CC BY
10УДК 616.61:612.466:612.467 DOI: 10.29039/2224-6444-2022-12-2-49-53
МЕХАНИЗМ ПОВРЕЖДЕНИЯ ПОЧЕЧНОЙ ТКАНИ ПРИ НЕПОЛНОЙ ОБСТРУКЦИИ НИЖНИХ МОЧЕВЫВОДЯЩИХ ПУТЕЙ
Соснин Д. А., Островский О. В., Рогова Л. Н., Попова Т. А., Лютикова А. А., Ломинога К. В.
ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет», 400131, пл Павших Борцов 1, Волгоград, Россия
Для корреспонденции: Соснин Дмитрий Андреевич, врач клинико-лабораторной диагностики ГБУЗ «Волгоградская областная клиническая больница №3», e-mail: dasosnin@yandex.ru
For correspondence: Sosnin Dmitrii Andreievich, clinical laboratory diagnostics doctor of SBIHC Volgograd Regional Clinical Hospital No. 3, e-mail: dasosnin@yandex.ru
Information about authors:
Sosnin D. A., https://orcid.org/0000-0003-0771-7525 Ostrovkiy O. V., https://orcid.org/0000-0001-9827-9545 Rogova L. N., https://orcid.org/0000-0003-1046-0329 Popova T. A., https://orcid.org/0000-0001-6879-5127 Lutikova A. A., https://orcid.org/0000-0001-9351-0453 Lominoga K. V., https://orcid.org/0000-0002-9798-5939
РЕЗЮМЕ
Механизмы развития патологии клеток паренхимы почек при неполной обструктивной уропатии, вызванной нарушением оттока мочи, исследованы недостаточно полно. Материал и методы. Неполная обструкция нижних мочевыводящих путей моделировалась путем введения альгинатного материала в мочевой пузырь крыс. Животные выводились из эксперимента на 21 и 30 сутки. Функция митохондриального дыхания определялась полярографическим методом. Степень повреждения ядерной ДНК оценивалась методом комет-анализа. Результаты. Было выявлено угнетение дыхательного фосфорилирования первого и второго дыхательного комплекса митохондрий до 84% и 90% на 30 сутки эксперимента, отмечались признаки разобщения процессов дыхания и фосфорилирования в митохондрий клеток паренхимы почек. Комет-анализ установил увеличение содержания ДНК в хвостах комет на 38% к 30-м суткам эксперимента. Это позволяет констатировать увеличение числа разрывов ядерной ДНК в клетках почечной паренхимы при обструкции мочевыводящих путей. Выводы. Проведенное исследование показало важную роль в механизме внутриклеточного повреждения нарушения функции клеточного дыхания и последующее повреждение ядерного ДНК клеток почечной паренхимы
Ключевые слова: Неполная обструкция мочевыводящей системы, нарушение митохондриального дыхания, повреждение ДНК
THE MECHANISM OF KIDNEY TISSUE DAMAGE BY IN INCOMPLETE OBSTRUCTION OF THE LOWER URINARY TRACT
Sosnin D. A., Ostrovskiy O. V., Rogova L. N., Popova T. A., Lutikova A. A., Lominoga K. V.
Volgograd state medical university, Volgograd, Russia
SUMMARY
Violation of urine outflow is widespread in clinical practice, but the movement of kidney damage is not well understood in these conditions Materials and methods. Incomplete obstruction of the lower urinary tract was modeled by injecting alginate material into the bladder of rats. Animals were withdrawn from the experiment on days 21 and 30. Mitochondrial respiration has been studied by polarography. Nuclear DNA damage was studied using the comet method. Results. Inhibition of respiratory phosphorylation of the first and second respiratory complex of mitochondria was revealed, signs of uncoupling of the processes of respiration and phosphorylation of kidney parenchyma cells into mitochondria were noted. Comet analysis allows us to state an increase in the number of nuclear DNA breaks in the cells of the renal parenchyma during obstruction of the urinary tract. Conclusions. The study showed an important role in the mechanism of intracellular damage of dysfunction of cellular respiration and subsequent damage to the nuclear DNA of renal parenchyma cells.
Key words: The mechanism of development of obstructive uropathy, the pathogenesis of CKD, cellular respiration, DNA damage.
Согласно литературным данным, в последние чают вовремя адекватную терапию (как консер-
десятилетия отмечается рост заболеваемости до- вативную, так и хирургическую) [3]. Поэтому
брокачественной гиперплазией предстательной дальнейшее изучение механизмов повреждения
железы, приводящий к нарушению оттока мочи почечной паренхимы при неполной обструктив-
[1; 2]. Учитывая тот факт, что при волнообразном ной уропатии может помочь в разработке новых
течении ДГПЖ на 1 и 2 стадии обструкция ча- методов диагностики и консервативного лечения
сто носит невыраженный и интермиттирующий этого патологического состояния. характер, диагностика обструктивной уропатии Несмотря на господствующее мнение, о том,
бывает затруднена, а пациенты часто не полу- что ведущим звеном в патологии клеток почеч-
КРЫМСКИЙ ЖУРНАЛ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ И КЛИНИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ
ной паренхимы при длительной обструкции являются апоптоз эпителиоцитов канальцев и нефросклероз [4], детально внутриклеточные механизмы повреждения клеток изучены недостаточно [5].
Цель работы - выявление внутриклеточных механизмов повреждений клеток почек при неполной обструктивной уропатии, воспроизведенной экспериментально.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Методика исследования. Обструктивная уро-патия воспроизводилась в эксперименте на 50 самках крыс, поделенных на две группы. В первую подопытную группу вошло 36 крыс, во вторую, контрольную - 14. Крысам первой группы моделировали уропатию путем введения в уретру стоматологического материала «Orthoprint» (highly elastic) Zhermac (Италия), вызывающего формирование в мочевом пузыре искусственных конкрементов диаметром 7-15 мм [6]. Крысам контрольной серии не проводилось моделирование обструкции. Животные выводились из эксперимента путем декапитации на 21-е и 30-е сутки эксперимента.
Для оценки фосфорилирующей способности митохондрий применялся полярографический метод [7; 8]. Почечную ткань гомогенизировали на гомогенизаторе Поттера-Эльвейма в соотношении 1:5 со средой выделения (220 мМ маннита, 100 мМ сахарозы). После осаждения клеточных ядер и дебриса полученный суперна-тант центрифугировали при той же температуре 0-2°С на 6000 об/мин в течении 20 минут. Полученную митохондриальную фракцию осадка ресуспендировали в 1 мл среды выделения.
Полярография проводилась на Oxytherm (Великобритания), с использованием малата калия, сукцината калия, ротенона (ингибитор дыхательной цепи), АДФ. В качестве рабочего катода восстановления кислорода использовалась платина, для электрода сравнения - серебро. Измерение проводилось при последовательном внесении суспензии митохондрий, малата, АДФ, сукцината, АДФ, ротенона, АДФ. Полярограммы обрабатывались в программе OxyTrace+. Рассчитывалось отношение молярного количества добавленного АДФ к количеству стимулированного им поглощения кислорода (метод Чанса-Вильямса), отношение скорости окисления в присутствии АДФ к скорости окисления после исчерпания АДФ (дыхательный контроль).
Для выявления степени повреждений ДНК в ядрах клеток почечной паренхимы применялся метод кометного анализа [9; 10]. Гомогенаты клеточной ткани вносили в 0,5% гель агарозы в фосфатном буфере, затем полученную смесь рас-
пределяли по поверхности предметного стекла. Электрофорез проводили в горизонтальной камере в течении 20 мин (напряженность поля I В/ см, сила тока -300 мА) после предварительного лизиса клеток. Приготовленные препараты после фиксации и окраски микроскопировали на флуоресцентном микроскопе при длине волны 530 нм. Цифровые изображения клеток дифференцировали на клетки без дефрагментации и клетки с различной степенью дефрагментации при помощи программы CometScore 2.0.0.38 («TritekCorp.» США). Статистическая обработка полученных данных проводилась с помощью программ Statistica 6.0 («Dell» США). В качестве параметров, отражающих степень повреждения ДНК, рассматривались процент ДНК в хвостах комет (количество мигрировавшего ДНК в хвост), а также индекс ДНК-комет (отношение суммы ДНК-комет каждого типа к общей сумме подсчитанных ДНК-комет). Достоверность отличия выборок оценивалось по критерию Краске-ла-Уоллиса с последующими множественными сравнениями по Бонферрони-Данну.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Результаты исследования дыхательных функций митохондрий представлены в таблице 1.
Дыхательная активность митохондрий клеток почечной паренхимы на 21-е сутки с момента моделирования обструктивной уропатии по отношению к контрольной группе в стадию V-1 увеличивалась на 140% и уменьшалась на 12% у крыс, выведенных на 30-е сутки эксперимента.
На 21-е сутки эксперимента уровень процесса окислительного фосфорилирования был ниже аналогичных показателей контрольной группы на 46% для первого комплекса дыхательной цепи и на 49% для второго. На 30-е сутки об-структивной уропатии показатели окислительного фосфорилирования для первого и второго комплексов дыхательной цепи были снижены на 84% и 90% соответственно.
Митохондриальное дыхание в состоянии после исчерпания АДФ было снижено на 15% на 21-й день обструктивной уропатии и на 60% на 30-е сутки эксперимента. Показатель дыхательного контроля для первого комплекса дыхательной цепи был ниже по сравнению с аналогичным показателем контрольной группы на 33% на 21-е сутки эксперимента и на 55% на 30-е сутки обструктивной уропатии. Для второго комплекса дыхательной цепи дыхательный контроль был ниже на 50% и на 60% на 21-е и 30-е сутки эксперимента соответственно.
Как видно из рисунка 1, люминисцентная микроскопия выявила размывание электрофорезом контуров ядер клеток почек крыс с обструктив-
Таблица 1
Скорость поглощения кислорода митохондриями клеток почек, нмоль O2/мин/мг-белка
Клетки почек контрольная группа
V! V3-1 V3-2 V4-1 V3/4-1 V3/4-2
Ме 14,28 114,62 72,62 32,75 3,35 3,17
(01-03) 13,71-15,55 78,17-128,51 69,0-75,21 24,04-37,86 3,16-3,55 3,12-3,32
Клетки почек на 21-е сутки обструкции
V1 V3-1 V3-2 V4-1 V3/4-1 V3/4-2
Ме 34,68* 62,14 36,72* 27,76 2,24* 1,56*
(01-03) 25,48-51,87 42,18-95,74 25,57-54,79 19,87-40,10 2,13-2,39 1,42-1,82
Клетки почек на 30-е сутки обструкции
V1 V3-1 V3-2 V4-1 V3/4-1 V3/4-2
Ме 11,24* 18,47* 7,09* 12,76* 1,50* 1,25*
(01-03) 10,75-11,58 18,42-19,25 6,34-7,37 12,17-14,14 1,48-1,53 1,20-1,29
Примечание. Ме - медиана, (01-03) - интерквартильный размах. * - изменения статистически достоверны по критерию Краскела-Уоллиса по сравнению контрольной группой при р<0,05. VI -скорость поглощения кислорода после добавления митохондрий, V3-1 - дыхание в состоянии окислительного фосфорилирования (по Чансу) для первого комплекса дыхательной цепи, V3-2 дыхание в состоянии окислительного фосфорилирования (по Чансу) для второго комплекса дыхательной цепи, V4-1 - скорость дыхания после исчерпания АДФ (по Чансу) для первого комплекса дыхательной цепи, V3/V4-1, V3/V4-2 - дыхательный контроль для первого и второго комплекса дыхательной цепи соответственно
ной уропатией, что может говорить о наличии повреждений ДНК при данном патологическом процессе. Результаты математической обработки изображений отражены в таблице 2. В почках крыс на 21-е сутки обструктивной уропатии относительно контрольной группы содержание ДНК в хвостах клеточных ядер увеличивалось на 28%. На 30-е сутки эксперимента данный показатель был увеличен на 36%. Кроме того, индекс ДНК комет на 40% превышал аналогичный показатель клеточных ядер паренхимы почек крыс контрольной группы.
Рис.1. Микрофотографии ядер клеток почечной паренхимы: А - неповрежденной ДНК (контрольная группа), Б - дефрагментированной ДНК (30-е сутки эксперимента)
ОБСУЖДЕНИЕ
Повышение показателей базового дыхания у животных на 21-е сутки эксперимента связано,
Таблица 2
Параметры распределения процента ДНК в хвостах комет в клетках почек крыс при неполной обструкции нижних мочевыводящих путей
Группа Содержание ДНК в хвосте кометы Индекс ДНК комет
М М+д ИП М М+д ИП
Контроль 4,21 3,39-5,03 0,1 0,05-0,15
21 сутки 5,4* 4,3-6,5 1,28 0,13 0,04--0,22 1,3
30-е сутки 5,81* 4,7-6,92 1,36 0,24* 0,22-0,26 2,4
Примечание. * - достоверные отличия при уровне значимости р<0,05; М - среднее значение, д -стандартное отклонение, ИП - Индекс повреждения - отношение ДНК в хвосте кометы опытной группы к аналогичному показателю контрольной
2022, т. 12, № 2
КРЫМСКИЙ ЖУРНАЛ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ И КЛИНИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ
очевидно, с нарушением целостности митохондрий и утечкой электронов. Снижение показателей базового дыхания, дыхания в состоянии окислительного фосфорилирования может быть проявлением деградации и последующего окисления белков первого и второго комплекса дыхательной цепи. Уменьшение дыхательного контроля как на 21-е, так и на 30-е сутки с начала моделирования развивается, очевидно, вследствие разобщения процессов дыхания и фосфорилирования в поврежденных клетках почечной паренхимы при неполной обструктивной уропатии.
Увеличение общего содержания и индекса ДНК в хвостах кометах ядер клеток почечной паренхимы могут отражать увеличение числа повреждений ядерного ДНК в процессе развития неполной обструктивной уропатии.
Общепринятым считается, что при затруднении пассажа мочи происходит повышение гидростатического давления в почечных канальцах, что, за счет механического сдавливания, развивающегося восходящего инфекционного процесса и эндогенной интоксикации, приводит к нарастающим внутриклеточным повреждениям эпителиоцитов [11]. Эпителиоциты при обструктивной уропатии чаще всего гибнуть за счет апоптоза, что ведет в свою очередь к уменьшению числа функционирующих нефронов и сопровождается развитием нефросклероза [12]. Результаты нашего исследования подтверждают и дополняют существующие представления о механизме развития обструктив-ной уропатии. Характерными внутриклеточными процессами при обструктивной уропатии являются повреждение белков дыхательного пути и разобщение процессов дыхания и фосфорилирова-ния, что, за счет увеличения свободных форм кислорода, по нашему мнению, способно приводить к увеличению числа повреждения ядерной ДНК и запуску механизма апоптоза. Выявленные нами более выраженные нарушения клеточного дыхания при обструктивной уропатии, по сравнению с умеренным нарастанием разрывов ДНК, могут говорить о том, что патологические процессы в митохондриях предшествуют деструктивным процессам в ядерной ДНК.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Полученные нами данные позволяют дополнить картину развития повреждения почечной паренхимы при неполной (варьирующей) об-структивной уропатии. Нарушение клеточного дыхания и увеличение повреждений ядерного ДНК могут предшествовать и запускать механизмы клеточной гибели по типу апоптоза, что в конечном итоге способно приводить к прогресси-рованию хронической болезни почек. Результаты исследования могут помочь в разработке консер-
вативной терапии при невозможности хирургического устранения причин обструкции мочевы-водящих путей.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов
Conflict of interest. The authors have no conflict of interests to declare.
ЛИТЕРАТУРА
1. Esprit D. H., Koratala A., Chornyy V., Wingo C. S. Obstructive nephropathy without hydronephrosis: suspicion is the key. Urology. 2017;101(1):9. doi: 10.1016/j.urology.2016.11.041.
2. Robert G., Taille A., Descazeaud A. Epidemiology of benign prostatic hyperplasia. Prog Urol . 2018;28(15): 803. doi:10.1016/j. purol.2018.08.005
3. Guo R. Q., Yu W., Meng Y. S. Correlation of benign prostatic obstruction-related complications with clinical outcomes in patients after transurethral resection of the prostate. Kaohsiung J. Med. Sci. 2017;33(3): 144. doi:10.1016/j.kjms.2017.01.002
4. Klahr S., Morrissey J. Obstructive nephropathy and renal fibrosis. Am J Physiol Renal Physiol. 2002;283(5):861. doi:10.1152/ ajprenal.00362.2001
5. Chevalier R. L., Thornhill B. A., Forbes M. S., Kiley S. C. Mechanisms of renal injury and progression of renal disease in congenital obstructive nephropathy. Pediatr. Nephrol. 2010;25(4):687. doi: 10.1152/ajprenal.00362.2001
6. Смирнов А. В., Кропачев А. Ю., Почепцов А. Я., Соснин Д. А. Ультраструктура эпителиоци-тов проксимальных канальцев почек при варьирующей (непостоянной) окклюзии мочевыводящих путей. Вестник ВолГМУ. 2008;2(26): 56.
7. Кондрашева М. Н., Аланенко А. А. Обследование состояния выделенных митохондрий. Руководство по изучению биологического окисления полярографическим методом. М.: Наука; 1973.
8. Методы изучения митохондрий растений. Полярография и электрофорез. Под ред. Саляева Р.К. М.: СИФИБР; 2004.
9. Филиппов Э. В. Использование метода ДНК-комет для детекции и оценки степени повреждений ДНК клеток организмов растений, животных и человека, вызванных факторами окружающей среды. М: Наука и образование; 2014.
10. Uno Y. JaCVAM-organized international validation study of the in vivo rodent alkaline comet assay for detection of genotoxic carcinogens: II. Summary of definitive validation study results. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 2015;78(1):45. doi:10.1016/j.mrgentox.2015.04.010
11. Nogueira A., Pires M. J., Oliveira P. Pathophysiological Mechanisms of Renal Fibrosis: A Review of Animal Models and Therapeutic Strategies. In Vivo. 2017;31(1):1. doi: 10.21873/ invivo.11019
12. Faulkner J. L., Szcykalski L.M., Springer F., Barnes J. L. Origin of interstitial fibroblasts in an accelerated model of angiotensin Il-induced renal fibrosis. Am. J. Pathol. 2005;167(5):1193. doi:10.1016/S0002-9440(10)61208-4
REFERENCES
1. Esprit D. H., Koratala A., Chornyy V., Wingo C. S. Obstructive nephropathy without hydronephrosis: suspicion is the key. Urology. 2017;101(1):9. doi: 10.1016/j.urology.2016.11.041.
2. Guo R. Q., Yu W., Meng Y. S. Correlation of benign prostatic obstruction-related complications with clinical outcomes in patients after transurethral resection of the prostate. Kaohsiung J. Med. Sci. 2017;33(3):144. doi:10.1016/j.kjms.2017.01.002
3. Robert G., Taille A., Descazeaud A. Epidemiology of benign prostatic hyperplasia. Prog Urol. 2018;28(15):803. doi:10.1016/j. purol.2018.08.005
4. Klahr S., Morrissey J. Obstructive nephropathy and renal fibrosis. Am J Physiol Renal Physiol. 2002;283(5):861. doi:10.1152/ ajprenal.00362.2001
5. Chevalier R. L., Thornhill B. A., Forbes M. S., Kiley S. C. Mechanisms of renal injury and progression of renal disease in congenital obstructive nephropathy. Pediatr. Nephrol. 2010;25(4):687. doi:10.1152/ajprenal.00362.2001
6. Smirnov A., Kropachev A., Pocheptsov A, Sosnin D. Ultrastructure of proximal tubular epitheliocytes in unstable occlusion of urinary tract. Journal of VolSMU. 2008;2(26): 56. (In Russ.).
7. Kondrasheva M. N., Alanenko A. A. Examination of the state of isolated mitochondria. Guide to the study of biological oxidation by the polarographic method. Moscow: Nauka; 1973. (In Russ).
8. Salyaeva R. K. Methods for studying plant mitochondria. Polarography and electrophoresis. Moscow: SIFIBR; 2004. (In Russ.).
9. Filippov, E. V. Use of the DNA comet method for detection and assessment of the degree of DNA damage in plant, animal and human cells caused by environmental factors. Moscow: Science and education; 2014. (In Russ.).
10. Uno Y. JaCVAM-organized international validation study of the in vivo rodent alkaline comet assay for detection of genotoxic carcinogens: II. Summary of definitive validation study results. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 2015;78(1): 45. doi:10.1016/j.mrgentox.2015.04.010
11. Nogueira A., Pires M. J., Oliveira P. Pathophysiological Mechanisms of Renal Fibrosis: A Review of Animal Models and Therapeutic Strategies. In Vivo. 2017;31(1):1. doi:10.21873/ invivo.11019
12. Faulkner J. L., Szcykalski L.M., Springer F., Barnes J. L. Origin of interstitial fibroblasts in an accelerated model of angiotensin II-induced renal fibrosis. Am. J. Pathol. 2005;167(5):1193. doi:10.1016/S0002-9440(10)61208-4
