CC BY
100
УДК 579.262+576.8.095.3
МЕДИКО-ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МИКРОСИМБИОЦЕНОЗА ЧЕЛОВЕКА
© 2010 г. О. В. Бухарин, Б. Я. Усвяцов, *Ю. А. Хлопко
Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, *Отдел биотехнических систем ОНЦ УрО РАН, г. Оренбург
Целью исследования явилась оценка поведенческих реакций бактерий-ассоциантов в условиях микросим-биоценоза на модели микрофлоры слизистой оболочки миндалин человека. Иерархическая структура микросимбиоценозов оценивалась по числу, информативности и направленности отданных штаммами-симбионтами сигналов на модификацию факторов патогенности. Получены регрессионные уравнения методом наименьших квадратов.
Для прогноза инфекционного процесса рассчитан коэффициент функционального состояния биоценоза (Кфсб): соотношение числа сигналов на усиление и подавление факторов патогенности. Дифференцированы штаммы-симбионты с высоким, средним и низким уровнями коммуникативной активности. По уровню Кфсб прогнозируется резидентное бактерионосительство, рецидив заболевания и дисбиоз у здоровых лиц. Структурно-функциональный анализ микросимбиоценоза позволяет определять микробную иерархию и прогнозировать течение инфекционного процесса.
Ключевые слова: микросимбиоце-ноз, межмикробные взаимодействия, прогноз заболевания, резидентное бактерионосительство, ассоциативный симбиоз.
Изучение причинно-следственных связей микрофлоры человека с различными формами патологии организма — актуальная проблема экологии и медицины [5, 10].
Микробиоценоз биотопов организма человека имеет стабильную доминантную микрофлору, выполняющую хелперную функцию для формирования колонизационной резистентности организма [1]. Вместе с тем включение в данный симбиоз транзиторной микрофлоры (бактерий-ассоциантов) может иметь разные последствия для гомеостаза хозяина. В частности, антагонизм ассоцианта, приводящий к вытеснению доминантного симбионта, способствует развитию дисбиоза и, как следствие, патологических состояний организма [9].
Популяционно-коммуникативный подход в изучении экологии микробов позволяет оценить сложную иерархическую структуру поведенческих реакций ассоциантов, экспрессирующих разнообразные метаболиты-регуляторы. Поведение бактерий, как правило, направлено на сохранение вида в разнообразных условиях среды обитания [7].
Изучение особенностей межмикробных взаимодействий в ассоциациях бактерий определенного биотопа, включающее оценку не только модификации роста и размножения симбионтов, но и изменения уровня экспрессии факторов их патогенности и персистенции, может позволить получить новые знания по механизму формирования микросимбиоце-нозов при разных формах инфекционного процесса
Не исключено, что структурно-функциональная оценка микросимбио-ценоза в биотопе даст возможность прогнозировать его стабильность и, следовательно, риск развития патологических состояний организма.
Целью исследования явилась оценка поведенческих реакций бактерий-ассоциантов в условиях микросимбиоценоза на модели микрофлоры слизистой оболочки миндалин человека.
Методы
Межмикробные взаимодействия были исследованы у 455 штаммов микроорганизмов, выделенных из 100 биоценозов на слизистой оболочке миндалин больных тонзиллитом, бактерионосителей и здоровых лиц. Из разных биоценозов высевали от 2 до 6 бактерий-ассоциантов, относящихся к родам Staphylococcus, Streptococcus, Aerococcus, Micrococcus, Neisseria, Bacillus, Enterobacter, Yersinia, Klebsiella и др. Микроорганизмы идентифицировали до рода и вида по морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам с использованием тест-систем фирмы «LACHEMA» (Чехия). Изучались межмикробные взаимодействия ассоциантов внутри каждого биоценоза чашечным методом [8]. Особенности межмикробных взаимодействий оценивались по модификации (усиление или подавление) следующих свойств:
гемолитическая (ГА), лецитовителлазная (ЛецА), лизоцимная (ЛА), антилизоцимная (АЛА) активности, а также по изменению роста симбионта. ГА, ЛецА, ЛА определяли чашечным методом [3]; АЛА и динамику роста — фотометрическим методом [4]. При анализе учитывалось число и направленность сигналов, отданных каждым штаммом по отношению к остальным симбионтам в биотопе. Для исследования иерархической структуры микросимбиоценозов, т. е. определения штаммов с разным уровнем коммуникативной активности, методом наименьших квадратов были получены регрессионные уравнения, позволяющие провести анализ связи между несколькими независимыми переменными (количеством отданных сигналов по тем или иным свойствам) и зависимой переменной (оценкой эксперта микросимбиоценозов здоровых, бактерионосителей и больных). Независимые переменные были выбраны с учетом их информативности.
Для оценки иерархической структуры микро-симбиоценоза миндалин больных тонзиллитом было выведено уравнение 1:
Yj = 7,09 + 0,11 • Х1 - 0,06 • Х2 - 0,08 • Х3 +
0,37 • Х4 + 0,06 • Х5 + 0,37 • Х6,
где Yj — показатель активности симбионта при межмикробном взаимодействии в биоценозе больных; Х1 — всего отданных сигналов на подавление; Х2 — число отданных сигналов на подавление роста; Х3 — всего отданных сигналов на усиление; Х4 — число отданных сигналов на усиление гемолитической активности; Х5 — число отданных сигналов на усиление лецитовителлазной активности; Х6 — число отданных сигналов на усиление лизоцимной активности.
При выведении данного уравнения для микросим-биоценоза больных наиболее информативным признаком оказалось число сигналов на усиление факторов патогенности (ГА, ЛецА) и колонизации (ЛА).
Для оценки иерархической структуры микробиоценоза миндалин бактерионосителей S. aureus и/или
S. pyogenes было выведено уравнение 2:
Убн = 4,65 + 0,24 • Х1 + 0,52 • Х2 + 0,23 • Х3 + 0,58 • Х4 — 0,15 • Х5 — 0,14 • Х6,
где Убн — показатель активности симбионта при меж-микробном взаимодействии в биоценозе бактерионосителей; Х1 — всего отданных сигналов на подавление; Х2 — число отданных сигналов на подавление лизо-цимной активности; Х3 — число отданных сигналов на подавление роста; Х4 — всего отданных сигналов на усиление; Х5 — число отданных сигналов на усиление гемолитической активности; Х6 — число отданных сигналов на усиление антилизоцимной активности.
В микробиоценозе бактерионосителей информативными были сигналы на подавление ЛА, усиление ГА и АЛА.
Для оценки иерархической структуры микросим-биоценоза миндалин здоровых лиц было выведено уравнение 3:
Уз = 3,43 + 0,29 • Х1 + 0,52 • Х2 + 0,74 • Х3 +
0,39 • Х4 — 1,11 • Х5 — 0,25 • Х6,
где Уз — показатель активности симбионта при межми-кробном взаимодействии в биоценозе здоровых; Х1 — всего отданных сигналов на подавление; Х2 — число отданных сигналов на подавление гемолитической активности; Х3 — число отданных сигналов на подавление роста; Х4 — всего отданных сигналов на усиление; Х5 — число отданных сигналов на усиление гемолитической активности; Х6 — число отданных сигналов на усиление антилизоцимной активности.
В микробиоценозе здоровых лиц информативными оказались сигналы на подавление и усиление ГА, усиление АЛА.
Для микросимбиоценозов больных, бактерионосителей и здоровых определены единые количественные критерии оценки показателя коммуникативной активности симбионтов: если У > 8, штамм-симбионт высокоактивен; если У = 5—8, штамм средней активности, если У < 5, штамм — пассивный симбионт.
Для прогнозирования стабильности микробного биоценоза, а следовательно, определения степени риска развития разных форм инфекционного процесса был рассчитан коэффициент функционального состояния биоценоза (Кфсб) по следующей формуле:
Кфсб = ^ сиг ( + )
Кф Z сиг ( — ) ,
где Кфсб — коэффициент функционального состояния биоценоза; Z сиг ( + ) — общее число сигналов на усиление свойств: ГА, ЛецА, ЛА, АЛА, рост; Z сиг ( — ) — общее число сигналов на подавление свойств: ГА, ЛецА, ЛА, АЛА, рост.
В результате выведения средних величин Кфсб получены следующие критерии прогноза состояния микробиоценоза: для здоровых Кфсб = 0,11 ± 0,05 (0,01—0,21); для больных Кфсб = 1,4 ± 0,26 (0,88—1,92); для резидентных бактерионосителей Кфсб = 0,81 ± 0,25 (0,61 — 1,31).
Результаты
Приводим примеры использования выведенных уравнений для определения иерархической структуры микробного биоценоза на слизистой оболочке миндалин представителей от трех групп обследованных: бактерионосителей, больных и здоровых лиц.
Исследован микросимбиоценоз на слизистой оболочке миндалин бактерионосителя Б.(носительство штамма S. aureus). Участников биоценоза — 4 штамма: Staphylococcus aureus, Aerococcus viridans, Streptococcus mutans , Streptococcus oralis.
Особенности межмикробных взаимодействий представлены в табл. 1.
Анализ иерархической структуры биоценоза проведен с помощью уравнения 2: штамм № 1 — Убн = 5,23; штамм № 2 — Убн = 5,94; штамм № 3 — Убн = 8,54; штамм № 4 — Убн = 5,90. Высокоактивным в данном биоценозе является штамм № 3 (Уб > 8), штаммы
Таблица I
Межмикробные взаимодействия в биоценозе миндалин бактерионосителя Б. (биоценоз 8/20)
М штамма Вид бактерий-симбионтов Всего отдано сигналов Из них отдано сигналов
на усиление на подавление
ГА ЛецА ЛА АЛА Рост ГА ЛецА ЛА АЛА Рост
1 S. aureus 1 - - - - 1 - - - - -
2 A. viridans 4 - - 1 - - 2 - - 1 -
3 S. mutans 8 - 3 - - - 1 - 1 1 2
4 S. oralis 3 - - - 1 1 1 - - - -
Итого 1б 0 3 1 1 2 4 0 1 2 2
7 9
Таблица 2
Межмикробные взаимодействия в биоценозе миндалин больного С. (биоценоз 5/54)
М штамма Вид бактерий-симбионтов Всего отдано команд Из них отдано сигналов
на усиление на подавление
ГА ЛецА ЛА АЛА Рост ГА ЛецА ЛА АЛА Рост
1 S.lugdunensis 9 3 - 2 - - - - 1 1 2
2 K. ozaenae 10 2 - - 1 - 1 2 1 - 3
3 S.epidermidis 8 1 1 1 1 - 1 1 1 - 1
4 S. aureus 13 4 1 1 - - - 1 2 2 2
5 E. cloacae 12 2 1 - 3 - - - 2 - 4
Итого 52 12 3 4 5 0 2 4 7 3 12
24 28
Таблица 3
Межмикробные взаимодействия в биоценозе миндалин здорового В. (биоценоз 13/4)
М штамма Вид бактерий-симбионтов Всего отдано сигналов Из них отдано сигналов
на усиление на подавление
ГА ЛецА ЛА АЛА Рост ГА ЛецА ЛА АЛА Рост
1 Aerococcus viridans б - - - - - 1 2 - - 3
2 Streptococcus mutans б - - - - - - 3 - - 3
3 Staphylococcus epidermidis 7 - - - - - 1 3 - - 3
4 Streptococcus acidominimus 8 - 1 1 - - 1 2 - - 3
5 Staphylococcus simulans б - 1 - - - - 1 - - 4
Итого 33 0 2 1 0 0 3 11 0 0 1б
3 30
N° 1, 2, 4 характеризуются средней активностью (Yfe = 5-8). Пассивные симбионты не обнаружены.
Для прогнозирования стабильности микробиоценоза и определения типа бактерионосительства был рассчитан Кфсб:
Кфсб = __ = 0,78.
В соответствии с выведенными критериями для бактерионосителей полученный показатель Кфсб = 0,78 свидетельствует о резидентном типе носительства.
Высокоактивный (М 3) и средней активности (М 2, 4) штаммы отдают 44,4 % от числа сигналов на подавление фактора патогенности - ГА симбионтов. Сигналы на модификацию факторов колонизации и персистенции подаются с небольшой частотой: в 28,б % случаев на усиление и 33,3 % - на подавление. Носительский штамм S. aureus малоактивен. Подобная функциональная структура биоценоза свидетельствует об относительной его стабильности
- феномене резидентного бактерионосительства.
Особенности межмикробных взаимодействий на слизистой оболочке миндалин больного хроническим тонзиллитом (больной С) показаны в табл. 2.
Как видно из данных табл. 2, участников биоценоза
— 5 штаммов: Staphylococcus lugdunensis, Klebsiella ozaenae, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Enterobacter cloacae. Иерархическая структура биоценоза рассчитана согласно уравнению 1: штамм № 1 — Уб = 8,85; штамм № 2 — Уб = 8,18; штамм № 3 — Уб = 7,95; штамм № 4 — Уб = 9,18; штамм № 5 — Уб = 7,83. Высокоактивным оказался штамм № 4 (патоген S. aureus). Кфсб — 0,96, что свидетельствует о разгаре заболевания с возможным риском рецидива.
Высокоактивным штаммом отдано 46,2 % от числа команд на усиление факторов патогенности, синергизм с высокоактивным штаммом проявляют штаммы-ассоцианты № 1, 3, 5 (50,0—55,7 % сигналов на усиление факторов патогенности). Имеет место дисбиоз без признаков стабилизации, что подтверждает диагноз «хронический тонзиллит на стадии рецидива».
Функциональная структура биоценоза на слизистой оболочке миндалин здорового В. представлена в табл. 3.
Функциональная активность штаммов симбионтов согласно уравнению 3 составила: штамм № 1
— Y = 7,92; штамм № 2 — Y = 7,4; штамм № 3
3 ’ ’ 3 ’ ’
— Y = 8,21; штамм № 4 — Y = 8,7; штамм № 5
3 ’ ’ 3 ’ ’
— Yз = 8,24. Таким образом, штамм № 4 — высокоактивный симбионт, а остальные — симбионты средней активности. Кфсб биоценоза — 0,1, что свидетельствует о стабильности биоценоза здорового лица (нормобиоценоз). В биоценозе подавляющее число сигналов (90,9 %) направлены на взаимное подавление факторов патогенности, персистенции и роста симбионтов, следовательно, отсутствует риск заболевания (здоровье).
Обсуждение результатов
В экологической характеристике микробиоценоза человека важное значение имеет функциональный подход — оценка поведенческих реакций бактерий-симбионтов в определенном биотопе тела человека. Активность бактерий изучалась по количеству и качеству отданных штаммами-симбионтами сигналов, вызывающих усиление либо ослабление экспрессии факторов патогенности и персистенции. Для выявления иерархической структуры микрофлоры миндалин
— определения высокоактивных штаммов-симбионтов и штаммов с меньшей коммуникативной активностью, методом наименьших квадратов были получены регрессионные уравнения. Формулы уравнения для бактерионосителей, больных и здоровых отличались по набору информативных показателей.
Для микросимбиоценоза больных наиболее информативными показателями было число отданных сигналов на усиление факторов патогенности, а в биоценозе здоровых — число сигналов на подавление гемолитической активности (фактора патогенности) и усиление антилизоцимной активности (фактора персистенции).
Структурно-функциональный подход в анализе ассоциативного симбиоза позволяет оценить состояние колонизационной резистентности биотопа и прогнозировать стабильность микросимбиоценоза.
Выявление характера и направленности межмикроб-ных взаимодействий расширяет наши представления о патогенезе формирования различных форм инфекционного процесса [6], обосновывая подходы к лечению и профилактике инфекционных болезней [2].
Список литературы
1. Бухарин О. В. Ассоциативный симбиоз / О. В. Бухарин, Е. С. Лобакова, Н. В. Немцева, С. В. Черкасов.
— Екатеринбург : УрО РАН, 2007. - 262 с.
2. Бухарин О. В. Инфекция — модельная система ассоциативного симбиоза / О. В. Бухарин // Журнал микробиологии. — 2009. — № 1. — С. 83—86.
3. Бухарин О. В. Лизоцим микроорганизмов / О. В. Бухарин, Н. В. Васильев, Б. Я. Усвяцов. — Томск : Изд-во Томского университета, 1985. — 212 с.
4. Бухарин О. В. Персистенция патогенных бактерий / О. В. Бухарин. — М. ; Екатеринбург , 1999. — 361 с.
5. Бухарин О. В. Экология микроорганизмов человека / О. В. Бухарин, А. В. Валышев, Ф. Г. Гильмутдинова и др. — Екатеринбург : УрО РАН, 2006. — 477 с.
6. Перунова Н. Б. Характеристика биологических свойств микроорганизмов в бактериально-грибковых ассоциациях кишечника : автореф. дис. ... канд. мед. наук / Перунова Н. Б. — Оренбург, 2003. — 25 с.
7. Смирнов С. Г. Этология бактерий : актовая речь / С. Г. Смирнов. — Иваново : ИГМА, 2004. — 12 с.
8. Способ диагностики хронического тонзиллита : пат. № 2188422 Рос. Федерация / О. В. Бухарин, Б. Я. Усвяцов, Л. М. Хуснутдинова. — 2002. — 12 с.
9. Усвяцов Б. Я. Роль факторов персистенции и вирулентности при микроэкологических изменениях в организме человека / Б. Я. Усвяцов, Л. М. Хуснутдинова, Л. И. Паршута и др. // Журнал микробиологии. — 2006.
— № 4. — С. 58—61.
10. Шендеров Б. А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Т. 1. Микрофлора человека и животных и ее функция / Б. А. Шендеров. — М. , 1998.
— 288 с.
MEDICO^COLOGICAL АSPECTS OF HUMAN MICROSYMBIOCENOSIS
O. V. Bukharin, B. Ya. Usvyatsov, Yu. A. Khlopko
The Institute for Cellular and Intracellular Symbiosis, Ural Department of the RAS,
Department of Biotechnical Systems of OSC, Ural Department of the RAS, Orenburg
Aim of the study: to assess behaviour reactions of bacteria-associants under conditions of microsymbiocenosis on the model of microflora from human mucosal membrane of the tonsils.
Methods: hierarchic structure of microsymbiocenosis was estimated according to the number, informativity and direction of the given signals by strains-symbionts on the modification of the factors of pathogenicity. Regressive equations were obtained by the least squares method. For the prognostication of infectional process of functional biocenosis state coeffcient (Fbsc): proportion of the number of signals on the increase and suppression of the factors of the pathogenicity has been calculated.
Results: Strains-symbionts with a high, mean and low levels of communicative activity have been differentiated. According to the level of Fbsc, bacterial carriage, recurrence of the disease and dysbiosis in healthy persons are prognosticated.
Conclusions: Structural-and-functional analysis of microsymbiocenosis allows to determine microbial ierrharhia and to prognosticate a course of the infectious process.
Key words: microsymbiocenosis, mtermicrobial interrelations, prognosis of the disease, residential bacterial carriage, associative symbiosis.
Контактная информация:
Бухарин Олег Валерьевич — член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук, директор Института клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения РАН
Адрес: 460000, г. Оренбург, ул. Пионерская, д. 11
E-mail: ikvs@mail.esso.ru, 140374@mail.ru
Статья поступила 1 1.06.2009 г.
