CC BY
44
КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА, № 9, 2012
МАТЕРИАЛЫ ДЛЯ ОБСУЖДЕНИЯ ПО ТЕЗИСАМ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Е. Е. Ануфриева, Т. Н. Субботина. К вопросу о необходимости контроля уровня геномной ДНК в пробе перед проведением ПЦР-тестирования для выявления аллель-ных полиморфизмов. Красноярский филиал ФГБУЗ ГНЦ Минздравсоцразвития РФ, КНЦ СО РАН, Сибирский федеральный университет, Красноярск
С каждым годом расширяется объем генетического тестирования для выявления отдельных полиморфизмов с помощью аллель-специфичной ПЦР. Вместе с тем известна высокая аналитическая вариация результатов генетического тестирования при проведении генетических тестов в практике рутинных лабораторий, а отсутствие стандартизованных контрольных материалов и циклов внешнего контроля качества данных тестов не позволяет уверенно говорить о гарантиях надежности результатов. В частности, большинство доступных коммерческих наборов реагентов рассчитаны на достаточно узкий диапазон концентраций вносимой ДНК, но как правило, это не указывается в сопроводительной инструкции. С целью определения возможных ошибок тестирования, зависимых от концентрации вносимой геномной ДНК, мы проводили реакцию ПЦР для выявления полиморфизма JAK2 (V617F). Выделение ДНК из клеток проводили с использованием реагента «ДНК-сорб-В» (Интерлабсервис). Измерение концентрации ДНК производили с использованием набора реагентов Quant-iTTM ssDNA Assay Kit на флюори-метре Qubit (Invitrogen). Далее с образцами выделенной ДНК была проведена ПЦР с использованием комплекта реагентов «SNP-экспресс-РВ» (НПФ Литех) на амплификаторе iCycler iQ5 (BioRad). При концентрации ДНК 24 нг/мкл результат интерпретировался как мутация в гомозиготной форме, при концентрации 12 и 6 нг/мкл мутация обнаружена в гетерозиготной форме, а при внесении ДНК в концентрации 3 и 1,5 нг/мкл данной мутации обнаружено не было.
Обязательным требованием к инструкции производителей наборов следует считать необходимость указания пределов аналитической чувствительности тестов, а специалистам лаборатории перед проведением тестирования необходимо убедиться в адекватности вносимой концентрации ДНК.
Ф. С. Билалов, Р. А. Аминев, Ю. А. Ахмадуллина, А. Ж. Гильманов. О целесообразности внедрения в рутинную практику исследования полиморфизмов генов фолатно-го цикла у женщин при патологии беременности. ГБОУ ВПО Башкирский государственный медицинский университет, Уфа
Все большее количество пациентов обращаются в современные лаборатории по поводу определения состояния генов, связанных с предрасположенностью к тем или иным заболеваниям. Мотивация пациентов в основном обусловлена ростом грамотности, доступностью современных знаний о генетической предрасположенности в Интернете, а также рекламой лабораторий, распространяемой там же. Между тем, с учетом накопившихся сведений и доступности оборудования и тест-систем, становится все более очевидной желательность включения ряда молекулярно-генетических тестов в стандарты диагностики ряда патологических состояний. Так, исследование полиморфизма генов фолатного цикла (MTR, MTHFR, MTRR) позволяет определить риск возникновения онкологических, сердечно-сосудистых заболеваний, а также дефектов внутриутробного развития плода из-за нарушения обмена фолиевой кислоты и гипергомоцистеинемии.
Цель работы - определение роли аллельных вариантов A66G гена MTRR (редуктазы метионинсинтазы), С677Т гена MTHFR (метилентетрагидрофолатредуктазы), Asp91Gly гена MTR (метионинсинтазы) в развитии патологии беременности
и оценка необходимости введения этих тестов в стандарты диагностики. Обследовано 49 женщин репродуктивного возраста (29±9 лет), у которых в анамнезе отмечались самопроизвольные аборты на ранних сроках беременности (до 12 нед). Контрольную группу составили 47 женщин в возрасте 26±7 лет в первом триместре нормально протекающей беременности. Использовались ПЦР тест-системы производства НПФ «Литех», Москва; критерии оценки аллельных генов: нет мутации, гетерозиготное либо гомозиготное носительство.
Гомозиготное носительство аллеля A66G гена MTRR было обнаружено у 27 (55,1%) женщин с патологией беременности, гетерозиготное носительство - у 6 (12,3%), отсутствие мутации - у 16 (32,7%). Гомозиготного носительства аллеля С677Т гена MTHFR не было, гетерозиготное носительство наблюдалось у 42 (85,7%) женщин, мутации не определялись у 7 (14,3%) пациенток. По аллелю Asp919Gly гена MTR гомозиготное носительство встретилось у 1 пациентки (2,0%), гетерозиготное носительство - у 30 (61,2%), отсутствие мутации - у 18 (36,74%).
В контрольной группе гетерозиготное носительство варианта С677Т гена MTHFR наблюдалось лишь у 11 (23,4%) беременных женщин, что значительно ниже, чем в опытной группе. Достоверные отличия выявлены и по гомозиготному носительству аллеля A66G гена MTRR - оно обнаружено только у 9 (20%) женщин. Сочетание этих полиморфизмов у одной и той же пациентки в контрольной группе также выявлялось значительно реже, чем при патологии беременности.
Таким образом, у женщин с невынашиванием беременности наиболее часто встречаются полиморфизмы генов MTHFR и MTRR. Их наличие имеет определенное прогностическое значение и может служить доказательной опорой для лечащего врача в своевременном проведении профилактики возможных осложнений гипергомоцистеинемии у беременных женщин. Исследование полиморфизма указанных генов может быть включено в генетический скрининг на этапе прегравидарной подготовки, что будет способствовать снижению рисков развития осложнений беременности.
В. В. Красицкая, Л. П. Буракова, Л. А. Франк, И. А. Ольховский, Т. Н. Субботина. Использование биолюминесцентных репортеров при определении аллельных вариантов полиморфизма фактора V Лейден. Институт биофизики СО РАН, КНЦ СО РАН, Красноярский филиал ФГБУЗ ГНЦ Минздравсоцразвития РФ, Сибирский Федеральный Университет, Красноярск
В соответствии с медицинскими критериями ВОЗ http:// whqlibdoc.who.int/publications/2004/9241562668_rus.pdf по приемлемости использования методов контрацепции мутация фактора V (мутация Лейден), сопряженная с повышенным тромбогенным риском, служит противопоказанием к назначению контрацептивных гормональных препаратов. Это обусловливает актуальность внедрения генетического скрининга для женщин, использующих гормональные контрацептивы или планирующих беременность. Дискутируются также вопросы целесообразности включения в скрининг дополнительных контингентов лиц повышенного риска тромбогенных осложнений, а также расширение спектра определяемых генетических полиморфизмов. Вместе с тем ранее была продемонстрирована достаточно большая вариабельность результатов генетического тестирования, получаемых в рутинной лабораторной практике. В связи с этим, важной задачей является разработка более чувствительных, специфичных и менее трудоемких методов генотипирования.
В настоящей работе представлены результаты апробации метода определения однонуклеотидного полиморфизма на
ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
основе реакции ферментативного удлинения аллель-специфичного праймера (РЕХТ) с последующим биолюминесцентным твердофазным микроанализом. Геномную ДНК предварительно амплифицировали, используя праймеры, фланкирующие полиморфный сайт (dbSNP: rs6025). Продукты ПЦР использовали как матрицы для двух РЕХТ реакций. Анализ продуктов проводили с использованием химических конъюгатов обелин-стрептавидин. Генотип каждого из образцов геномной ДНК определяли по соотношению биолюминесцентного сигнала от удлинения N-праймера (G-аллель) и сигнала от удлинения М-праймера (А-аллель) (дискриминационный фактор (DF). Полученные результаты совпали с данными ПЦР анализа в реальном времени с использованием коммерческих наборов ООО «НПФ Литех» для тех же образцов ДНК. Коэффициент вариации DF составил 14,1% для гетерозиготного варианта G/A и 19,8% для нормального генотипа G/G. Для повышения производительности гено-типирования разработан метод одновременного выявления аллелей в одной лунке с использованием двух биолюминесцентных репортеров: фотопротеина обелина и целентеразин-зависимой люциферазы Renilla muelleri. Биолюминесцентный сигнал обелина свидетельствует о наличии нормального аллеля, а сигнал люциферазы - о наличии мутантного ал-леля. Использование двух биолюминесцентных репортеров позволяет проводить анализ обоих аллелей в одной лунке, и таким образом удвоить количество образцов, анализируемых на одном планшете, а применение СВР вместо свободного целентеразина для запуска биолюминесценции люциферазы существенно упрощает процедуру анализа.
М. А. Суховольская, Т. Н. Субботина, И. А. Ольховский, К. П. Базарин. Мутации в генах метилентетрагидрофо-латредуктазы (MTHFR) и метионинсинтазы (MTR) и факторы риска гипергомоцистеинемии у спортсменов.
Красноярский филиал ФГБУЗ ГНЦ Минздравсоцразвития РФ, КНЦ СО РАН, Сибирский федеральный университет, Красноярск
Хорошо известны наследственные особенности обмена метионина, негативный эффект которых в отношении развития гипергомоцистеинемия (ГГЦ) может усиливаться при интенсивных физических нагрузках и употреблении некоторых «спортивных» диет. В связи с этим обсуждается целесообразность скрининга спортсменов на носительство мутаций ферментов обмена метионина с целью разработки индивидуальных профилактических программ.
Цель работы - выявление зависимости концентрации гомоцистеина (ГЦ) в крови спортсменов с мутациями С677Т (Ala222Val) в гене MTHFR (rs 1801133) и A2756G (Asp919Gly) в гене MTR (rs1805087). Группу обследованных составили 50 спортсменов, представляющих различные виды спорта, имеющие 1-й разряд и выше, а в контрольную группу вошли 57 условно здоровых лиц, не испытывающих высоких физических нагрузок, придерживающихся обычной схемы питания. Показано статистически достоверное увеличение концентрации ГЦ в крови спортсменов, имеющих гомозиготное состояние гена С677Т MTHFR по сравнению со спортсменами, не имеющими мутацию (p < 0,001), или имеющими гетерозиготный аллель (p = 0,002). Достоверных изменений уровня ГЦ у здоровых лиц, имеющих гомозиготный полиморфизм гена MTHFR не обнаружено. У спортсменов, имеющих мутацию С677Т в гене MTHFR в гомозиготном состоянии показано статистически достоверное (p = 0,005) повышение уровня ГЦ по сравнению с контрольной группой гомозиготных лиц. В отношении мутации A2756G в гене MTR у спортсменов, имеющих таковую в гетерозиготном состоянии, показано статистически достоверное (p = 0,015) понижение уровня ГЦ по сравнению с контрольной группой лиц, гетерозиготных по исследуемому полиморфизму. Таким образом, спортсмены, имеющие мутацию С677Т в гене MTHFR, входят в потенциальную группу высокого риска развития ГГЦ. А гетерозиготное носительство мутации A2756G в гене MTR у спортсменов можно рассматривать в качестве протективной в отношении развития ГГЦ.
ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
В. А. Зимина, М. Н. Зенина, А. В. Козлов, Н. К. Губаренко. Исследование ликвора при онкогематологических заболеваниях. ГБОУ ВПО СЗГМУ им. И. И. Мечникова, Санкт-Петербург
Цель исследования - оценка состава ликвора при онкогематологических заболеваниях. Задачи - оценить концентрацию белка, цитоз и клеточный состав в ликворе у больных до начала лечения острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ), осложненного нейролейкозом, и множественной миеломы (ММ).
Использовали люмбальный ликвор, полученный от 41 больного (мужчины - 24, женщины - 17, возраст от 27 до 49 лет; диагноз ОЛЛ установлен у 15 пациентов, ММ - у 26).
Готовили препараты из осадка ликвора седиментацион-ным методом с использованием модификации аппарата Сайка с последующей окраской азур-эозином. Концентрация белка в ликворе составила у пациентов с ОЛЛ - 0,27±0,03 г/л, с ММ - 0,32±0,02 г/л, цитоз при ОЛЛ составил 3-950 ■ 106/л, при ММ 0,3-10,6 @. 106/л. При ОЛЛ выявлены бластные клетки в количестве от 8 до 68%. При ММ бластные клетки не были обнаружены, у 4-х пациентов были выявлены плазматические клетки в количестве от 2 до 8%. Лимфоциты были обнаружены у всех пациентов в количестве от 1 до 73%. У 8 пациентов с ОЛЛ макрофаги обнаружены в количестве от 1 до 14%, при ММ менее чем в половине случаев были найдены макрофаги в количестве, превышающем остальные клетки - сегментоядерные нейтрофилы, лимфоциты и моноциты в 2 раза.
Уровень белка в ликворе у пациентов с ОЛЛ и ММ существенно не различался. При ОЛЛ, осложненном нейро-лейкозом, в ликворе были обнаружены бластные клетки, при ММ - плазматические клетки. В связи с трудностями, возникающими при морфологическом изучении клеток ликвора пациентов с онкогематологическими заболеваниями, необходимо проведение дополнительных методов, включающих цитогенетические исследования и иммунофенотипирование с использованием моноклональных антител.
Е. Р. Кулюцина, В. П. Савельев, О. А. Глебова, Л. А. Сорокина. Информативность гематологических показателей при клинико-лабораторном обследовании пациентов с сосудистой деменцией. ГБОУ ДПО Пензенский институт усовершенствования врачей Минздравсоцразвития РФ, ГБУЗ Областная психиатрическая больница им. К. Р. Евграфова, Пенза
Пусковым механизмом развития сосудистой деменции зачастую являются инфекционные болезни мозга (энцефалиты, менингиты и др.), ведущие к церебральным повреждениям, которые учитываются как этиологический фактор при определении формы помощи и методов патогенетической терапии. Этиотропное лечение возможно при верификации диагноза органического заболевания мозга (дисфункции), в том числе связанного с нейроинфекцией (бактериальной, вирусной).
Цель исследования - оценка эффективности лаборатор-
