CC BY
111
МЕДИЦИНСКИЕ НАНОБМОТЕХНОЛОГИМ
Медицинские нанобиотехнологии адресной доставки диагностических и лекарственных препаратов в мозг
В.П.Чехонин1,2, В.П.Баклаушев12, Д.А.Кузнецов1,3
1Российский государственный медицинский университет им. Н.И.Пирогова, кафедра медицинских нанобиотехнологий медико-биологического факультета, Москва (зав. кафедрой - акад. РАМН, проф. В.П.Чехонин);
2Государственный научный центр социальной и судебной психиатрии им. В.П.Сербского,
отдел фундаментальной и прикладной нейробиологии, Москва
(руководитель - акад. РАМН, проф. В.П.Чехонин);
3Институт химической физики им. Н.Н.Семёнова РАН, Москва
(директор - акад. РАН, проф. АА.Берлин)
В работе суммируются литературные и собственные данные по применению моноклональных антител к нейроспе-цифическим белкам в медицинских нанобиотехнологиях адресной доставки диагностических и лекарственных препаратов через гематоэнцефалический барьер. Приводятся результаты преклинических исследований селективности по отношению к клеткам-мишеням моноклональных антител к глиофибриллярному кислому белку и коннекси-ну-43 на культурах клеток и in vivo, на животных с моделированной патологией нервной системы. Показано, что антитела к коннексину-43 специфически визуализируют клетки перитуморальной зоны при внутривенном введении животным с экспериментальной глиомой С6. Обсуждаются перспективы развития медицинских нанобиотехнологий адресной доставки.
Ключевые слова: адресная доставка, моноклональные антитела, глиома, GFAP, Cx43
Medical nanobiotechnology of targeted delivery of diagnostic and therapeutic agents into brain
V.P.Chekhonin12, V.P.Baklaushev12, D.A.Kuznetsov13
1N.I.Pirogov Russian State Medical University, Department of Medical Nanobiotechnology of Medical and Biological Faculty, Moscow
(Head of the Department - Acad. of RAMS, Prof. V.P.Chekhonin);
2V.P.Serbsky State Research Centre for Social and Forensic Psychiatry, Department of Fundamental and Applied Neurobiology, Moscow
(Head of the Department - Acad. of RAMS, Prof. V.P.Chekhonin); 3N.N.Semenov Institute of Chemical Physics of RAS, Moscow (Director - Acad. оf RAS, Prof. A.A.Berlin)
The authors summarise available literature and own data concerning the use of monoclonal antibodies raised against neurospecific proteins in medical nanobiotechnologies of targeted delivery of diagnostic and therapeutic agents across blood brain barrier. Presented are the results of preclinical trials of cell specificity of monoclonal antibodies to glial fibrillar acidic protein and connexin-43 performed with cell cultures and animal models of CNS disorders. The antibodies to connexin-43 administrated intravenously into animals with experimental C6 glioma were shown to visualize Cx43-positive cells of the peritumoral zone. Further prospects of the medical nanobiotechnologies of the targeted delivery are discussed. Key words: targeted delivery, monoclonal antibodies, glioma, GFAP, Cx43
Биотехнологическая революция, произошедшая после открытия технологии рекомбинантных ДНК, существенно расширила арсенал диагностических и терапевтических подходов, применимых при заболеваниях нервной системы. Появились новые биотехнологические препараты и технологии лечения первичных опухолей мозга, неизлечимых ранее болезней Альцгеймера и Гентингтона, нейродеге-неративных, ишемических и демиелинизирующих болезней ЦНС. Проводятся клинические испытания генетически реконструированных клеток, создаются высокоселективные системы доставки лекарственных препаратов в область патологического очага в мозге. А в последние десять лет, в связи с развитием методов исследования в наноразмерном диапазоне и накоплением критической массы данных по медицинским аспектам исследования наночастиц и нанома-териалов, сформировалось новое научное направление -медицинские нанобиотехнологии [1, 2].
В рамках этого направления созданы совершенно новые нанофармакологические системы, которые используют самоорганизующиеся наноматериалы для направленной доставки лекарственных и диагностических средств, а также генного материала [3, 4]. При этом используются полимерные мицеллы и липосомы [1-9], комплексы ДНК с поликатионами («полиплексы») [10], комплексы блок-иономеров [11], наногели [12] и т.п.
Развитие нанобиотехнологий адресной доставки невозможно без создания специфических векторов - «направляющих» молекул, селективно накапливающихся в органе-мишени. Наиболее надежными кандидатами на роль таких векторов являются моноклональные антитела и их фрагменты (как нативные, так и рекомбинантные). Антитела - созданный самой природой инструмент как для детекции антигена-мишени в сложном белковом растворе, так и для адресной доставки в клетку, презентирующую антиген-мишень [7].
Особое значение в эпоху развития биотехнологий моноклональные антитела приобретают в нейроонкологии. Благодаря биотехнологиям стало возможным создание нового класса рекомбинантных биспецифических антител и разработка на их основе многокомпонентных систем радиоиммунодиагностики и терапии. Были синтезированы так называемые гуманизированные антитела, т.е. антитела, содержащие аминокислотные последовательности человеческих иммуноглобулинов. Системное введение таких антител человеку не вызывает иммунных реакций, что позволило перейти к клиническим испытаниям. В настоящее время на рынке биофармпрепаратов существует уже около двух десятков препаратов гуманизированных антител, одобренных FDA и другими аналогичными организациями для лечения различных опухолей человека. Это такие препараты, как
Для корреспонденции:
Баклаушев Владимир Павлович, доцент кафедры медицинских нанобиотехнологий МБФ Российского государственного медицинского университета им. Н.И.Пирогова, старший научный сотрудник отдела фундаментальной и прикладной нейробиологии Государственного научного центра социальной и судебной психиатрии им. В.П.Сербского Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1 Телефон: (495) 434-1311 E-mail: [email protected]
Статья поступила 28.04.2010 г., принята к печати 26.05.2010 г.
«Tositumomab», «Rituximab» - антитела к CD20, применяющиеся для терапии лимфом, «Gemtuzumab» - антитела к CD33, разработанные для лечения миелоидной лейкемии, "Lim-1" - антитела к HLA-DR, «Vitaxin» - антитела к опу-хольспецифическому интегрину avß3, «Trastuzumab», «Cetuximab» и «Bevacizumab» - антитела к различным доменам рецепторов эпидермального и сосудистого эндотели-ального факторов роста.
Цель настоящего исследования - оценка перспектив применения моноклональных антител к нейроспецифическим и опухольассоциированным белкам для адресной доставки диагностических и лекарственных препаратов в очаг глиомы и зону перитуморальной глиомной инвазии.
Адресная доставка в мозг антител к GFAP
Известно, что опухоли головного мозга сопровождаются изменением проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и реактивной астроглиальной реакцией, различные феномены которой подтверждены многими исследователями [7, 13-16]. В эндотелиоцитах опухолевых микрососудов изменяется синтез белков, поддерживающих барьерные функции, в частности, исчезает ЕВА (endothelial barrier antigen) - эндотелиальный барьерный антиген, высокоспецифический маркер барьерных эндотелиоцитов церебральных микрососудов. Кроме того, отмечается увеличение экспрессии генов, не типичных для барьерного эндотелия (рис. 1, 2).
В проведенных нами ранее исследованиях [7] удалось показать селективное накопление моноклональных антител к нейроспецифическим белкам (GFAP и нейронспецифиче-ская енолаза) в мозге крыс с поврежденным ГЭБ в результате окклюзии средней мозговой артерии. Эти данные показали возможность применения антител к указанным ней-роспецифическим антигенам для направленного транспорта лекарственных препаратов в патологические очаги, в частности, при экспериментальной глиоме С6. Факторами, которые могут обеспечить адресную доставку с помощью антител к GFAP, являются избыточная экспрессия антигена-мишени астроцитами в перитуморальной зоне и критическое повышение проницаемости гематоэнцефалического барьера в неопластических микрососудах. Возможность направленного транспорта антител к GFAP в очаг экспериментальной глиомы ранее не исследовалась.
Результаты этих экспериментов показали изменения в экспрессии эндотелиальных антигенов быстро растущих опухолевых микрососудов. Среди эндотелиальных антигенов мы оценивали упомянутый эндотелиальный барьерный антиген (EBA) и антиген, распознаваемый моноклональны-ми антителами 2mB6, полученными в лаборатории иммунохимии ГНЦ ССП им. В.П.Сербского [15-17]. Моноклональные антитела 2mB6 распознают эндотелиальный антиген AMVB1, в норме почти не экспрессирующийся в микроциркулятор-ном русле мозга, за исключением микрососудов мозжечка и ствола мозга. При экспериментальной глиоме С6 было обнаружено значительное повышение экспрессии AMVB1 в собственной сосудистой системе опухоли. Наоборот, с помощью моноклональных антител к ЕВА мы выявили критическое снижение уровня этого маркера в сосудах глиомы С6 и
в прилежащей к ней интактной ткани уже на ранних сроках ее развития (рис. 2). Эти изменения свидетельствуют о молекулярной перестройке эндотелиального барьера как в собственно неопластических микрососудах, так и в микрососудах в области астроглиального вала.
Рис. 1. Общий вид имплантированной в стриатум глиомы С6 спустя 2 ч (А), 3 (Б), 15 (В) и 28 (Г) сут после имплантации.
0,1% толуидин. Ув. х 20.
Рис. 2. Иммунофлюоресцентная визуализация ЭРДР и ЕВА (зеленая и красная флюоресценция соответственно) на срезах глиомы.
А. х 100. Б. Увеличенный фрагмент х 200. ЭРЛР + астроциты вокруг участка инвазии (йЛР1). В. Нормальная нервная ткань, окрашенная с помощью антител к ЭРЛР и ЕВА. Ув. х 200.
Дефект ГЭБ в области астроглиального вала и гиперэкспрессия GFAP обусловили избирательное накопление моноклональных антител к этому НСБ после их внутривенного введения [17]. Было показано более чем 20-кратное накопление меченных радиоизотопом антител в опухоли по сравнению с интактной тканью. При этом специфические антитела накапливались в опухоли в 5 раз больше, чем неспецифические, содержание первых продолжало нарастать в пораженном полушарии вплоть до 96 ч после введения(продолжительность эксперимента), в то время как неспецифические IgG через 48 ч после введения элиминировались из мозга (радиоактивность пораженного полушария в контрольной группе спустя 96 ч составляла 0,03 ± 0,01% от введенной дозы на 1 г сырого вещества мозга (M ± о).
Максимальное значение накопления - 0,17 ± 0,02% от введенной дозы на 1 г сырого вещества мозга (M ± о), наблюдающееся через 96 ч после введения, было выше, чем значения радиоактивности органов ретикулоэндотелиаль-ной системы на этом сроке, которые не превышали 0,1%/г от введенной дозы (радиоактивность печени спустя 96 ч после введения составляла 0,09 ± 0%/г). Данного накопления вполне достаточно для применения, наряду с другими маркерами глиомы, моноклональных антител к GFAP в радиоизотопных методах исследования (PET, SPECT).
Адресная доставка в мозг наноконтейнеров с помощью антител к экстраклеточному фрагменту коннексина-43
Перспективной молекулярной мишенью для адресной доставки наносистем в мозг является коннексин-43 (Cx43). Этот белок - основной структурный компонент щелевых контактов (gap-junction) между астроцитами, участвующими в функциях гематоэнцефалического барьера [18]. С помощью 4 трансмембранных доменов Cx43 образует гексаме-ры - коннексоны, формирующие пору в клеточной мембране. Посредством 2 экстраклеточных фрагментов Cx43 (Е1 и Е2) гемиканалы соседних клеток формируют полноценный щелевой контакт, объединяющий цитоплазмы этих клеток. С помощью таких каналов осуществляется поддержание ионного гомеостаза и клеточного объема, а также передача различных межклеточных сигналов, в том числе регулирующих пролиферацию, дифференцировку, апоптоз и миграцию эмбриональных клеток в онтогенезе.
Большой интерес вызывает участие Cx43 в развитии ин-вазивных опухолей глиального происхождения. Существуют экспериментальные данные, показывающие активирующее влияние Cx43 на процессы инвазии мультиформной глио-бластомы человека и ее аналога у крыс - экспериментальной глиомы С6 [19]. В частности, было продемонстрировано, что Cx43-положительные клетки C6-глиомы обладают более высокой способностью к миграции, чем Cx43-отрицательные, а также то, что они более устойчивы к оксидативному стрессу и различным другим повреждающим факторам [20].
Нами были получены моноклональные антитела к реком-бинантному экстраклеточному домену Е2 Сх43, взаимодействующие с Сх43 в нативной конформации [21]. Эти антитела визуализировали плакоидные структуры коннексонов на
фиксированных первичных астроцитах и клетках глиомы С6 крысы, равно как и на клетках глиобластомы U251 и 293-й линии эмбрионального почечного эпителия человека (рис. 3 A-D). У фиксированных клеточных препаратов визуализировался как мембранный, так и клеточный пул Cx43.
Очищенные моноклональные антитела к экстраклеточному домену Е2 хорошо визуализировали Сх43-положительные клетки низкодифференцированных глиом в живой культуре (рис. 3 E, F). В этом случае наблюдалась флюоресценция только мембранных коннексонов. Ни в одном из препаратов не наблюдалось флюоресценции межклеточных соединений, характерной для димерных коннексонов, интегрированных в gap-junction. На основании этого мы предположили, что полученные антитела позволяют визуализировать Cx43 на этапе презентирования коннексонов на цитолемме в виде гемиканала.
Полученные антитела к E2 Сх43 испытывали в двух различных экспериментах in vivo. В обоих случаях антитела вводились в бедренную вену крысам с экспериментальной
А * » ■ Щ ' в 1 rJ * V
£ ' с № - * .'■* >л ^ ■ .Л К ШШ ù Ъ Я? - ' Ч г ■ . f V- ■ >
Е J * " Х- . 'т т ¡е 1. Р L 1 F г "5 * й- 1 V 4
глиомой С6. В первом случае они содержали радиоизотопную метку (125I), а во втором - флюоресцентную метку в виде Alexa Fluor 660 с пиком эмиссии в дальней красной, близкой инфракрасной области. И в первом, и во втором случае нам удалось детектировать антитела к E2 Сх43 в патологическом очаге в мозге спустя 48 ч после внутривенного введения. В случае радиоизотопной метки мы наблюдали накопление 0,27% от введенной дозы в ткани пораженного глиомой полушария. Применение инфракрасного флюорофора позволило детектировать клетки, в которых происходит накопление антител к Cx43. Как и в случае с антителами к GFAP, анти-Сх43 накапливались в коннексин-положительных клетках астроглиального вала (рис. 4).
Адресная доставка в перитуморальную область с помощью антител к GFAP и Сх43 имеет несколько очевидных перспектив. Во-первых, крайне важно, например, при хирургической резекции опухоли правильно определить ее границы с учетом всех имеющихся участков перива-зальной и периневральной инвазии. Поскольку реактивные астроциты сопровождают все такие участки, их визуализация позволит четко отграничить область инвазии глиомы от нормальной ткани. Во-вторых, в последних исследованиях показано, что именно в перитуморальной области происходит наиболее активная инвазия глиомы [22]. В этой области локализуются стволовые опухолевые клетки, поддерживающие пул активно мигрирующих радио- и химиорезистентных клеток глиомы. Таким образом, с помощью полученных нами антител можно пытаться доставить в эти клетки перитуморальной зоны мощные цитостатики или терапевтические гены.
Рис. 3. Иммунофлюоресцентный анализ Сх43 на фиксированных и живых клеточных культурах.
А. Культура астроцитов. Красная флюоресценция - поликлональные антитела к GFAP; зеленая флюоресценция - MAb Cx43. Ядра клеток - DAPI (Invitrogen). B. U251 глиобластома человека. Синяя флюоресценция - MAb Cx43. Оранжево-красная флюоресценция -актиновые филаменты (Phalloidin-TRITC, Fluka). Ядра клеток -ТОТО 633 (Invitrogen). С. Глиома С6 крысы. Красное - ß-катенин, зеленое - MAb Cx43. D. Эмбриональный почечный эпителий (линия 293). Красное - пан-кадгерины, зеленое - MAb Cx43. E. Визуализация Сх43 в живой культуре глиобластомы U251 (зеленая флюоресценция). Ядра клеток докрашены DAPI. F. Визуализация Сх43 в живой культуре глиомы С6 (зеленая флюоресценция). Ядра клеток докрашены ТОТО 633. Увеличение х1000.
Рис. 4. Визуализация Сх43-позитивных клеток в области пери-туморального астроглиального вала при внутривенном введении антител к Cx43, меченных Alexa Fluor 660 (Invitrogen).
A. Иммунофлюоресценция с помощью антител к GFAP. Б. Прижизненно визуализированные с помощью антител к Cx43, меченных Alexa Fluor 660, клетки. В. Объединенное изображение. Г. Отрицательный контроль (внутривенное введение меченных Alexa Fluor 660 неспецифических антител).
Заключение
Важнейшим этапом при конструировании адресных на-ноконтейнеров и наночастиц является придание им «векторных» свойств с помощью антител или их фрагментов, специфически распознающих антиген-мишень в патологическом очаге. При необходимости доставки через патологический гематоэнцефалический барьер таким антигеном-мишенью могут служить поверхностные мембранные белки измененных эндотелиоцитов либо белки реактивных астроцитов, всегда «сопровождающих» патологический процесс.
Получены, охарактеризованы и испытаны in vitro и in vivo моноклональные антитела к глиофибриллярному кислому белку и экстраклеточному фрагменту коннекси-на-43, специфически распознающие реактивные астроци-ты и Сх43-позитивные клетки перитуморальной зоны глиомы С6. Эти антитела могут применяться для адресной доставки диагностических и лекарственных препаратов в зону инвазии низкодифференцированных глиом.
Благодарности
Авторы искренне признательны сотрудникам отдела фун-даментаментальной и прикладной нейробиологии ФГУ ГНЦ ССП им. В.П.Сербского: к.м.н. Г.М.Юсубалиевой, д.м.н. О.И.Гуриной, к.б.н. Н.Ф.Гриненко, д.б.н., проф. И.В.Викторову, к.б.н. И.П.Лазаренко, К.П.Ионовой за помощь на различных этапах исследований; д.х.н. Ю.С.Скоблову, С.Ю.Третьяковой, В.И.Вахниной (радиоизотопный блок, Институт биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН) за помощь в работе с радиоактивными изотопами; к.б.н. Р.И.Дмитриеву (группа мембранных биоэнергетических систем, Институт биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН) за помощь в получении рекомбинантного экстраклеточного фрагмента Сх43 и доктору Е.Б.Цитрину (группа оптических исследований Института биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН) за неоценимую помощь в выполнении сканирующей лазерной конфокальной микроскопии.
Литература
1. Nanotechnology in biology and medicine. Methods, devices, and applications / Ed. by Tuan Vo-Dinh CRC Press, London, 2006.
2. Kabanov A.V., Gendelman H.E. Nanomedicine in the diagnosis and therapy of neurodegenerative disorders // Prog. Polym. Sci. - 2007. - V.32. - P. 1054-1082.
3. Trentin D., Hubbell J., Hall H. Non-viral gene delivery for local and controlled DNA release // J. Control. Release. - 2005. - V.102. - P. 263-275.
4. Nayak S., Lyon L.A. Soft nanotechnology with soft nanoparticles // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. - 2005. - V.44. - P.7686-7708.
5. Чехонин В.П., Дмитриева Т.Б., Жирков Ю.А. Направленная доставка лекарственных средств в мозг // Вестн. РАМН. - 2006. - №8. - С.30-37.
6. Чехонин В.П., Жирков Ю.А., Кабанов А.В. и др. Использование антител к нейроспецифическим белкам для направленного транспорта психотропных средств через гематоэнцефалический барьер. - В кн.: Чехонин В.П., Дмитриева Т.Б., Жирков Ю.А. Иммунохимический анализ нейроспецифиче-ских белков. - М.: Медицина, 2000. - С.275-289.
7. Чехонин В.П., Гурина О.И., Дмитриева Т.Б. Моноклональные антитела к нейроспецифическим белкам. - М.: Медицина, 2007.
8. Kabanov A.V., Batrakova E.V., Chekhonin V.P. et al. A new class of drug carriers: Micelles of poly(oxyethylene)-poly(oxypropylene) block copolymers as micro containers for drug targeting from blood in brain // J. Control. Release. - 1992. -V.22. - P.141-158.
9. Torchilin V.P. Micellar nanocarriers: Pharmaceutical perspectives // Pharm. Res. -2007. - V.24. - P.1-16.
10. Kabanov A., Zhu J., Alakhov V. Pluronic block copolymers for gene delivery // Adv. Genet. - 2005. - V.53. - P.231-261.
11. Oh K.T., Bronich T.K., Bromberg L. et al. Block ionomer complexes as prospective nanocontainers for drug delivery // J. Control. Release. - 2006. - V.115. - P.9-17.
12. Soni S., Babbar A., Sharma R., Maitra A. Delivery of hydrophobized 5-fluorouracil derivative to brain tissue through intravenous rout using surface modified nanogels // J. Drug Target. - 2006. - V.14. - P.87-95.
13. Sternberger N.H. Sternberger L.A. Blood-brain barrier protein recognized by monoclonal antibody // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1987. - V.84. - P.8169-8173.
14. Plate K.H., Millauer B., Ullrich A., Risau W. Up-regulation of vascular endothelial growth factor and its cognate receptors in a rat glioma model of tumor angiogenesis // Cancer Res. - 1993. - V.53. - P.5822-5827.
15. Баклаушев В.П., Юсубалиева Г.М., Гурина О.И., Чехонин В.П. Комбинированный иммунопероксидазный анализ в визуализации клеточных элементов гемато-энцефалического барьера // Клеточные технологии в биологии и медицине. -2006. - №4. - С.198-201.
16. Чехонин В.П., Баклаушев В.П., Юсубалиева Г.М. и др. Моделирование и иммуногистохимический анализ глиомы С6 // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2007. - №2. - С.65-73.
17. Chekhonin V.P., Baklaushev V.P., Yusubalieva G.M. et al. A targeted transport of 125I-labeled monoclonal antibodies to target proteins in experimental glioma focus // Doklady Biochemistry and Biophysics. - 2008. - Т.418. - №1. - С.40-43.
18. Prochnow N., Dermietzel R. Connexons and cell adhesion: a romantic phase // Histochem. Cell Biol. - 2008 Jul. - V.130 (1). - P.71-77.
19. Oliveira R., Christov C., Guillamo J.S. et al. Contribution of gap junctional communication between tumor cells and astroglia to the invasion of the brain parenchyma by human glioblastomas // BMC Cell Biology. - 2005. - V.6. - P.7.
20. Bates D.C., Sin W.C., Aftab Q., Naus C.C. Connexin-43 enhances glioma invasion by a mechanism involving the carboxy terminus // Glia. - 2007 Nov. - V.55 (15). -P.1554-1564.
21. Baklaushev V.P., Gurina O.I., Yusubalieva G.M. et al. Immunofluorescent analysis of connexin-43 using monoclonal antibodies to its extracellular domain // Bull. Exp. Biol. Med. - 2009 Oct. - V.148 (4). - P.725-730.
22. Dietrich J., Diamond E.L., Kesari S. Glioma stem cell signaling: therapeutic opportunities and challenge// Expert Rev. Anticancer Ther. - 2010 May. - V.10 (5). - P.709-722.
Информация об авторах:
Чехонин Владимир Павлович, академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой медицинских нанобиотехнологий медико-биологического факультета Российского государственного медицинского университета им. Н.И.Пирогова, руководитель отдела фундаментальной и прикладной нейробиологии Государственного научного центра социальной и судебной психиатрии им. В.П.Сербского Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1 Телефон: (495) 434-1311 E-mail: [email protected]
Кузнецов Дмитрий Анатольевич, доктор биологических наук, профессор, профессор кафедры медицинских нанобиотехнологий медико-биологического факультета Российского государственного медицинского университета им. Н.И.Пирогова, заведующий лабораторией углеродных наноструктур Института химической физики им. Н.И.Семёнова РАН Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1 Телефон: (495) 434-1311 E-mail: [email protected]
