CC BY
46УДК 533.924+544.52+577.3
В.Н. Василец*, А.Б. Шехтер**
МЕДИЦИНСКИЕ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРИМЕНЕНИЯ ПЛАЗМЕННЫХ ИСТОЧНИКОВ
ОКИСЛОВ АЗОТА
(*Филиал Института энергетических проблем химической физики РАН, Первый московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова) e-mail: vnvasilets@yandex.ru, lep.mma@yandex.ru
Оксид азота, образующийся в атмосферной плазме газового разряда, обладает антибактериальными и противовоспалительными свойствами, а также способностью стимулировать процессы регенерации поврежденных тканей. В работе рассмотрены плазменные источники оксида азота и медико-биологические аспекты их применения.
Ключевые слова: дуговой разряд, плазменная медицина, оксид азота, регенеративная медицина, стерилизация, NO терапия
ВВЕДЕНИЕ
Одним из основных продуктов, образующихся в атмосферной плазме и представляющих интерес для плазменной медицины и биологии, является оксид азота (NO). Это соединение известно, с одной стороны, своими антибактериальными свойствами, а с другой стороны представляет собой физиологически активную частицу (свободный радикал), широко известную в биологии и медицине своими сигнальными и регуляторными функциями, в том числе и при патологических процессах [1]. Молекулы оксида азота, генерируемые одним типом клеток, могут проникать через мембрану и регулировать функции других клеток. В 1998 году американские ученые Роберт Фарчгот (Robert F Furchgott), Луис Игнарро (Louis J Ignarro) и Ферид Мюрад (Ferid Murad) были удостоены Нобелевской премии в области физиологии и медицины за открытие роли NO, как сигнальной молекулы, регулирующей процессы в сердечно-сосудистой системе. Это событие дало толчок дальнейшим исследованиям роли эндогенного NO в различных биологических процессах. В настоящее время хорошо известно, что NO не только вызывает релаксацию гладко-мышечных клеток сосудов, но и регулирует такие процессы как синтез коллагена и пролиферация фибробла-стов; вызывает ингибирование агрегации тромбоцитов, адгезии лейкоцитов и свертывания крови; регулирует активность кислородсодержащих радикалов, участвует в ангиогенезе, клеточных процессах апоптоза и нейротрансмиссии [1,2]. Экзогенный газообразный NO, генерируемый в числе прочих активных частиц в воздушной плазме, может оказывать существенное влияние на биоактивность эндогенных молекул NO, выполняющих регуляторные функции внутри организма при воздействии плазменного газового потока на ткани
[3,4].
Газообразный N0 также широко известен как универсальный антибактериальный агент. Показано, что газообразный N0 обладает стерилиза-ционным действием по отношению к различным бактериям, включая грамм-отрицательные, грамм-положительные, анаэробные и спорообразующие бактерии, а также бактерии, устойчивые к действию антибиотиков и бактерии, образующие биопленки [5-10]. В дополнение к этому оксид азота обладает антигрибковым действием [10-12] и может быть использован для дезактивации простейших (Leshmania) [13-15]. Важно отметить, что окись азота является универсальным антипатогенным средством, не требующим предварительной диагностики инфекции, как в случае применения традиционных лекарственных средств.
СИНТЕЗ ОКИСЛОВ АЗОТА
Оксид азота для медицинских и биологических применений может быть синтезирован несколькими различными способами. Простейший способ - это химический синтез. В настоящее время наиболее распространенным методом химического синтеза является получение оксида азота в реакции окисления аммиака: 4NH3 + 5O2 = 4NO + 6Щ0 с последующим хранением и применением газа в баллонах. Однако, транспортировка и длительное хранение N0 в баллонах является проблемой. Молекулы оксида азота, обладая не-спаренным электроном, легко рекомбинируют друг с другом в присутствии остаточного кислорода - 2NO + O2 = 2NO2 - с образованием двуокиси азота N0^ которая уже является токсичным соединением.
Плазмохимический синтез в разрядах в атмосферном воздухе является альтернативным методом непрерывного получения окиси азота для медицинских целей в реальном времени в потоке плазмы. Согласно термодинамическим и кинети-
ческим расчетам значительную концентрацию окиси азота можно получить только в высокотемпературной плазме, например, при использовании проточного дугового плазмотрона [16]. На этом принципе в МГТУ им. Н.Э. Баумана был сконструирован аппарат «Плазон» (рис. 1), предназначенный, в зависимости от конструкции выходного плазменного канала, для различных медицинских применений: начиная от плазменного скальпеля (деструктора) и устройства для коагуляции тканей (высокотемпературный режим) до терапевтического стимулятора/манипулятора (низкотемпературный режим), используемого для заживления ран и терапевтического лечения других заболеваний [3, 15, 16, 17]. В основу конструкции аппарата положен дуговой разряд постоянного тока, зажигаемый между охлаждаемым катодом и положительно заряженным анодом. Поток атмосферного воздуха с помощью микрокомпрессора подается в зону дугового разряда, ускоряется и выходит через отверстие в аноде. В зависимости от мощности разряда и скорости потока воздуха в плазме дугового разряда достигается температура газа 3000 - 3500 К (рис. 2), что достаточно для применения аппарата в качестве скальпеля (деструктора) или коагулятора тканей. Коагулятор и деструктор отличаются друг от друга диаметром выходного отверстия в аноде - 1,2 и 0,7 мм соответственно. Коагуляция производится при воздействии на раневую поверхность плазменного потока из выходного отверстия (диаметр 1,2 мм) манипулятора-коагулятора. Хирургом осуществляется подбор оптимальных параметров путем вариации расхода воздуха, дистанции между коагулятором и поверхностью раны, а также скорости перемещения плазменного потока по поверхности ткани. В процессе коагуляции происходит и стерилизация ткани как следствие высокой температуры плазменного потока. Деструкция нежизнеспособных тканей и патологических образований осуществляется путем воздействия на них светящейся области плазменного потока, выходящего из анода деструктора (диаметр 0.7 мм). Расход воздуха выбирается хирургом в зависимости от вида биологической структуры ткани. Деструктор может также ограниченно использоваться для рассечения биологических тканей с одновременным гемостазом.
Проведенные термодинамические расчеты показали, что при температуре газа 3000 - 3500 К в плазме влажного воздуха образуется заметное количество кислородсодержащих радикалов О и ОН, атомов Н, а также азотсодержащих активных частиц, таких как N0 и N0^ в сравнимых концентрациях. При терапевтическом применении поток горячей плазмы быстро охлаждается в специаль-
ном устройстве со скоростью 107 - 108 К/c чтобы значительно замедлить рекомбинацию молекул NO при контакте с кислородом. На выходе такого устройства в результате охлаждения образуется теплый воздух, содержащий относительно стабильные продукты NO, NO2, H2O2, CO и другие соединения, образующиеся в разряде. Концентрация NO на выходе такого устройства, в зависимости от условий горения разряда и скорости охлаждения, может изменяться в пределах от 300 до 2500 ppm. Таких концентраций NO достаточно не только для антибактериального воздействия, но и для лечения незаживающих ран трофических и диабетических язв, рубцов и других заболеваний, при лечении которых традиционная медицина иногда оказывается бессильна [20-21]. Подобные плазменные аппараты, генерирующие NO в импульсном микроволновом разряде - Portrait Express (TM)® и Portrait (R) PSR®, были разработаны в США компанией Rhytec Inc. и применяются в течение ряда лет для лечения кожных заболеваний, а также в пластической и косметической хирургии для восстановления поврежденных тканей [16-18].
Рис. 1. Плазмохимический аппарат «Плазон», предназначенный для работы в режиме плазменного скальпеля (деструктора) и устройства для коагуляции тканей (высокотемпературный режим, сверху) и терапевтического стимулятора/манипулятора (низкотемпературный режим, снизу) Fig. 1. Plasmochemical device "Plazon" for operating in a mode of plasma scalpel (destructor) and devices for the tissue coagulation (high temperature mode, on the top view) and therapeutic stimulator/manipulator (low temperature mode, on the bottom view)
т, °с
Рис. 2. Зависимость температуры воздушно-плазменного
потока от расстояния до выходного отверстия манипулятора в режимах коагулятора (1), деструктора (2), стимулятора-
коагулятора (3), стимулятора (4) Fig. 2. Temperature dependence of air-plasma flow on the distance to manipulator hole outlet in modes of coagulator (1), destructor (2), stimulator-coagulator (3) and stimulator (4)
БАКТЕРИЦИДНЫЕ СВОЙСТВА ВОЗДУШНО-ПЛАЗМЕННОГО ГАЗА
Бактерицидные свойства плазменного газа, содержащего NO, представляют большой интерес особенно в связи с появлением в основном в лечебных учреждениях все новых и новых видов бактерий, устойчивых к действию широкого класса антибиотиков. При этом, число больных инфицированных такими заболеваниями, согласно статистическим данным за последнее десятилетие возросло более, чем в два раза. В связи с такой ситуацией многие компании уходят с рынка антибиотиков, которые становятся все более дорогими и сильнодействующими. Не исключено, что в результате применения таких сильнодействующих антибиотиков могут появиться бактерии, устойчивые к действию любых существующих лекарств. Исследования антибактериального действия NO показали, что при концентрации его 1% в воздухе происходит уменьшение концентрации жизнеспособных антибиотик-устойчивых бактерий, таких как MRSA Pseudomonas Aeroginosa на 6 порядков величины после 15 мин обработки. Аналогичный результат был получен компанией "NitricBio" в отношении 45 других видов различных бактерий, микроорганизмов и вирусов [19].
Антибактериальные свойства воздушно-плазменного потока, содержащего NO, в терапевтическом режиме аппарата «Плазон» были исследованы in vitro и in vivo. Концентрации газовых составляющих, измеренные газовым анализатором "KM 9006 Quintox", составляли: NO - 300 -500 ppm, NO2 - 70 - 90 ppm, CO - 8 - 9 ppm в зависимости от параметров работы аппарата. Содер-
жание О2, N2 и Н2О соответствовало нормальной концентрации этих газов в атмосфере. In vitro влияние NO-содержащего газового потока аппарата «Плазон» изучали на культуре клинических штаммов: Stafilococcus aureus, Proteus vulgaris Pseudomonas aeruginosa, Escherechia coli, Candida albicans. При воздействии в течение 1 мин получено разрежение посевов, в течение 1 мин 20 с -значительное разрежение посевов, а начиная с 1 мин 30 с - роста бактерий и грибковых культур не наблюдалось. Это свидетельствует о выраженном бактерицидном действии газового NO. Таким образом, полученные данные согласуются с результатами, полученными компанией "NitricBio" по стерилизационной активности газового NO, полученного химическим путем.
В эксперименте in vivo были проведены две серии опытов на 90 крысах самцах. В первой серии опытов моделировали кожную рану площадью 300 мм2, без соблюдения правил асептики. В края раны вставляли кольцо, закрытое целлофаном для предотвращения высыхания раны. Через 1, 2, 3 и 4-ро суток в опытной группе (25 крыс) раневую поверхность и края раны обрабатывали воздушно-плазменным потоком аппарата «Пла-зон» в течениеи 60 с (концентрация NO 300 ppm, температура 40°С). В контроле (25 крыс) рану обрабатывали тепловентилятором с той же температурой. Во второй серии опытов (40 крыс) в рану вводили культуру золотистого стафилококка (1 млрд. микробных тел) для моделирования инфицированной гнойной раны. Условия опыта в контроле были аналогичны первой группе. На 3-е, 7-е, 14-е и 21 -е сутки концентрацию бактерий в ране измеряли стандартным способом высевания в культуральной среде и подсчета количества колоний через сутки. В первой группе содержание бактерий после четырех сеансов воздушно-плазменной обработки уменьшалось более чем в 10 раз и составляло 7% от начальной величины, тогда как в контрольной группе содержание бактерий за то же время уменьшилось только до 43% от начальной величины. При этом у 36% крыс развилось гнойное воспаление раны. Антибактериальный эффект воздушно-плазменного потока еще существенней проявлялся для заранее инфицированной гнойной раны (рис. 3) на 21-е сутки наблюдения. Уменьшение концентрации бактерий более чем на 4 порядка величины наблюдали при концентрации NO в воздушно-плазменном потоке 300 ppm и более чем 5 порядков величины наблюдали при концентрации NO 500 ppm. Для сравнения в контрольной группе уменьшение содержания бактерий в ране за счет чистой защитной реакции организма было на 2 порядка меньше, чем
при обработке воздушно-плазменным потоком при концентрации NO 500 ppm.
Рис. 3. Зависимость концентрации бактерий (N) в инфицированной гнойной ране от времени наблюдения в контроле (1) и при обработке воздушно-плазменным потоком. Концентрация NO - 300 ppm (2), 500 ppm (3) Fig. 3. Dependence of bacteria concentration (N) in infected festering wound on the obseving time for reference (1) and at treatment with air-plasma flow. The NO concentration is 300 ppm (2), 500 ppm (3)
Таким образом, воздушно-плазменный поток, содержащий NO, может служить эффективным универсальным антипатогенным средством против большинства бактерий, вирусов и паразитов
ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВОЗДУШНО-ПЛАЗМЕННОГО ПОТОКА
В течение последних 14 лет в ряде лабораторий, кафедр и клиник Первого московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова, в различных медицинских НИИ, в ряде больниц и госпиталей г. Москвы и других городов России, Украины, Белоруссии и Словакии были проведены широкие медико-биологические и клинические исследования механизмов воздействия воздушно-плазменных потоков, содержащих NO. Экспериментальные исследования [3, 4, 17, 21, 22] показали, что воздушно-плазменный поток оказывает антибактериальное действие, купирует воспаление, нормализует микроциркуляцию крови, активирует функции макрофагов и пролиферацию фибробластов, стимулирует процессы регенерации тканей и значительно ускоряет заживление асептических гнойных ран и длительно незаживающих ран, ожогов и радиационных повреждений.
Многочисленные клинические исследования показали возможность эффективного применении воздушно-плазменных потоков в режиме N0 терапии для лечения гнойных и длительно незаживающих ран, трофических язв, синдрома диабетической стопы, ожогов, радиационных повреждений и рубцов, остеомиелита, повреждений роговицы, гнойно-воспалительных заболеваний мягких тканей, легких, придатков матки, стоматологической и отоларингологической патологии, улучшения результатов пластических операций и др. [16, 20, 21]. Особо следует отметить эффективность терапевтического воздействия холодного воздушно-плазменного потока в сочетании с коа-гуляционным воздействием аппарата «Плазон» в военно-полевой хирургии при лечении огнестрельных и минно-взрывных поражений.
Рис. 4. Эффект применения аппарата «Плазон» на 8-ой день в процессе лечения обширного ожога (обработку производили ежедневно при концентрации N0 в потоке 500 ррт, и до-
зах 10 - 15 сек на см2 пораженной поверхности) Fig. 4. Effect of "Plazon" device application over 8 days of treatment of extensive burn (treatment was carried out every day at NO concentration of 500 ppm in flow and at doses of 10-15 s per sm2 of affected surface)
В качестве примера следует привести результаты применения воздушно-плазменной терапии при лечении обширного ожога (рис. 4). В таких случаях производят сетчатую трансплантацию кожи на пораженную поверхность. При этом необходимо обеспечить как приживление пересаженной кожи на начальной стадии, так и последующую регенерацию всего кожного покрова. Воздушно-плазменную обработку производили как до пересадки кожи для стерилизации и заживления ожогов, так и в дальнейшем после пересадки для стимулирования процессов регенерации тканей. Обработку производили ежедневно при концентрации NO в потоке 500 ppm, и дозах 10 -15 с на см2 пораженной поверхности. На рис. 4 видно, что на восьмой день после пересадки и
воздушно-плазменной терапии происходит заметный рост эпителия и эффективное заживление ожоговых ран.
Основным лечащим агентом воздушно-плазменного потока является несомненно оксид азота. Однако, как было показано ранее, воздушно-плазменный поток содержит также и другие биологически активные молекулы, такие как Н2О2, О2, NO2 и др. Медико-биологические эффекты NO, перечисленные ранее, могут быть значительно усилены вследствие синергетического воздействия NO/H2O2 и NO/O2. Такое синергетическое воздействие было описано ранее [22-27] и может проявляться при регулировании апоптоза клеток, антибактериальной активности макрофагов и при лечении первичной пневмонии.
Таким образом, экспериментальные и клинические испытания, проведенные в последние годы, подтверждают универсальные антибактериальные свойства и высокоэффективную биостимулирующую функцию воздушно-плазменных потоков, содержащих NO, что позволяет говорить о возникновении принципиально нового направления плазменной медицины -плазменной NO терапии.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ignarro L.J. Nitric Oxide: Biology and Pathology. 2009. Academic Press. 2nd Edition.
2. Moncada S., Palmer R.M., Higgs E.A. // Pharmacol. Rev. 1991. V. 43. P. 109-142.
3. Шехтер А.Б., Кабисов Р.К., Пекшев А.В., Козлов Н.Р. //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1998. T. 126. № 8. С. 210-215
Shekhter A.B., Kabisov P.K., Pekshe A.V., Kozlov N.R. //
Bulleten experimentalnoiy biologii i meditsiny. 1998. V. 126. N 8. P. 210-215 (in Russian).
4. Shekhter A.B., Serezhenkov V.A., Rudenko T.Y., Pekshev A.V., Vanin A.F. // Bulleten experimental biology and medicine. 2005. V. 12. P. 210-219 (in Russian).
5. Kerr A.R., Wei X.Q., Andrew P.W., Mitchell T.J. // Microbial Pathogenesis. 2004. V. 36. P. 303-310.
6. Morita H., Yoshikawa H., Suzuki T., Hisamatsu S., Kato Y., Sakata R., Nagata Y., Yoshimura T. // Bioscience Biotechnology and Biochemistry. 2004. V. 68. P. 1027-1034
7. Satriano J. // Amino Acids. 2004. V.26 P. 321-329.
8. Fox S., Wilkinson T.S., Wheatley P.S., Xiao B., Morris R.E., Sutherland A., Simpson A.J., Barlow P.G., Butler
A.R., Megson I.L., Rossi A.G. //Acta Biomaterialia. 2010. V.6. P. 1515-1521.
9. Daeschlein G., Woedtke T., Kindel E. et al. // Plasma Processes and Polymers. 2010. V. 7. P. 224-230.
10. Li B., Fu Y.P., Jiang D.H. et al. //Applied and Environmental Microbiology. 2010. V. 76. P. 2830-2836.
11. Lushchak V.I. // Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology. 2011. V. 153. P. 175-190.
12. Chowdhury K.D., Sen G., Biswas T. // Biochemica et Bio-physica Acta - General Aspects. 2010. V. 1800. P. 964-976
13. Nahrevanian H., Jalalian M., Farahmand M. et al. // Nitric Oxide Biology and Chemistry. 2010. V. 22 P. 89-S89.
14. Lopez-Jaramillo P., Rincon M.Y., Garcia R.G. et al. // Leishmania (V.) panamensis. 2010. V. 83. P. 97-101.
15. Пекшев А.В., Козлов Н.П., Вагапов А.Б., Маликов
B.Н. Материалы научно-практич. конф. «NO-терапия: теоретические аспекты, клинический опыт и проблемы применения экзогенного оксида азота в медицине». М.: Изд. дом «Русский врач». 2001. 192 с.;
Pekshev A.V., Kozlov N.P., Vagapov A.B., Malikov V.N. Proceedings of scientific-practival conference NO therapy, clinical aspects and clinical experiment. M.: Russkiy vrach. 2001. 192 p. (in Russian).
16. Fridman G., Friedman G., Gutsol A., Shekhter A.B. Vasi-lets V.N., Fridman A. // Plasma Processes and Polymers. 2008. V. 5. P. 503-533.
17. Vasilets V. N., Gutsol A., Shekhter A. B., Fridman A. // High Energy Chemistry. 2009. V. 43. P. 229-233.
18. Bogle M. A., Arndt K. A., Dover J. S. //Arch. Dermatol. 2007. V. 143. P. 168-174.
19. http://www.nitricbio.com.
20. Reshetov L.V., Kabisov R.K., Shekhter A.B., Pekshev
A.V., Manelova M.V. //Annals of Plastic Reconstructive and Esthetic Surgery. 2000. V. 4. P. 24-38.
21. Lipatov K.V., Sopromadze M.A., Shekhter A.B., Emelya-nov A.Y., Grachev S.V. // Surgery. 2001. V. 2. P. 41-43.
22. Chae H. J, Kim H. R., Kwak Y. G., Ko J. K., Joo C. U., Chae S. W. // Immunopharmacol. Immunotoxicol. 2001. V. 23. P. 187-204.
23. Farias-Eisner R., Chaudhuri G., Aeberhard E., Fukuto J. M. // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 6144-6151.
24. Kotamraju S., Tampo Y., Keszler A., Chitambar C. R., Joseph J., Haas A L., Kalyanaraman B. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003. V. 100. P. 10653-10658.
25. Yoshioka Y., Kitao T., Kishino T., Yamamuro A., Maeda S. // J. Immunol. 2006. V. 176. Р. 4675-81.
26. Pacelli R., Wink D. A., Cook J. A., Krishna M. C., De-Graff W., Friedman N., Tsokos M., Samuni A., Mitchell J.
B. // J. Exp. Med. 1995. V. 182. P. 1469-1479.
27. Chotigeat U., Khorana M., Kanjanapattanakul W. // J. Med. Assoc. Thai. 2007. V. 90. P. 266-271.
