CC BY
20
Биомедицина • № 2, 2017, С. 45-52
Механизм антигипоксического действия нового металлокомплекса железа - производного винилимидазола
С.А. Шахмарданова1, П.А. Галенко-Ярошевский2, Ф.Б. Литвин3, В.В. Тарасов1, М.Л. Максимов1, С.С. Сологова1
1 - ФГБОУВО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М.Сеченова, Москва
2 - ФГБОУВО Кубанский государственный медицинский университет, Краснодар
3 - ФГБОУВПО Смоленская государственная академия физической культуры, спорта и туризма, Смоленск
Контактная информация: к.б.н. Шахмарданова СветланаАнатольевна, lebedeva502@yandex.ru
В экспериментах на лабораторных животных (белые нелинейные мыши и крысы) изучено новое металлокомплексное соединение железа - производное винилимидазола под шифром «Тетравим» с антигипоксической активностью. Показано, что однократное внутрибрюшинное введение Тетравима в дозе 50 мг/кг не изменяет показатели гемограммы, приводит к снижению окислительного обмена, предотвращению гипогликемии, возникающей в условиях острой гипобарической гипоксии (ОГБГ), улучшению гемодинамики и эффективности кислородного обмена в тканях, уменьшению негативного воздействия ОГБГ на показатели микроциркуляции.
Ключевые слова: антигипоксанты, металлокомплекс железа, гипоксия, окислительный обмен, гемограмма, микроциркуляция.
Введение
Металлокомплексное соединение железа на основе винилимидазола [тетра(1-винилимидазол) железа трих-лорид] под шифром «Тетравим» синтезировано в лаборатории акад. Б.А. Трофимова Иркутского института химии имени А.Е. Фаворского СО РАН. В настоящее время показана антигипокси-ческая активность данного комплекса в широком диапазоне доз (5-250 мг/кг) на моделях острой гипоксии разного гене-за (гипобарической, гемической, гисто-токсической, гипоксии с гиперкапнией)
[9, 16].
Железо - эссенциальный экологически значимый и жизненно необходимый
организму элемент. Он является индуктором перекисного окисления липидов, мощным активатором кроветворения и незаменимым компонентом гемоглобина, миоглобина, ферритина, гемо-сидерина, лактоферрина и др. белков, обеспечивающих необходимый уровень системного и клеточного метаболизма, принимает участие в транспорте кислорода, окислительно-восстановительных реакциях, входит в состав более ста ферментов (цитохромы, каталазы, перокси-дазы, железосеропротеиды и др.), играет важную роль в процессах выделения энергии, ферментативных реакциях, метаболизме холестерина [4, 7, 18, 20, 21]. Роль винилимидазола как лиганда в из-
учаемом металлокомплексе, по-видимому, заключается в обеспечении высокой биодоступности железа.
Цель исследования - изучить влияние Теравима на окислительный и углеводный обмен, показатели гемограммы, изменения микроциркуляции и определить возможное направление по изучению механизма его антигипоксического действия.
Материалы и методы
Синтез тетравима описан ранее [11]. Структурная формула представлена на рис. 1. ЛД50 для мышей составляет 1625 мг/кг [9, 16].
О
FeCb
N
сн=сн,
"-1 4
Рис. 1. Структурная формула Тетравима.
Исследования проведены на 120-ти белых нелинейных половозрелых мышах-самцах массой 18-23 г и 40-ка белых нелинейных половозрелых крысах-самцах массой 180-220 г в соответствии со статьей 11-й Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации (1964), Правилами надлежащей лабораторной практики (Приказ Минздрава России от 01.04.2016 г. № 199н). Содержание, питание, уход за животными и выведение их из эксперимента осуществляли согласно требованиям ГОСТ Р от 02.12.2009 53434-2009 «Принципы надлежащей лаборатор-
ной практики (GLP)» [12]. Животных доставляли из Филиала «Андреевка» ФГБУН НЦБМТ ФМБА России (Московская обл.) и содержали на стандартной диете в условиях свободного доступа к водопроводной очищенной воде. Эксперименты проводили после 20-дневной адаптации в виварии. Животных содержали в соответствии с нормами группового размещения в вентилируемых клетках при температуре 18-20°С и относительной влажности воздуха 60-70% в условиях естественно-искусственного 12-часового цикла освещения.
Тетравим вводили однократно в/б за 1 ч до начала эксперимента в эффективной антигипоксической дозе 50 мг/кг. Контрольные животные тем же путем и в тот же срок получали равный объем дистиллированной воды.
Острую гипобарическую гипоксию (ОГБГ) у мышей вызывали пребыванием на «высоте» 7500 м в электровакуумной печи в течение 20-ти мин. Скорость «подъема» составляла 50 м/с.
Интенсивность окислительного обмена у мышей оценивали по параметрам потребления кислорода и ректальной температуры с использованием разобщителя окислительного фосфорилиро-вания 2,4-динитрофенола (DNP) в дозе 5 мг/кг [5]. Потребление кислорода мышами определяли в аппарате закрытого типа конструкции С.В. Миропольского в течение 9-12 мин после предварительной адаптации животных в респира-ционной камере (10 мин). Количество потребляемого мышами кислорода рассчитывали в мл за 1 мин [13]. Ректальную температуру мышам измеряли с помощью электрического медицинского термометра.
Содержание глюкозы в сыворотке крови мышей регистрировали на биохимическом анализаторе CLIMA MC-15 (RAL, Испания). Морфологические показатели крови мышей, содержание гемоглобина и гематокрита определяли на гематологическом 18-параметровом анализаторе-автомате Exell 18 (Drew, Нидерланды). Забор крови производили из сосудов шеи декапитированного животного через 1 ч после введения Тетравима в условиях нормоксии и после пребывания животных в условиях ОГБГ (20 мин).
Параметры микрогемодинамики и оксигенации крови в системе микроциркуляции оценивали, одновременно используя лазерную допплеровскую флоуметрию и оптическую тканевую ок-симетрию. Измерения проводили с помощью многофункционального лазерного диагностического комплекса «ЛАКК-М» (НПП «Лазма», Россия). Капиллярный кровоток оценивали на наружной поверхности кожи бедра задней конечности крысы. Регистрировали показатель микроциркуляции (М), который показывает динамическую характеристику микро-
циркуляции - изменение потока крови в единицу времени в исследуемом объеме ткани около 1 мм3 в относительных пер-фузионных единицах (пф. ед.), индекс перфузионной сатурации кислорода в микрокровотоке (Sm=S02/M, где S02 -сатурация микрокровотока, M - среднее значение перфузии), параметры удельного потребления кислорода тканями (и=$р02^02, где Sр02 - сатурация артериальной крови) и эффективность кислородного обмена (Е) [8].
Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью компьютерной программы Microsoft Excel ХР и STATISTICA 6.0 с использованием t-критерия Стьюдента. Статистически достоверными считали различия при р<0,05 по сравнению с контрольными значениями.
Результаты и их обсуждение
Изменения показателей окислительного обмена у мышей после введения Тетравима, DNP и их сочетания по сравнению с контрольной группой представлены на рис. 2, 3.
Рис. 2. Влияние Тетравима (50 мг/кг), БКР (5 мг/кг) и их сочетаний на потребление кислорода мышами (п=10).
Примечание: приведены значения в % к контролю, принятому за 100%; * - различия достоверны при р<0,05.
47 Бюте&ете • № 2, 2017
Рис. 3. Влияние Тетравима (50 мг/кг), БКР (5 мг/кг) и их сочетаний на ректальную температуру мышей (п=10). Примечание - как на рис. 2.
Тетравим снижал потребление кислорода и уменьшал неблагоприятное влияние на этот показатель Уменьшение параметров окислительного обмена под влиянием Тетравима, возможно, является одной из причин резистентности организма животных к кислородной недостаточности. Известно, что в состоянии пониженного обмена организм приобретает устойчивость к неблагоприятным воздействиям внешней и внутренней среды [10,15]. Наряду с другими факторами защиты организма в условиях дефицита кислорода целесообразно применение веществ, снижающих интенсивность метаболизма [2, 14].
По всей видимости, Тетравим влияет на механизмы образования энергии в организме через усиление анаэробного пути при кратковременном подавлении аэробного окислительного фосфори-лирования. Однако эти предположения требуют проведения дополнительных исследований. Восстановление газообмена спустя сутки после введения соединения можно объяснить его значи-
тельным выведением к этому сроку и/или образованием метаболитов, не влияющих на потребление кислорода. Получение энергии более экономичным путем можно объяснить тем, что соединение вмешивается в механизм сопряжения окисления с фосфорилиро-ванием в митохондриях. Поэтому можно предполагать, что исследованный ме-таллокомплекс благоприятно влияет на функции митохондрий в экстремальных условиях, уменьшая разобщение окисления с фосфорилированием [16].
В условиях ОГБГ содержание глюкозы в крови мышей уменьшалось на 25% (р<0,05) по сравнению с контрольными значениями. Уровень глюкозы у животных, которым вводили Тетравим в дозе 50 мг/кг, не изменялся. У мышей, получавших исследуемое металлокомплекс-ное соединение за 1 ч до воздействия гипоксии, концентрация глюкозы практически не отличалась от контрольной группы и на 40% была выше по сравнению с животными, которым не вводили Тетравим до воздействия ОГБГ (р<0,05).
Поскольку главной мишенью для гипоксии является энергетический обмен [6], кислородная недостаточность может быть причиной нарушения различных энергозависимых процессов в клетке и приводить к дисбалансу в обмене веществ, в частности, глюкозы [3]. Тетравим не влиял на содержание глюкозы в крови мышей, но предотвращал гипогликемию, возникающую в условиях ОГБГ.
Воздействие ОГБГ увеличивало содержание эритроцитов, гемоглобина и гематокрита, что повышает кислородную емкость крови и на уровне организма является компенсаторным приспособлением, выработанным в процессе эволюции в условиях недостатка кислорода [1]. На фоне введения Тетравима в дозе 50 мг/кг в условиях нормоксии и ОГБГ не происходило статистически значимого изменения морфологических показателей крови, гемоглобина и гематокрита (см. табл. 1).
Доставка О2 к тканям зависит от возможностей системы кровообращения [19], а микроциркуляторное русло является ключевым звеном сопряжения местных тканевых и интегральных систем регуляции структурно-функционального гомеостаза, обеспечивающим соответствие поставки энергетических субстратов и кислорода метаболическим запросам клетки [17]. Под воздействием ОГБГ показатель «М» снижался в 4 раза, что связано с первоочередным перераспределением кровотока в жизненно важные органы, повышением агрегационной активности эритроцитов и тромбоцитов, а также увеличением вязкости цельной крови и плазмы. Вслед за ограничением перфузии в кожных покровах экспериментальных животных закономерно снижаются и показатели транскапиллярного обмена (Бт, и и Е), поскольку клетки покровных тканей отличаются повышенной устойчивостью к недостатку кислорода. Спустя 1 ч после введения Тетра-
Таблица 1
Влияние Тетравима (50 мг/кг), ОГБГ и их сочетаний на показатели гемограммы, гемоглобина и гемоглобина и гематокрита
Показатель Контроль ОГБГ Тетравим ОГБГ+Тетравим
абс. % абс. % абс. %
Лейкоциты, х109 г/л 5,8±0,3 5,9±1,1 102 6,5±0,2 112 6,5±0,7 112
Лимфоциты, х109 г/л 4,3±0,5 4,4±0,3 102 4,9±0,5 114 5,0±0,4 116
Моноциты, х109 г/л 1,0±0,1 0,9±0,1 90 1,1±0,1 110 1,1±0,3 110
Гранулоциты,х109 г/л 0,5±0,1 0,6±0,1 112 0,5±0,1 100 0,5±0,2 100
Эритроциты, х1012 г/л 5,6±0,5 7,1±0,3 127* 6,1±0,3 109 5,6±0,2 100
Гемоглобин, г/л 131,0±3,9 152,0±1,2 116* 125,0±6,7 96 144±4,1 110
Гематокрит, % 30,2±2,5 34,8±0,2 115* 28,8±3,0 95 30,1±1,2 99
Тромбоциты, х109 г/л 375,0±28,0 338,0±19,0 90 338,0±23,0 90 405,0±14,0 108
Примечание: * - различия достоверны при р<0,05.
49
Бюте&ете . № 2, 2017
Таблица 2
Влияние Тетравима (50 мг/кг), ОГБГ и их сочетаний на микрогемодинамику и
тканевую оксигенацию
Вещество и характер воздействия М (пф. ед.) Sm (отн. ед.) U (отн. ед.) Е (отн. ед.)
абс. % абс. % абс. % абс. %
Контроль 13,3±1,4 100 4,8±0,58 100 1,9±0,39 100 25,2±1,2 100
ОГБГ 3,1±0,8 23* 3,9±0,23 81* 0,9±0,21 47* 13,5±0,8 54*
Тетравим 17,0±1,2 128* 4,7±0,30 98 2,0±0,70 105 35,3±2,4 140*
Тетравим+ОГБГ 13,7±1,0 103 5,0±0,90 104 2,0±0,45 105 27,5±1,9 109
вима его действие резко ослабевает, что проявляется восстановлением микрокровотока и биогенеза на микроциркулятор-ном уровне (см. табл. 2).
Выводы
1. Однократное в/б введение Тетравима в дозе 50 мг/кг вызывает уменьшение энергетических запросов организма, повышает его устойчивость к недостатку кислорода, увеличивая, тем самым, продолжительность жизни в условиях острой гипоксии. Тетравим воздействует на функции митохондрий в экстремальных условиях путем уменьшения разобщения окисления с фосфорилированием.
2. Исследуемый металлокомплекс предотвращает гипогликемию, возникающую в условиях ОГБГ, и не изменяет показатели гемограммы.
3. Введение экспериментальным животным Тетравима в дозе 50 мг/кг сопровождается формированием адаптационных процессов на уровне системы микроциркуляции, направленных на ограничение притока крови в обменное звено и снижение обмена кислорода на клеточном уровне.
4. Указанные изменения могут являться факторами механизма антигипоксического действия нового металлоком-плекса железа под шифром «Тетравим».
Список литературы
1. Антонов B.C., Богомолова Н.В., Волков A.C.
Автоматизация гематологического анализа. Интерпретация показателей гемограммы. -Саратов: Изд-во Сарат. мед. ун-та, 2008. 194 с.
2. Безкишкий Э.Н., Емушинцев П.А., Гро-шилин C.M. Расширение функциональных возможностей организма водолазов путем комбинированного применения ГБО и гипок-сической тренировки // Мат. V Всерос. конф. «Мед.-физиол. пробл. экологии человека». -Ульяновск, 2011. С. 111-113.
3. Германова Э.Л. Нарушения энергетического обмена при гипоксии и их коррекция с помощью сукцинатсодержащего содинения прок-сипин: дис. ... канд. биол. наук. - М., 2008. 172 с.
4. Громова O.A., Торшин И.Ю., ХаджидисА.К.
Анализ молекулярных механизмов воздействия железа (II), меди, марганца в патогенезе железодефицитной анемии // Клин. фармакология и фармаэкономика. 2010. №1.С. 1-9.
5. Егорова С.Е. Влияние производного 1-алке-нилимидазола под шифром Аллим-1, 2,4-ди-нитрофенола и их сочетаний на некоторые показатели окислительного обмена мышей // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. 2013. Т. 93. № 5. С. 138-140.
6. Кашуро В.А., Долго-Сабуров В.Б., Башарин В.А., Бонитенко Е.Ю., Лапина Н.В. Некоторые механизмы нарушения биоэнергетики и оптимизация подходов к их фармакотерапии //MEDLINE.RU. 2010. Т. 11.№ 2. С. 611-634.
7. Керимкулова Н.В., Торшин И.Ю., Громова О.А. и др. Систематический анализ молеку-лярно-физиологических эффектов синергич-ного воздействия железа, марганца и меди на соединительную ткань // Гинекология. 2012. Т. 14. № 6. С. 51-60.
8. Крупаткин А.И., Сидоров В.В., Баранов
B.В. Колебательный контур регуляции линейной скорости капиллярного кровотока // Регионарное кровообращение и микроциркуляция. 2007. Т. 6. № 3. С. 148.
9. Лебедева С.А. Сравнительная оценка антиги-поксической активности нового металлокомплекса железа // Инновации в современной фармакологии / мат-лы IV Съезда фармакологов России. - Казань. 2012. С. 116.
10. Новиков В.Е., Левченкова О.С., Парфенов Э.А. Фармакологические свойства нового ан-тигипоксанта pQ-4 // Бюлл. сибирской медицины. 2006. С. 65-67.
11. Трофимов Б.А., Самойлов Н.Н., Бабаниязов Х.Х., Станкевич В.К., Нечипоренко С.П. и др. Производные 1-алкенилимидазола. Патент РФ № 2397175/23, 20.08.2010.
12. Руководство по лабораторным животным и альтернативным моделям в биомедицинских исследованиях / под ред. Н.Н. Каркищенко,
C.В. Грачева. - М.: Профиль-2С. 2010. 358 с.
13. Саноцкий И.В. Методы определения токсичности и опасности химических веществ (токсикометрия). - М., 1970. 344 с.
14. Сороко С.И., Бурых Э.А. Внутрисистемные и межсистемные перестройки физиологических параметров при острой экспериментальной гипоксии // Физиол. человека. 2004. Т. 30. № 2. С. 58-66.
15. Чернилевский В.Е. Проблема гипобиоза и продления жизни // Сборник МОИП № 41. Секция геронтологии. - М., 2008. С. 105-123.
16. Шахмарданова С.А. Исследование острой токсичности и антигипоксической активности новых металокомплексов железа // Саратовский научно-медицинский журнал. Т. 11. № 1. 2015. С. 146-150.
17. Шилов В.Н. Молекулярные механизмы структурного гомеостаза. - М.: Интерсигнал, 2006. 288 с.
18. Cadet Е., GadenneM., CaprontD., etal. Donnes recentes sur metabolisme du fer: un etat de transition // Rev. Med. 2005. No. 26. Pp. 315-324.
19. Corral L., Javierre C., Blasi J., et al. Combined intermittent hypobaric hypoxia and muscle electro-stimulation: a method to increase circulating progenitor cell concentration? // J. Transl. Med. 2014. Vol. 19. Pp. 12-17.
20. DefrereS., LousseJ.C., Gonzalez-RamosR., et al. Potential involvement of iron in the pathogenesis of peritoneal endometriosis // Mol. Hum. Reprod. 2008. Vol. 14(7). P. 377.
21. Dimitrov J.D., Vassilev T.L., Andre S., et al.
Functional variability of antibodies upon-oxi-dative processes // Autoimmun Rev. 2008. Vol. 7(7). Pp. 574-578.
References
1. Antonov V.S., Bogomolova N.V., Volkov A.S.
Avtomatizacija gematologicheskogo analiza. Interpretacija pokazatelej gemogrammy. -Saratov: Izd-vo Sarat. med. un-ta, 2008. 194 s.
2. Bezkishkij Je.N., Emushincev P.A., Groshilin S.M. Rasshirenie funkcional'nyh vozmozhnostej organizma vodolazov putem kombinirovannogo primenenija GBO i gipoksicheskoj trenirovki // Mat. V Vseros. konf. «Med.-fiziol. probl. jekologii cheloveka». - Ul'janovsk, 2011. S.111-113.
3. GermanovaJe.L. Narushenijajenergeticheskogo obmena pri gipoksii i ih korrekcija s pomoshh'ju sukcinatsoderzhashhego sodinenija proksipin: dis. ... kand. biol. nauk. - M., 2008. 172 s.
4. Gromova O.A., Torshin I.Ju., Hadzhidis A.K. Analiz molekuljarnyh mehanizmov vozdejstvija zheleza (II), medi, marganca v patogeneze zhelezodeficitnoj anemii // Klin. farmakologija i farmajekonomika. 2010. № 1. S. 1-9.
5. Egorova S.E. Vlijanie proizvodnogo 1-alkenilimidazola pod shifrom Allim-1, 2,4-dinitrofenola i ih sochetanij na nekotorye pokazateli okislitel'nogo obmena myshej // Bjulleten' VSNC SO RAMN. 2013. T. 93. № 5. S. 138-140.
6. Kashuro V.A., Dolgo-Saburov V.B., Basharin V.A., Bonitenko E.Ju., Lapina N.V. Nekotorye mehanizmy narushenija biojenergetiki i optimizacija podhodov k ih farmakoterapii // MEDLINE.RU. 2010. T. 11.№ 2. S. 611-634.
7. Kerimkulova N.V., Torshin I.Ju., Gromova O.A. i dr. Sistematicheskij analiz molekuljarno-fiziologicheskih jeffektov sinergichnogo vozdejstvija zheleza, marganca i medi na soedinitel'nuju tkan' // Ginekologija. 2012. T. 14. № 6. S. 51-60.
8. Krupatkin A.I., Sidorov V.V., Baranov V.V. Kolebatel'nyj kontur reguljacii linejnoj skorosti kapilljarnogo krovotoka // Regionarnoe krovoobrashhenie i mikrocirkuljacija. 2007. T. 6. № 3. S. 148.
9. Lebedeva S.A. Sravnitel'naja ocenka antigipoksicheskoj aktivnosti novogo metallokompleksa zheleza // Innovacii v sovremennoj farmakologii / mat-ly IV Sjezda farmakologov Rossii. - Kazan'. 2012. S. 116.
51
Biomedicine . № 2, 2017
10. Novikov V.E., Levchenkova O.S., Parfenov Je.A. Farmakologicheskie svojstva novogo antigipoksanta pQ-4 // Bjull. sibirskoj mediciny. 2006. S. 65-67.
11. Troflmov B.A., Samojlov N.N., Babanijazov H.H., Stankevich V.K., Nechiporenko S.P. i dr. Proizvodnye l-alkenilimidazola. Patent RF № 2397175/23, 20.08.2010.
12. Rukovodstvo po laboratornym zhivotnym i al'ternativnym modeljam v biomedicinskih issledovanijah / pod red. N.N. Karkischen-ko, S.V. Gracheva. - M.: Profil'-2S. 2010. 358 s.
13. Sanockij I.V. Metody opredelenija toksichnosti i opasnosti himicheskih veshhestv (toksikometrija). - M., 1970. 344 s.
14. Soroko S.I., Buryh Je.A. Vnutrisistemnye i mezhsistemnye perestrojki fiziologicheskih parametrov pri ostroj jeksperimental'noj gipoksii // Fiziol. cheloveka. 2004. T. 30. № 2. S. 58-66.
15. Chernilevskij V.E. Problema gipobioza i prodlenija zhizni// Sbornik MOIP N° 41. Sekcija gerontologii. - M., 2008. S. 105-123.
16. Shahmardanova S.A. Issledovanie ostroj toksichnosti i antigipoksicheskoj aktivnosti novyh metalokompleksov zheleza // Saratovskij nauchno-medicinskij zhurnal. T. 11. № 1. 2015. S. 146-150.
17. Shilov V.N. Molekuljarnye mehanizmy strukturnogo gomeostaza. - M.: Intersignal, 2006. 288 s.
18. Cadet E., GadenneM., CaprontD., et al. Donnes recentes sur metabolisme du fer: un etat de transition//Rev. Med. 2005. No. 26. Pp. 315-324.
19. Corral L., Javierre C., Blasi J., et al. Combined intermittent hypobaric hypoxia and muscle electro-stimulation: a method to increase circulating progenitor cell concentration? // J. Transl. Med. 2014. Vol. 19. Pp. 12-17.
20. Defrere S., Lousse J.C., Gonzalez-Ramos R., et al. Potential involvement of iron in the pathogenesis of peritoneal endometriosis // Mol. Hum. Reprod. 2008. Vol. 14(7). P. 377.
21. Dimitrov J.D., Vassilev T.L., Andre S., et al. Functional variability of antibodies upon-oxidative processes // Autoimmun Rev. 2008. Vol. 7(7). Pp. 574-578.
The mechanism of antihypoxic effect of new metal complex of iron - derived vinylimidazole
S.A. Shakhmardanova, P.A. Galenko-Yaroshevskiy, F.B. Litvin, V.V. Tarasov, M.L. Maksimov, S.S. Sologova
New metal-complex compound of iron derived vinylimidazole under the code of "Tetravim" with antihypoxic activity was studied in experiments on laboratory animals (white nonlinear mice and rats). It is shown that a single intraperitoneal introduction Tetravim at a dose of 50 mg/kg does not alter the performance of a haemogram, leads to a decrease in oxidative metabolism, the prevent of hypoglycemia that occur under conditions of acute hypobaric hypoxia (AGBH), improves hemodynamics and efficiency of oxygen exchange in the tissues, reduce the negative impact AGBH on parameters ofmicrocirculation.
Key words: antihypoxants, metal-complex of iron, hypoxia, oxidative metabolism, haemogram, microcirculation.
