CC BY
67
Алексей Анатольевич ЛАРИОНОВ3, Виктория Владимировна БЫКОВА1, Татьяна Васильевна НОВИКОВА1, Татьяна Павловна ОРЛОВА1, Ирина Георгиевна ИНЖУТОВА2, Марина Михайловна ПЕТРОВА3, Алла Борисовна САЛМИНА1
1 НИИ молекулярной медицины и патобиохимии ГБОУ ВПО Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития России 660022, г. Красноярск, ул. Партизана Железняка, 1
2 Лечебно-оздоровительный центр г. Красноярска 660135, г. Красноярск, ул. Воронова, 39Б
3 Кафедра поликлинической терапии с курсом семейной медицины и ЗОЖ ГБОУ ВПО Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития России 660022, г. Красноярск, ул. Партизана Железняка, 1
Изучены молекулярные механизмы улучшения функционального состояния эндотелиальных клеток на примере применения триметазидина у пациентов с артериальной гипертензией и подтверждены in vitro моделированием эндотелиальной дисфункции на культуре клеток HUVEC. Выявлено, что назначение триметазидина способствует усилению продукции VEGF и синтеза ERK, нормализации внутриклеточного содержания кальция и свободных радикалов в эндотелиоцитах. Перечисленные молекулярно-клеточные изменения приводят к снижению апоптоза эндотелиоцитов, усилению их функциональной активности и клеточного роста, что сопровождается уменьшением образования клеточных мембранных микрочастиц. Последние, по-видимому, играют ключевую роль не только в развитии эндотелиальной дисфункции, являясь паракринными регуляторами, но и способствуют клеточной выживаемости за счет «сброса» переизбытка сигнальных протеинов эндотелиальными клетками.
Ключевые слова: артериальная гипертензия, эндотелиальная дисфункция, патогенез, терапия, клеточные мембранные микрочастицы, HUVEC, триметазидин.
УДК 615.036.8
МЕХАНИЗМЫ КОРРЕКЦИИ ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ ДИСФУНКЦИИ: ДАННЫЕ ТРАНСЛЯЦИОННОЙ МЕДИЦИНЫ
Алёна Ивановна ИНЖУТОВА1 , Светлана Анатольевна ФИЛИППОВА2,
В патогенезе развития гипертонической болезни ключевое место занимает эндотелиальная дисфункция, проявляющаяся снижением выработки эндотелием оксида азота и увеличением продукции эндотелина-1, повышением экспрессии рецепторов к катехоламинам и ангиотензи-ну II [1]. Вместе с усилением вазоконстрикции, нарушением вазодилатации и ремоделировани-
ем сосудов активируется синтез эндотелиоцита-ми факторов межклеточной адгезии и фактора фон Виллебранда [2]. В результате формируется воспаление сосудистой стенки, нарушается ее проницаемость, образуются пристеночные тромбы, атеросклеротические бляшки, и, наконец, кальциноз и фиброз сосудов снижает их эластичность [3]. Своевременная диагностика и
\Инжутова А.И. - к.м.н., старший научный сотрудник
Филиппова С.А. - врач функциональной диагностики, e-mail: filsvet@mail.ru
Ларионов А.А. - клинический ординатор кафедры поликлинической терапии и семейной медицины с курсом
ЗОЖ, e-mail: adpersonamalexeylarionov@gmail.com
Быкова В.В. - студентка, e-mail: kgma21@mail.ru
Новикова Т.В. - студентка, e-mail: tatiana_novik@mail.ru
Орлова Т.П. - студентка, e-mail: tanush7@mail.ru
Инжутова И.Г. - к.м.н., главный врач, e-mail: irinainzhutova@gmail.com
Петрова М.М. - д.м.н., проф., зав. кафедрой поликлинической терапии и семейной медицины с курсом ЗОЖ, e-mail: stk99@yandex.ru
Салмина А.Б. - д.м.н., проф., руководитель НИИ, e-mail: allasalmina@mail.ru
коррекция эндотелиальной дисфункции - современная стратегия терапии сердечно-сосудистых заболеваний, преследующая цель профилактики и терапии как кардиоваскулярной патологии, так и ее осложнений [4].
Изучение молекулярных механизмов развития дисфункции эндотелия является залогом выявления патогенетических мишеней для медикаментозного улучшения функции эндотелия. Локализация эндотелиальных клеток в интиме сосудов не позволяет провести полноценный прижизненный анализ внутриклеточного состава сигнальных молекул и протеинов, участвующих в регуляции клеточного цикла и функциональной активности. Решение проблемы находится в создании экспериментальных условий для физиологического и патологического функционирования клеток in vitro [5, 6]. Моделирование дисфункции эндотелия в культуре клеток эндотелиоцитов обладает несколькими преимуществами: позволяет изменять степень дисфункции эндотелия, контролировать биохимический состав на любом этапе, изучать эндотелиоциты в отсутствие воздействия других клеток сосудистой стенки и крови, а при необходимости и совместно с ними.
Одним из признаков изменения функционального состояния клетки является выпячивание наружной цитоплазматической мембраны (блеббинг), которое нередко заканчивается образованием клеточных мембранных микрочастиц [7]. Мембранные микрочастицы, образуемые клетками при активации и апоптозе, связанными с извращением мембранного состава протеинов и фосфолипидов мембраны клетки, представляют собой потенциальный маркер дисфункции эндотелия и мишень терапевтического воздействия [8]. Клеточные мембранные микрочастицы имеют размер менее 1,0 мкм, способны проникать через межклеточные щели и, путем пиноцитоза, - внутрь клетки [9]. Состав мембранных микрочастиц зависит от клетки-родительницы, т. е. клеточные мембранные микрочастицы несут те же рецепторы и содержат те же биологически активные вещества, что позволяет им включаться в каскад сигнальных путей в клетках-мишенях. Последнее обусловливает не только их диагностическую, но и патогенетическую значимость [10]. Поиск эффективных лекарственных средств, оказывающих влияние на новые мишени патогенеза эндотелиальной дисфункции, - это перспективное направление оптимизации эффективности медикаментозной терапии сердечно-сосудистых заболеваний. Установление механизмов, лежащих в основе улучшения функции эндотелия, будет способ-
ствовать разработке новых лекарственных препаратов сосудистой терапии.
Работа выполнена с целью получить ответы на следующие вопросы: 1) являются ли клеточные мембранные микрочастицы и внутриклеточные биологически активные вещества (кальций и свободные радикалы) перспективной молекулярной мишенью для медикаментозной терапии эндо-телиальной дисфункции; 2) можно ли экстраполировать данные лабораторных исследований in vitro на пациентов с гипертонической болезнью.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Исследование включало в себя два этапа: I - клинический анализ распространенности эн-дотелиальной дисфункции у пациентов с гипертонической болезнью и эффективность ее коррекции триметазидином МВ, II - лабораторное моделирование эндотелиальной дисфункции in vitro c оценкой влияния триметазидина на функцию эндотелиальных клеток. Работа выполнена с соблюдением «Этических принципов проведения научных медицинских исследований с участием человека» Хельсинкской декларации, в соответствии с «Правилами клинической практики в Российской Федерации» и с информированного согласия обследуемых.
В исследовании приняли участие 90 пациентов обоего пола в возрасте 40-60 лет, находящиеся в медицинских учреждениях г. Красноярска с диагнозом гипертоническая болезнь II стадии. Критерии исключения: сосудистые катастрофы на момент включения и в анамнезе, острые и хронические воспалительные заболевания, патология крови, онкология, иммунодефицитные и аллергические состояния. Контрольную группу составили 30 человек соответствующего воз-растно-полового состава, не страдающие сердечно-сосудистыми заболеваниями и также не имеющие признаков из списка исключения.
Всем пациентам были проведены общеклинические исследования, ЭКГ, эхокардиография, мониторинг артериального давления, ультразвуковая диагностика («манжеточная проба») диаметра плечевой артерии [11] как общепризнанного маркера дисфункции эндотелия. Забор образца периферической крови в объеме 5 мл был осуществлен на 1-е и 60-е сутки терапии триметазидином МВ (предуктал МВ, Сервье, Франция) для исследования биохимических (sPECAM-1, VEGF-A) и клеточных (циркулирующие апоптотические эндотелиоциты, циркулирующие клеточные мембранные микрочастицы) маркеров эндотелиальной дисфункции.
Для экспериментов in vitro была использована культура клеток HUVEC (эндотелиальные
клетки пуповинной вены человека) из расчета 1 млн клеток на культуральный флакон. Моделирование эндотелиальной дисфункции проводилось физической гипоксией (инкубация при 37 °С в течение 24 ч при содержании O2 менее 2 %, в атмосфере, содержащей 5 % CO2, 10 % H2, 85 % N2) [12, 13] и добавлением в обогащенную питательную среду EBM 10 нг/мл TNF-a [14]. Для одного и того же пассажа HU-VEC в параллельных флаконах была добавлена автоклавированная дистиллированная вода или триметазидин (Sigma-Aldrich, США, 500 мкМ, 5,0 мкг/мл) [15, 16] соответственно. Эндотели-альная дисфункция была оценена биохимическими тестами на содержание в питательной среде VEGF [17], тестом «раневого дефекта» [18], подсчетом апоптотических аннексин-положи-тельных эндотелиальных клеток.
Образцы периферической крови пациента и экспериментальный материал были изучены на содержание клеточных мембранных микрочастиц эндотелиального происхождения (CD62E+), аннексин-положительных эндотелиальных клеток, определен уровень свободных радикалов и концентрация внутриклеточного кальция (Ca2+) в эндотелиоцитах до и после влияния тримета-зидина МВ. Циркулирующие эндотелиоциты, циркулирующие клеточные мембранные микрочастицы и экспериментальные образцы были исследованы на содержание митоген-активиру-емых протеинкиназ (MAPK) p38, JNK, ERK.
Выделение эндотелиоцитов из периферической крови осуществляли по методу Iwata et al. [19], циркулирующих клеточных мембранных микрочастиц - методом Pirro et al. [20]. Для иммуноцитохимии использован набор Annexin detection kit (Bender MedSystem, Австрия, стандартный протокол), меченные фикоэритрином анти-СD62E антитела (Abcam, Великобритания). Иммуноферментный анализ проведен с применением анти-VEGF-A и анти-SPECAM-! ELISA kit (Invitrogen, Бельгия). Вестерн-блоттинг осуществлен по стандартному протоколу с использованием антител к p38 (Cell Signaling Technology, США; разведение 1:1000), JNK (Cell Signaling Technology; разведение 1:1000), ERK (Cell Signaling Technology; разведение 1:1000).
Иммуногистохимические параметры оценивали с помощью микроскопа Olympus IX81 (США), концентрацию свободных радикалов и кальция - на счетчике Wallac Victor-2 (Perki-nElmer, США) с использованием соответственно дигидроэтидия (Sigma-Aldrich, стандартный протокол) и FLUO4-AM (Invitrogen, стандартный протокол).
При выполнении статистической обработки полученных результатов применяли дисперсионный анализ с использованием критерия Колмогорова-Смирнова, теста Манна-Уитни, теста Ньюмена-Кейлса, парного t-теста. Статистически достоверным считалось значение p < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Изучение образцов крови больных артериальной гипертонией до приема триметазидина и после двух месяцев его приема показало значительное уменьшение дисфункции эндотелия, что проявлялось снижением количества циркулирующих апоптотических эндотелиоцитов, циркулирующих клеточных мембранных микрочастиц эндотелиального происхождения, уровня sPECAM-1 (табл. 1). Данные подтверждены «манжеточной пробой», диагностировавшей увеличение прироста диаметра плечевой артерии на реактивную гиперемию и на пробу с нитроглицерином на 28,6 и 48,9 % соответственно по сравнению с исходным приростом изучаемых параметров у этих же пациентов до приема триметазидина МВ. Нормальным считается прирост диаметра плечевой артерии на 10 % и более от исходного при пробе с реактивной гиперемией и 20 % и более при пробе с нитроглицерином.
У пациентов с гипертонической болезнью исходно содержание VEGF было в 12 раз выше (p < 0,001), чем в контрольной группе, а на фоне приема триметазидина повысилось по отношению к исходной концентрации в 1,5 раза (p < 0,05) (см. табл. 1). На фоне артериальной гипертензии в эндотелиоцитах содержание кальция и свободных радикалов превышало показатели в контрольной группе соответственно в 1,6 (p < 0,001) и 2,9 (p < 0,001) раза. Назначение триметазидина привело к снижению содержания внутриклеточного кальция (на 21,0 %, p < 0,01) и концентрации свободных радикалов (на 55,1 %, p < 0,001) в эндотелиоцитах по сравнению с группой без триметазидина.
Эксперимент in vitro (табл. 2) c моделированием эндотелиальной дисфункции, приближенным к физиологическим условиям, путем воздействия физической гипоксии и стимуляции эндотелиальных клеток TNF-a подтвердил результаты, полученные in vivo, и показал, что в модели эндотелиальной дисфункции возрастают интенсивность апоптоза (в 7,72 раза, p < 0,01), образование клеточных мембранных микрочастиц (на 75,3 %, p < 0,01), концентрация VEGF в питательной среде (в 2,02 раза, p < 0,01) по сравнению с HUVEC, культивированными в
Примечание. % РГ - процент вазодилатации в ответ на реактивную гиперемию, % НГ - процент вазодилатации в ответ на нитроглицерин сублингвально (0,5 мг); здесь и в табл. 2 отличие от величины соответствующего показателя в контроле статистически значимо: * - при р < 0,05, ** - при р < 0,01, *** - при р < 0,001.
Таблица 1
Характеристика параметров функциональной активности эндотелия у пациентов с артериальной гипертензией и у лиц контрольной группы
Показатель Гипертоническая болезнь (n = 90) Контрольная группа (n = 30)
До приема триметазидина Через 60 дней после приема триметазидина
Количество апоптотических эндотелиоцитов, % 2,5 ± 0,2* 0,3 ± 0,2 0,8 ± 0,5
Количество клеточных мембранных микрочастиц, шт./мкл 671,8 ± 7,2** 256,2 ± 2,2* 100,6 ± 1,9
Содержание эРЕСАМ-1, нг/мл 6,60 ± 1,90* 3,80 ± 0,80* 0,23 ± 0,03
Содержание VEGF-A, пг/мл 29,94 ± 7,03*** 46,21 ± 11,63*** 2,31 ± 2,07
Содержание Са2+ (коэффициент флуоресценции х 105) 3,52 ± 0,45*** 2,76 ± 0,65 2,24 ± 0,04
Содержание свободных радикалов (коэффициент флуоресценции х 105) 85,78 ± 10,26*** 38,43 ± 12,16 28,87 ± 0,84
Манжеточная проба: диаметр плечевой артерии % РГ % НГ 3,72 ± 0,6* 6,0 ± 2,1*** 9,4 ± 6,7*** 4,32 ± 0,03 8,4 ± 0,3** 18,4 ± 0,1 4,9 ± 0,4 15,8 ± 1,7 20,3 ± 1,12
Таблица 2
Характеристика параметров функциональной активности HUVEC в эксперименте in vitro
Показатель Модель эндотелиальной дисфункции Контроль
Без инкубации с триметазидином На фоне инкубации с триметазидином
Количество апоптотических эндотелиоцитов, % 19,3 ± 2,7** 5,6 ± 1,4* 2,5 ± 0,5
Количество клеточных мембранных микрочастиц, шт. х 105/мл 4,16 ± 0,52** 1,56 ± 0,30* 1,00 ± 0,06
Содержание VEGF-A, нг/мл 19,86 ± 0,54*** 27,63 ± 2,60*** 9,54 ± 0,24
Содержание Са2+ (коэффициент флуоресценции х 105) 38,00 ± 4,76*** 23,00 ± 0,50** 18,00 ± 2,48
СР (коэффициент флуоресценции х 105) 7,65 ± 0,01** 4,53 ± 0,03** 2,83 ± 0,02
Тест раневого дефекта 3 ч, % 80,0 99,9 30,0
обычных условиях нормоксии. На фоне инкубации модели эндотелиальной дисфункции c триметазидином происходит значимое снижение количества апоптотических эндотелиоцитов (в 3,5 раза, p < 0,01), клеточных мембранных микрочастиц (в 2,7 раза, p < 0,01) и увеличивается концентрация VEGF в питательной среде (в 1,4 раза, p < 0,01) по сравнению с моделью эндоте-лиальной дисфункции без инкубации с тримета-зидином. В эксперименте in vitro триметазидин так же, как у пациентов, привел к снижению содержания внутриклеточного кальция и свободных радикалов в эндотелиоцитах в 1,7 раза (p < 0,05 по сравнению с эндотелиальной дисфункцией без триметазидина) (см. табл. 2).
Данные «теста раневого дефекта» выявили, что скорость пролиферации эндотелиоцитов и покрытия ими свободной культуральной поверхности выше в модели дисфункции эндотелия на 50 % - без обработки триметазидином и на 69,9 % - при инкубации с триметазидином по сравнению с контролем (см. табл. 2).
Методом вестерн-блоттинга определено, что содержание сигнальных протеинов MAPK различается в культуре клеток HUVEC при нор-моксии и эндотелиальной дисфункции (рис. 1). Содержание ERK при нормальных условиях инкубации было в 3,5 раза выше, чем в клетках в модели эндотелиальной дисфункции (p < 0,01). Напротив, эндотелиальная дисфункция сопровождалась увеличением содержания JNK и р38
Рис. 1. Содержание MAPK в клетках HUVEC (А) и продуцируемых ими клеточных мембранных микрочастицах (Б). Н — нормоксия, ЭД — эндотелиальная дисфункция, ЭД + Тр — условия эндотелиальной дисфункции в сочетании с инкубацией с триметазидином. Здесь и на рис. 2: 1 - JNK, 2 - ЕЯК, 3 - р38; отличие от величины соответствующего показателя при нормоксии (в контроле) статистически значимо: * -при р < 0,05, ** - при р < 0,01, *** - при р < 0,001; отличие от содержания других белков этой же группы статистически значимо: # - при р < 0,05, ## - при р < 0,01, ### - при р < 0,001
по сравнению с нормоксией в 2,5 (р < 0,01) и 16,9 (р < 0,001) раза соответственно. Под действием триметазидина соотношение содержания внутриклеточных сигнальных протеинов было схоже с таковым при нормоксии: концентрация ERK была выше, чем ЖК и р38 (р < 0,05). При исследовании уровня МАРК в клеточных мембранных микрочастицах во всех экспериментальных образцах получен сходный результат: содержание р38 было существенно выше, чем других протеинов (р < 0,01). В то же время установлено, что концентрация ЖК была в 3,5 раза выше в мембранных микрочастицах от культуры НЦУЕС при нормоксии, чем при эндотелиальной дисфункции (р < 0,05). Достоверных различий содержания сигнальных протеинов в мембранных микрочастицах в модели эндотелиальной дисфункции при инкубации с триметазидином и без него не выявлено. Однако отмечена тенденция к увеличению содержания всех изучаемых МАРК в клеточных мембранных микрочастицах после культивирования НЦУЕС в условиях эндотелиальной дисфункции с триметазидином (см. рис. 1).
Анализ содержания митоген-активируемых протеинкиназ в пуле циркулирующих эндоте-лиоцитов от пациентов с гипертонической болезнью выявил повышение всех трех показателей (р < 0,01) по сравнению с контрольной группой. У пациентов с гипертонической болезнью, как получавших, так и не получавших триметази-дин, значительно преобладало содержание р38: у получавших - в 3 раза (р < 0,01), у не получавших - усреднено в 1,5 раза (р < 0,05) относи-
тельно содержания ЕЯК и ЖК в этих группах. Если сравнить структуру соотношения концентраций изучаемых протеинов, то видно, что у лиц контрольной группы наименьшее содержание ЖК, несколько больше ЕЯК и наибольшее количество р38. Такое же соотношение можно наблюдать у пациентов с гипертонической болезнью, получавших триметазидин, тогда как у больных, которым препарат не назначался, наименьшее содержание ЕЯК, несколько выше -ЖК и наибольшее - р38. Циркулирующие клеточные мембранные микрочастицы пациентов с гипертонической болезнью на фоне терапии триметазидином и без нее содержали одинаковое количество ЕЯК, у первых содержание ЖК над ЕЯК преобладало в 2,3 раза (р < 0,01), у последних - в 1,8 раза (р < 0,05). Среди изучаемых МАРК превалировала р38, концентрация которой была в 1,1 раза больше, чем ЖК, у пациентов, не получавших триметазидин (р > 0,05), и в 1,7 раза больше (р < 0,001), чем у больных, получавших препарат. По структуре содержания изучаемых протеинов в клеточных мембранных микрочастицах контрольной группы статистически значимо не отличались количества ЖК и ЕЯК, а содержание р38 превышало концентрацию ЖК в 1,4 раза (р < 0,05) и ЕЯК в 1,1 раза (р > 0,05) (рис. 2).
ОБСУЖДЕНИЕ
На наш взгляд, возрастание концентрации VEGF не свидетельствует напрямую об эндо-телиальной дисфункции, являясь отображением компенсаторного процесса в тканях на фоне
Рис. 2. Содержание МАРК в циркулирующих эндотелиоцитах (А) и циркулирующих клеточных мембранных микрочастицах (Б). ГБ — гипертоническая болезнь, ГБ + Тр — гипертоническая болезнь, леченная тримета-зидином, контроль — здоровые волонтеры
гипоксии/ишемии. VEGF выделяется ишемизи-рованными тканями и стимулирует ангиогенез [21]. В нашем исследовании установлено, что триметазидин участвует в индуцировании продукции VEGF и, следовательно, развитии новых сосудистых коллатералей в ишемизированных тканях, что обусловливает улучшение самочувствия пациентов с кардиоваскулярной патологией, например, снижение ангинозных болей и повышение общей толерантности к физической нагрузке.
Ранее было определено, что триметазидин, воздействуя на кардиомиоциты, вызывает уменьшение окисления жирных кислот и стимулирует использование глюкозы [22], в условиях дефицита кислорода восстанавливает сопряжение гликолиза и окислительного декарбоксилирова-ния, уменьшает внутриклеточный ацидоз, увеличивает количество пирувата, что приводит к возрастанию продукции АТФ [23]. Перечисленные эффекты положительно сказываются на снижении зоны ишемии миокарда и повышении качества жизни пациента. Кроме того, увеличение продукции VEGF приводит к закономерному увеличению деления эндотелиальных клеток, что отображается в «тесте раневого дефекта»: скорость и площадь заполнения пустого поля в модели дисфункции эндотелия при инкубации с триметазидином на 19,9 % выше, чем в его отсутствие. Повышение митотической активности в условиях эндотелиальной дисфункции имеет компенсаторный характер, направленный на поддержание целостности эндотелиального пласта. Было показано, что чрезмерная продукция VEGF может стимулировать эндотелиаль-ную дисфункцию и нарушение барьерных фун-
кций эндотелия за счет нарушения мембран-ци-тоскелетных взаимодействий [24].
Триметазидин предотвращает возможные эффекты VEGF на эндотелиальную дисфункцию через снижение внутриклеточной концентрации кальция и свободных радикалов, а также стабилизацию клеточных мембран, что подтверждается уменьшением под его воздействием содержания клеточных мембранных микрочастиц под воздействием триметазидина. Механизм снижения внутриклеточной концентрации кальция и свободных радикалов может быть связан со стабилизацией клеточных мембран, в том числе c закрытием митохондриальной поры (mitochondrial permeability transition pore) [25, 26]. Известно, что триметазидин может снижать «текучесть» плазматической мембраны клеток [27], в том числе путем угнетения окисления липидов и жирных кислот, стимуляции обмена фосфолипидов, что создает благоприятные условия для восстановления структурной целостности клеточных мембран [28]. В нашем исследовании триметазидин in vivo и in vitro привел к снижению образования клеточных мембранных микрочастиц эндотелиоцитарного происхождения. Возможно, это связано со стабилизацией клеточных мембран за счет уменьшения «текучести» и снижения внутриклеточной концентрации кальция и свободных радикалов, которые индуцируют сигнальные системы, провоцирующие клеточную активацию или апоптоз.
Ранее нами было продемонстрировано, что назначение триметазидина приводит к снижению блеббинга клеток (выпячивание цитоплаз-матической мембраны) [29]. Нами проведен анализ циркулирующих эндотелиоцитов, выде-
ленных из крови. Пул циркулирующих эндоте-лиоцитов состоит из апоптотических и мито-тических слущенных эндотелиоцитов, а также специализированных прогениторных клеток [30]. Слущивание клеток с эндотелиального пласта может происходить в результате напряжения сдвига или при повышенной пролифе-ративной активности, что вкупе с прогенитор-ными эндотелиальными клетками обеспечивает формирование коллатералей [31, 32]. Таким образом, экстраполяция результатов исследования на эндотелиальные клетки сосудистой интимы является условной, отображающей совокупность процессов эндотелиальной дисфункции, сопряженных с клеточной активацией, апопто-зом и замещением «раневого дефекта» эндоте-лиального пласта [33].
Анализ содержания МАР-киназ в пуле циркулирующих эндотелиоцитов выявил различия между исследуемыми группами. Обращает на себя внимание то, что в циркулирующих эндо-телиоцитах контрольной группы преобладает содержание р38 по сравнению с ЕЯК и ЖК. Это может быть объяснено тем, что в состав циркулирующего пула эндотелиоцитов входят преимущественно апоптотические. Учитывая, что у пациентов контрольной группы (здоровых волонтеров) отсутствует эндотелиальная дисфункция, логично, что прогениторных и активированных эндотелиоцитов у них меньше, чем у пациентов с гипертонической болезнью, к тому же нет дополнительного повреждающего фактора в виде напряжения сдвига или действия ударной волны крови. Напротив, в циркулирующих эндотелиоцитах пациентов с гипертонической болезнью преобладало содержание р38 и ЖК над ЕЯК, которое совокупно было больше, чем в клетках лиц контрольной группы. Такое соотношение может свидетельствовать в пользу присутствия в циркулирующем пуле всех трех видов циркулирующих эндотелиоцитов: апоптотических, активированных и специализированных прогениторных. Под действием три-метазидина на фоне повышенного содержания изучаемых протеинов в циркулирующих эндо-телиоцитах отмечается тенденция к приближению соотношения концентраций митоген-акти-вируемых протеинкиназ к таковому в контрольной группе, что свидетельствует об улучшении функции эндотелия. В циркулирующих клеточных мембранных микрочастицах от пациентов контрольной группы содержатся МАРК всех трех изучаемых типов, в то время как низкое содержание ЕЯК и высокая концентрация р38 у пациентов с гипертонической болезнью, а также более высокое содержание ЖК у не леченных
триметазидином пациентов позволяют предположить, что циркулирующие мембранные микрочастицы - не только диагностический маркер патологических состояний сердечно-сосудистой системы, но и биогенный регулятор клеточной активности за счет транспорта сигнальных молекул. Это имеет непосредственное значение в реализации направленного ответа клеток-мишеней и поддержания жизнеспособности клетки-родительницы [34, 35].
В культуре клеток в условиях эндотелиальной дисфункции инкубация с триметазидином привела к возвращению синтеза МАРК эндоте-лиоцитами на уровне, характерном для нормок-сии. Возрастание синтеза ERK свидетельствует о функциональной активности клеток, что выражается в их росте, делении. Увеличение продукции JNK и р38 происходит под воздействием свободных радикалов, кальция, то есть стрессовых условий для клетки, а также на фоне ауто-кринно-паракринного действия ростовых факторов, таких как VEGF. Повышенный синтез JNK ведет к клеточной активации и росту, а также контролирует индукцию апоптоза, что наблюдается при эндотелиальной дисфункции in vivo и in vitro. В целом, JNK может действовать по пути как поддержания жизнеспособности клетки, так и развития апоптоза. Эффекты р38 более драматичны для клетки, и наиболее вероятный механизм сигнальной трансдукции в эндотелио-цитах приведет к их апоптозу. Из полученных результатов in vitro следует, что при эндоте-лиальной дисфункции синтез р38 возрастает в меньшей степени, чем продукция JNK, однако значимо выше, чем при нормоксии. Не удивительно, что клеточные мембранные микрочастицы перенасыщены p38 от клеток HUVEC во всех проведенных экспериментах in vitro. Мы предполагаем, что таким образом клетки избавляются от избытка p38, тем самым обеспечивая свое выживание. Вероятно, с этим же связано то, что под действием триметазидина в условиях дисфункции эндотелия сохраняется соотношение содержания JNK, ERK и p38, как в модели эндотелиальной дисфункции без триметазиди-на с тенденцией к увеличению их содержания. Другими словами, триметазидин приводит к стабилизации клеточных мембран, увеличению их митотической активности, снижению апоптоза путем не только уменьшения внутриклеточного содержания кальция и свободных радикалов, но и сохраняя удаление условно негативных сигнальных протеинов посредством микрочастиц. Особенно хорошо это показано на культуре эндотелиоцитов в условиях нормоксии, когда низкая экспрессия p38 в эндотелиоцитах сопро-
вождается высоким его содержанием в клеточных мембранных микрочастицах. Предположительно, это может служить для паракринной регуляции, препятствуя увеличению синтеза p38 в нормальных условиях. В целом, механизм формирования и насыщения мембранных микрочастиц сигнальными протеинами, вероятно, носит универсальный характер, что отражается в сходной тенденции изменения содержания MAPK в клеточных мембранных микрочастицах эндотелиоцитарного происхождения при разных условиях инкубации.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Эндотелиальная дисфункция является патогенетическим звеном развития артериальной гипертензии и регистрируется у пациентов с гипертонической болезнью. Клеточно-молекуляр-ные маркеры (циркулирующие эндотелиоциты, циркулирующие клеточные мембранные микрочастицы, sPECAM-1) обладают равной диагностической ценностью с ультразвуковым исследованием диаметра плечевой артерии («ман-жеточная проба»). Снижение внутриклеточной концентрации кальция, свободных радикалов и уменьшение образования клеточных мембранных микрочастиц ассоциировано с улучшением функции эндотелиальных клеток. В основе молекулярных механизмов коррекции функции эндотелия находится стабилизация клеточных мембран, в том числе митохондрий, что приводит к нормализации содержания биологически активных веществ в эндотелиоцитах и уменьшению экспрессии сигнальных протеинов (p38 и JNK), повышению синтеза ERK, регулирующей клеточную выживаемость. Создание эндотели-альной дисфункции in vitro, заключающееся в воздействии на эндотелиальные клетки линии HUVEC физической гипоксией и TNF-a, моделирует дисфункцию эндотелия у пациентов с гипертонической болезнью и отвечает следующим параметрам: содержание апоптотических эндоте-лиоцитов должно быть не менее 19 %, эндоте-лиальных микрочастиц - не менее 41х104/мкл и сосудисто-эндотелиального фактора роста - не менее 190,864 пг/мл в питательной среде после применения условий эндотелиальной дисфункции. Модель эндотелиальной дисфункции in vitro позволяет экстраполировать данные на пациентов с гипертонической болезнью и изучать внутриклеточные механизмы патогенеза нарушения функции эндотелиальных клеток, генерации клеточных мембранных микрочастиц, а также эффекты лекарственных препаратов на молекулярном уровне. Повышение кон-
центрации сосудисто-эндотелиального фактора роста, определенное в модели эндотелиальной дисфункции in vitro и у пациентов с гипертонической болезнью, связано с повышением синтеза JNK и направлено на увеличение активации и пролиферации эндотелия. Цитопротективный эффект триметазидина на эндотелиальные клетки, определенный in vitro и in vivo, реализуется через воздействие на патогенетические мишени эндотелиальной дисфункции (снижение внутриклеточной концентрации биологически активных веществ) и ингибирование процесса образования эндотелиальных мембранных микрочастиц путем повышения синтеза ERK и уменьшения содержания MAPK с негативными эффектами. Кроме того, модель дисфункции эндотелия позволила подтвердить обнаруженное свойство триметазидина увеличивать содержание сосудисто-эндотелиального фактора роста в крови пациентов с гипертонической болезнью. Медикаментозное повышение концентрации сосудисто-эндотелиального фактора роста, контролирующего развитие сосудистых коллате-ралей, аргументирует улучшение самочувствия пациентов с гипертонической болезнью на фоне терапии цитопротекторами.
БЛАГОДАРНОСТИ
Авторский коллектив выражает благодарность за оказанную материально-техническую поддержку проекта ректору ГБОУ ВПО Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Д. Войно-Ясенецкого д.м.н., профессору И.П. Артюхову, исполнительному директору НИИ молекулярной медицины и пато-биохимии к.м.н., доценту Е.А. Пожиленковой, директору ООО «ВладКО» В.Д. Кожемякину, профессору Университета Хельсинки Э. Мерва-ала.
Работа выполнена при поддержке гранта ККФПНиНТД, 2012, гранта Университета Хельсинки, 2010.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Contreras F., Rivera M., Vasquez J. et al. Endothelial dysfunction in arterial hypertension // J. Hum. Hypertens. 2000. 14. (Suppl. 1). 20-25.
2. Ferroni P., Basili S., Paoletti V. et al. Endothelial dysfunction and oxidative stress in arterial hypertension // Nutr. Metab. Cardiovasc. Dis. 2006. 16. 222-233.
3. Thuillez C., Richard V. Targeting endothelial dysfunction in hypertensive subjects // J. Hum. Hypertens. 2005. 19. 21-25.
4. Tousoulis D., Papageorgiou N., Androulakis E. et al. Novel therapeutic strategies targeting vascular endothelium in essential hypertension // Expert Opin. Investig. Drugs. 2010. 19. (11). 1395-1412.
5. Wilasrusmee C., Da Silva M., Singh B. et al. A new in vitro model to study endothelial injury // J. Surg. Res. 2002. 104. (2). 131-136.
6. Chong A.-Y., Blann A.D., Lip G.Y.H. Assessment of endothelial damage and dysfunction: observations in relation to heart failure // Q. J. Med. 2003. (96). 253-267.
7. Инжутова А.И., Салмина А.Б., Петрова М. М. и др. Регистрация блеббинга плазматической мембраны лимфоцитов периферической крови как экспресс-метод оценки тяжести состояния больных осложненными формами гипертонической болезни // Бюл. СО РАМН. 2007. 123. (1). 6-10.
8. Dignat-George F., Boulanger C.M. The many faces of endothelial microparticles // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2011. (31). 27-33.
9. Yuana Y., Bertina R.M., Osanto S. Pre-analy-tical and analytical issues in the analysis of blood microparticles // Thromb. Haemost. 2011. (105). 396-408.
10. Tushuizen M.E., Diamant M., Sturk A. et al. Cell-derived microparticles in the pathogenesis of cardiovascular disease: friend or foe? // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2011. 31. (1). 4-9.
11. Corretti M.C., Anderson T.J., Benjamin E.J. et al. Guidelines for the ultrasound assessment of en-dothelial-dependent flow-mediated vasodilation of the brachial artery. A report of the international brachial artery reactivity task force // JACC. 2002. 39. (2). 257-265.
12. Fish J.E., Matouk C.C., Yeboah E. et al. Hy-poxia-inducible expression of a natural cis-antisense transcript inhibits endothelial nitric-oxide synthase // J. Biol. Chem. 2007. 282. (21). 15652-15666.
13. Stempien-Otero A., Karsan A., Cornejoi C.J. et al. Mechanisms of hypoxia-induced endothelial cell death. Role of p53 in apoptosis // J. Biol. Chem. 1999. 274. (12). 8039-8045.
14. Yamagishi S., Inagaki Y., Nakamura K. et al. Azelnidipine, a newly developed long-acting calcium antagonist, inhibits tumor necrosis factor-alpha-induced interleukin-8 expression in endothelial cells through its anti-oxidative properties // J. Cardiovasc. Pharmacol. 2004. (43). 724-730.
15. Demaison L., Fantini E., Sentex E. et al. Tri-metazidine: in vitro influence on heart mitochondrial function // Am. J. Cardiol. 1995. 76. (6). 31-37.
16. He S., Yan F., Zhan J. et al. Protective effects of trimetazidine against vascular endothelial cell injury induced by oxidation // J. Geriatr. Cardiol. 2008. (5). 248-251.
17. Suzuki H., Seto K., Shinoda Y. et al. Paracrine upregulation of VEGF receptor mRNA in endothe-
lial cells by hypoxia-exposed Hep G2 cells // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver. Physiol. 1999. 276. G92-G97.
18. Izuta H., Chikaraishi Y., Adachi T. et al. Extracellular SOD and VEGF are increased in vitreous bodies from proliferative diabetic retinopathy patients // Molecular Vision. 2009. 15. 2663-2672.
19. Iwata Y., Kuzuya F., Hayakawa M. et al. Circulating endothelial cells fail to induce cerebral infarction in rabbits // Stroke. 1986. 17. (3). 506-509.
20. Pirro M., Schillaci G., Paltriccia R. et al. Increased ratio of CD31+/CD42- microparticles to en-dothelial progenitors as a novel marker of atherosclerosis in hypercholesterolemia // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2006. 26. 2530-2535.
21. Neufeld G., Cohen T., Gengrinovitch S., Pol-torak Z. Vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptors // FASEB J. 1999. 13. 9-22.
22. Kantor P.F., Lucien A., Kozak R., Lopas-chuk G.D. The antianginal drug trimetazidine shifts cardiac energy metabolism from fatty acid oxidation to glucose oxidation by inhibiting mitochondrial long-chain 3-ketoacyl coenzyme A thiolase // Circ. Res. 2000. 86. 580-588.
23. Lopaschuk G., Stanley W. Regulation of myo-cardial carbohydrate metabolism under normal and ischemic conditions. Potentials for pharmacological intervention // Cardiovasc. Res. 1997. 33. 243-257.
24. Cromer W., Jennings M.H., Odaka Y. et al. Murine rVEGF164b, an inhibitory VEGF reduces VEGF-A-dependent endothelial proliferation and barrier dysfunction // Microcirculation. 2010. 17. (7). 536-547.
25. Argaud L., Gomez L., Gateau-Roesch O. et al. Trimetazidine inhibits mitochondrial permeability transition pore opening and prevents lethal ischemia-reperfusion injury // J. Mol. Cell. Cardiol. 2005. 39. (6). 893-899.
26. Morin D., Sapena R., Elimadi A., Testa B. et al. [3H]-Trimetazidine mitochondrial binding sites: regulation by cations, effect of trimetazidine derivatives and other agents and interaction with an endogenous substance // Br. J. Pharmacol. 2000. 130. (3). 655-663.
27. Devynck M.A., Le Quan Sang K.H., Joulin Y., Mazeaud M. Acute membrane effects of trimetazidine in human platelets // Eur. J. Pharmacol. 1993. 245. (2). 105-110.
28. Di Napoli P. Anti-ischemic cardioprotection with trimetazidine. Focus on vastarel MR // Heart Metab. 2008. 41. 25-29.
29. Инжутова А.И., Ларионов А.А., Петрова М.М., Салмина А.Б. Стабилизация клеточных мембран как цель сосудистой терапии // Кардиология. 2011. (4). 52-55.
30. Goon P.K.Y., Lip G.Y.H., Boos C.J. et al. Circulating endothelial cells, endothelial progenitor
cells, and endothelial microparticles in cancer // Neoplasia. 2006. 8. (2). 79-88.
31. Boos C.J., Lip G.Y.H., Blann A.D. Circulating endothelial cells in cardiovascular disease. // J. Am. Coll. Cardiol. 2006. 48. 1538-1547.
32. Reneman R.S., Arts T., Hoeks A.P.G. Wall shear stress - an important determinant of endothelial cell function and structure - in the arterial system in vivo // J. Vasc. Res. 2006. 43. 251-269.
33. Woywodt A., Bahlmann F.H., de Groot K. et al. Circulating endothelial cells: life, death, detach-
ment and repair of the endothelial cell layer // Nephrol. Dial. Transplant. 2002. 17. (10). 1728-1730.
34. Mack M., Kleinschmidt A., Brühl H. et al. Transfer of the chemokine receptor CCR5 between cells by membrane-derived microparticles: a mechanism for cellular human immunodeficiency virus 1 infection // Nat. Med. 2000. (6:7). 769-775.
35. Bebawy M., Combes V., Lee E. et al. Membrane microparticles mediate transfer of P-glycopro-tein to drug sensitive cancer cells // Leukemia. 2009. 23. 1643-1649.
THERAPEUTIC CORRECTION OF ENDOTHELIAL DYSFUNCTION: DATA OF THE TRANSLATIONAL MEDICINE
Alyona Ivanovna INZHUTOVA1!, Svetlana Anatoljevna FILIPPOVA2, Aleksey Anatoljevich LARIONOV3, Viktoria Vladimirovna BYKOVA1, Tatyana Vasiljevna NOVIKOVA1, Tatyana Pavlovna ORLOVA1, Irina Georgievna INZHUTOVA2, Marina Mikhajlovna PETROVA3, Alla Borisovna SALMINA1
institute of Molecular Medicine and Pathobiochemistry of Krasnoyarsk State Medical University named after Prof. V.F. Vojno-Yasenetsky 660022, Krasnoyarsk, Partizan Zheleznyak str., 1
2Krasnoyarsk Health and Care Center 660135, Krasnoyarsk, Voronov str., 39Б
3 Department of Ambulatory Therapy, Family Medicine and Healthy Life Style, Krasnoyarsk State Medical University named after Prof. V.F. Vojno-Yasenetsky 660022, Krasnoyarsk, Partizan Zheleznyak str., 1
Molecular mechanisms for the mend of functional condition of epithelial cells have been studied by the example of trimetazidine treatment of the patients with arterial hypertension and have been confirmed by in vitro simulation of endothelial dysfunction in cell culture HUVEC. It has been revealed that trimetazidine treatment increases VEGF production and synthesis of ERK, normalization of intracellular calcium concentration and free radicals level in endothelial cells. These molecular changes result in reduced apoptosis of endothelial cells, enhancing their functional activity and cell growth, accompanied by the decrease in the formation of cell membrane microparticles. Membrane microparticles play a key role not only in the development of endothelial dysfunction, but also they are as paracrine regulators of cell survival due to «dumping» excess of signaling proteins by endothelial-derived microparticles.
Key words: arterial hypertension, endothelial dysfunction, pathogenesis, treatment, membrane microparticles, HUVEC, trimetazidine.
\Inzhutova A.I.\ - candidate of medical sciences, senior researcher Filippova S.A. - doctor of functional diagnostics, e-mail: filsvet@mail.ru
Larionov A.A. - clinical attending physician of department of policlinic therapy and family medicine,
e-mail: adpersonamalexeylarionov@gmail.com
Bikova V.V. - student, e-mail: kgma21@mail.ru
Novikova T.V. - student, e-mail: tatiana_novik@mail.ru
Orlova T.P. - student, e-mail: tanush7@mail.ru
Inzhutova I.G. - candidate of medical sciences, head doctor, e-mail: irinainzhutova@gmail.com Petrova M.M. - doctor of medical sciences, professor, a head of department of policlinic therapy and family medicine, e-mail: stk99@yandex.ru
Salmina A.B. - doctor of medical sciences, professor, director, e-mail: allasalmina@mail.ru
