, 4: e1000022.10.1371/journal.ppat.1000022.
13. Derivery E., Gautreau A. Generation of brunched action networks: assembly and regulation of the N-WASP and WAVE molecular machines. BioEssays 2010, 32:119-131. doi:10.1002/bies.200900123.
14. Dohmer P.H., Valguanera E., Czibener C., Ugalde J.E. Identification of a type IV secretion substrate of Brucella abortus that participates in the early stages of intracellular survival. Cell Microbiol. 2014, 16:396-410. doi:10.3389|fcimb. 2006.00079.
15. Dumoux M., Clare D.K., Sabibil H.R., Hayward R.D. Chlamydiae assemble a pathogen synapse to hijack the host endoplasmic reticulum. Traffic.2012, 13: 1612-1627.
16. Egile C., Loisel T.P., Laurent V. et al. Activation of the CDC42 effector N-WASP by Shigella flexnerilcsA protein promotes actin nucleation by Arp2/3 complex and bacterial actin-based motility. J.Cell.Biol. 1999, 146:1319-1332.
17. Elwell C., Mirrashidi K., Engel J. Chlamydia cell biology and pathogenesis. Nat. Rev. Microbiol. 2016 Jun; 14(6): 385-400. doi:10.1038/micro.2016.30.
18. Figueiredo P., Ficht Th. et al. Pathogenesis and Immunobiology of Brucellosis. Am. J. Pathol. 2015, 185(6);1505-1517.
19. Goldberg M.B., Barzu O., Parsot C., Sansonetti P.J. Unipolar localization and ATPase activity of IcsA, a Shigella flexneri protein involved in intracellular movement. J.Bacteriol. 1993, 175:2189-2196.
20. Gouin E., Egile C., Dehoux P. et al. The RickA protein of Rickettsia conorii activates the Arp2/3 complex. Nature. 2004, 427: 29. doi:10.1038/nature02318.
21. Haglund C.M., Choe J.E., Skau C.T et al. Rickettsia Sca2 is a bacterial formin-like mediator of actin-based motility. Nat. Cell Biol. 2010, 12:10578-1063. doi: 10.1038/ncb2109.
22. Herve Agaisse. Molecular and Cellular Mechanisms of Shigella flexneri Dissemination. Front. Cell Infect. Microbiol. 2016, 6:29.
23. Huang Z., Chen M., Li K. et al. Cryo-electron tomography of Chlamydia trachomatis gives a clue to the mechanism of outer membrane changes. J. Electron. Microsc. (Tokyo). 2010, 59: 237-241.
24. Ireton K. Molecular mechanisms of cell-cell spread of intracellular bacterial pathogens. Open Biol. 2013 Jul; 3(7) 130079. doi: 10.1098/rsob.130079.
25. Jiwani S., Ohr R.J., Fischer E.R. et al. Chlamydia trachomatis Tarp cooperates with the Arp2/3 complex to increase the rate of actin polymerization. Biochem.Biophys. Res. Commun. 2012, 420: 816-821.
26. Kleba B., Clark T.R., Lutter E.I. et al. Disruption of the Rickettsia rickettsii Sca2 autotransporter inhibits actin-based motility. Infect. Immun. 2010, 78:2240-2247. doi:10.1128/IAI.00100-10.
27. Kohler S., Foulongne V., Ouahrani-Bettache S. et al. The analysis of the intramacrophagicvirulome of Brucellasuis deciphers the environment encountered by the pathogen inside the macrophage host cell. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002, 99:15711-15716.
28. Kortebi M., Milohanec E., Mitchell G. et al. Listeria monocytogenes switches from dissemination to persistence by adopting a vacuolar lifestyle in epithelial cell Plos.Pathog. 2017, nov 30; 13(11)e 1006734. doi: 10.1371/journalppat1006734.
29. Lamason R.L., Welch M.D. Actin-based motility and cell-to-cell spread of bacterial pathogens.Curr. Opin. Microbiol. 2017 Feb; 35: 48-57. doi:10.1016/j.mib.2016.11.007.
30. Lambrechts A., Gevaert K., Cossart P. et al. Listeria commet tails: the actin-based motility machinery at work. Trends Cell Biol, 2008,18: 220-227.
31. Mattock E., Biocker A.J. How do the virulence factors of Shigella work together to cause disease? Front. Cell Infect. Microbiol. 2017,7:64.
32. Nans A., Ford C., Hayward R.D. Host-pathogen reorganization during host cell entry by Chlamydia trachomatis. Microbes Infect. 2015. Nov-Dec 17 (11-12): 727-731. doi:10.1016/Jmicr.2015.08.004.
33. Nickel W., Weber T., McNew J.A. et al. Content mixing and membrane integrity during membrane fusion driven by pairing of isolated v-SNAREs and t-SNAREs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999, 96:12571-12576.10.1073/pnas.96.22.12571.
34. Ogawa M.T, Yoshimori T., Suzuki T et al. Escape of intracellular Shigella from autophagy. Science. 2005, Feb4, 307(5710):727-731. doi:10.1126/science/1106036.
35. Rana R.R., Zhang M., Spear A.M. et al. Bacterial TIR-containing proteins and host innate immune system evasion. Med. Microbiol. Immunol. 2013, 202:1-10.
36. Reed S.C.O., Lamason R.I., Risca V.I. et al. Rickettsia actin-based motility occurs in distinct phases mediated by different actin nucleators. Curr. Biol. 2014, 24: 98-103.
37. Roehrich-Doenitz A.D. Regulation of Type III Secretion Hierachy in Shigella flexneri.Ph.D.thesis. University of Bristol, 2013.
38. Roehrich-Doenitz A.D., Guillossou E., Blocker A.J., Martinez-Argudo I. Shigella IpaD has a dual role: signal transduction from type III secretion system needle tip and intracellular secretion regulation. Mol. Microbiol. 2013, 87:690-706.10.1111/mmi.12124.
39. Rolan H.G. Tsolis R.M. Inactivation of the Tipe IV system reduces the Th1 polyrasation of immune responses to Brucellaabortus infection. Infect. Immunol. 2008, Jul, 76(7):3207-3213. doi:10.1128/ IAI.00203-08.
40. Rossetti C.A., Drake K.L., Adams L.G. Transcriptome analysis of HeLa cells response to Brucella melitensis infection:a molecular approach to understand the role of the mucosal epithelium in the onset of the Brucella pathogenesis. Microbes Infect. 2012, 14:756-767.
41. Salcedo S.P., Marchesini M.I., Degos C. et al. Recent molecular insights into rickettsial pathogenesis and immunity. Future Microbiol. 2013, Oct. 8(10):1265-1288. doi:10.2217/fmb.13.102.
42. Saka H.A. et al. Quantitative proteomics reveals metabolic and pathogenic properties of Chlamydia trachomatis developmental forms. Mol. Microbiol. 2011, 82: 1185-1203.
43. Lepidi H. et al. BtpB, a novel Brucella TIR-containing effector protein with immune modulatory functions. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2013, 3:28.
44. Schroeder G.N., Hilbi H. Molecular pathogenesis of Shigella spp.controlling host cell signaling, invasion, and death by Type III Secretion. Clin. Microbiol. Rev. 2008, Jan; 21(1):134-156.
45. Snyder G.A., Deredge D., Waldhuber A. et al. Crystal structures of the Toll/Interleukin-1 receptor (TIR) domains from the Brucella protein TcpB and host adaptor TIRAP reveal mechanisms of molecular mimicry. J. Biol. Chem. 2014, 289:669-679.
46. Wang J., Zhang Y., Yu P., Zhong G. Immunodominant regions of Chlamydia trachomatis Type III secretion effector proteins, Tarp. Clin. Vaccine Immunol. 2010, 17: 1371-1376.
47. Weber M., Faris R. Subversion of the endocytic and secretory pathways by bacterial effector proteins. Front. Cell. Dev. Biol. 2018, 6:1. doi. 10.3389/fcell.2018.00001.
48. West N.P., Sansonetti P., Mounier J. et al. Optimization of virulence functions through glucosylation of Shigella LPS. Science. 2005, 307,1313-1318.10.1126/science.1108472.
Поступила 31.05.19
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2019
М.П.Костинов1,2, А.М.Костинов3, Д.В.Пахомов1, В.Б.Полищук1, А.М.Костинова4, А.Д.Шмитько А.А.Тарасова5
ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПНЕВМОКОККОВОЙ ВАКЦИНЫ У ИММУНО-КОМПЕТЕНТНЫХ И ИММУНОКОМПРОМЕНТИРОВАННЫХ ПАЦИЕНТОВ
'НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова; 2Первый московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова; 'Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова; 4ГНЦ Институт иммунологии, Москва; 5Приволжский исследовательский медицинский университет, Н. Новгород
В статье приведён анализ многочисленных научных исследований, выполненных в России, по применению пневмококковой полисахаридной вакцины у иммунокомпетентных и иммуно-компроментированных пациентов. Новыми являются данные по оценке влияния вакцины на клинико-иммунологические аспекты при конкретной патологии у детей, что позволяет раскрыть механизмы, взаимосвязанные с эффективностью вакцинации.
Журн. микробиол., 2019, № 5, С. 72—83
Ключевые слова: пневмококковая полисахаридная вакцина, пневмококковая инфекция, вакцинация
