CC BY
65
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Валерий Евгеньевич Шевченко1, Мадина Хасуева2,
Ирина Владимировна Поддубная3, Наталья Евгеньевна Арноцкая4, Марат Азатович Таипов5, Валентина Александровна Юрченко6, Давид Георгиевич Заридзе7
МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОЕ ПРОФИЛИРОВАНИЕ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО ПРОТЕОМА ПЛАЗМЫ КРОВИ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ МАРКЕРОВ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
1 Профессор, д. б. н., заведующий лабораторией онкопротеомики, отдел эпидемиологии и профилактики опухолей НИИ канцерогенеза РОНЦ им.. Н. Н. Блохина РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)
2 Аспирант, кафедра онкологии РМАПО Минздравсоцразвития РФ (123836, РФ, г. Москва, ул. Баррикадная, д. 2/1)
3 Член-корреспондент РАМН, профессор, д. м. н., заведующая кафедрой онкологии, проректор по учебной работе, РМАПО Минздравсоцразвития РФ (123836, РФ, г. Москва, ул. Баррикадная, д. 2/1)
4 Старший научный сотрудник, лаборатория онкопротеомики, отдел эпидемиологии и профилактики НИИ канцерогенеза РОНЦ им.. Н. Н. Блохина РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)
5Лаборант-исследователь, лаборатория онкопротеомики, отдел эпидемиологии и профилактики опухолей НИИ канцерогенеза РОНЦ им.. Н. Н. Блохина РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)
6 К. б. н., старший научный сотрудник, отделение эпидемиологии опухолей, отдел эпидемиологии и профилактики опухолей РОНЦ им.. Н. Н. Блохина РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24) 7 Член-корреспондент РАМН, профессор, д. м.. н., заведующий отделом, эпидемиологии и профилактики опухолей НИИ канцерогенеза РОНЦ им.. Н. Н. Блохина РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)
Адрес для переписки: 115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24, лаборатория онкопротеомики НИИ канцерогенеза РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Шевченко Валерий Евгеньевич;
e-mail: vshev@nm.ru
Идентификация маркеров для раннего выявления и мониторинга рака молочной железы является приоритетным направлением онкологии. Нами разработана и апробирована новая методология поиска маркеров рака молочной железы — профилирование низкомолекулярного протеома (1—20 кДа) плазмы крови. Данный подход включал три основных компонента: роботизированную предварительную подготовку образцов, время-пролетную масс-спектрометрию с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией, обработку данных с помощью биоинформационного пакета программ. Для поиска потенциальных маркеров проведен скрининг 100 образцов плазмы крови больных раком молочной железы и 60 контрольных образцов. В результате исследования обнаружены пептиды/белки, которые могут в перспективе использоваться в качестве маркеров рака молочной железы.
Ключевые слова: биомаркеры, рак молочной железы, профилирование протеомов, плазма крови.
Рак молочной железы (РМЖ) занимает 2-е место в структуре заболеваемости злокачественными опухолями в мире и 5-е место в структуре смертности. В год
РМЖ в мире заболевают более 1 000 000 женщин, из них умирают более 300 000. В России РМЖ также занимает лидирующее положение в структуре заболеваемости и
смертности от злокачественных опухолей. В год в России РМЖ заболевают более 50 000 женщин, умирают более 20 000. Заболеваемость РМЖ повсеместно растет, в то время как смертность от РМЖ снижается практически во всех экономически развитых странах. В России отмечается рост как заболеваемости, так и смертности от РМЖ [1]. Снижение смертности от РМЖ в первую очередь можно объяснить широким распространением во многих экономически развитых странах маммографического скрининга, в результате которого РМЖ выявляется на ранней стадии [1]. Однако необходимо отметить, что чувствительность и специфичность маммографического скрининга невелика — не более 50—60%. Мета-анализ семи рандомизированных исследований с участием 500 000 женщин позволил выявить, что смертность женщин, принявших участие в маммографическом скрининге, снизилась на 30—35%. Кроме того, очевидно, что этот метод не может применяться для мониторинга заболевания и оценки результатов лечения у больных с распространенным процессом. При этом эффективность для раннего доклинического выявления РМЖ других методов визуализации, таких, как ультраэхография, магнитно-резонансная маммография, не доказана [2—4].
Все перечисленное указывает на необходимость разработки новых методов диагностики и клинического мониторинга РМЖ. Особенный интерес представляют протеомные маркеры опухолевого роста. Интерес к изучению протеомных маркеров можно связать с тем, что их можно идентифицировать в крови на ранней стадии заболевания и они применимы для мониторинга течения заболевания.
В этой области достигнуты положительные результаты. Технологический прогресс позволил улучшить и ускорить изучение протеома плазмы/сыворотки с помощью новых методов масс-спектрометрии (МС) на основе время-пролетной масс-спектрометрии (ВПМС) с усиленной поверхностью лазерной десорбцией/ионизацией (УПЛДИ) и матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (МАЛДИ) [5]. Эти методы использовались при изучении протеома сыворотки/плазмы крови для диагностики РМЖ. Выявлены комбинации белков (белки), специфичные для больных с ранними и поздними стадиями РМЖ [6—12]. Кроме того, масс-спектрометрические исследования протеома сыворотки/плазмы крови позволили идентифицировать белки, экспрессия которых закономерно менялась в соответствии с клиническим течением заболевания и ответом на терапию. Важно отметить высокую воспроизводимость результатов, полученных в различных лабораториях в отношении некоторых пептидов/протеинов, которые с высокой достоверностью позволяли отличать образцы, полученные у больных РМЖ, от контрольных. Это указывает на потенциальную возможность идентификации маркеров РМЖ с помощью методов МС.
В своем исследовании мы исходили из того, что маркеры РМЖ могут секретироваться в кровоток самой опу-
© Шевченко В. Е., Хасуева М., Поддубная И. В., Арноцкая Н. Е., Таипов М. А., Юрченко В. А., Заридзе Д. Г., 2011 УДК 618.19-006.6-071:577.2.088
холью, окружающими ее тканями или другими органами и тканями в ответ на опухолевый рост. Мы использовали МАЛДИ-ВПМС-профилирование низкомолекулярной фракции (НМФ) протеома образцов плазмы крови для того, чтобы отличить больных РМЖ от контрольных лиц. Продемонстрированы возможности и перспективность разработанного метода для обнаружения потенциальных маркеров РМЖ. В результате исследования обнаружен ряд пептидов/белков, которые могут в перспективе использоваться для выявления этой патологии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследовали плазму крови 100 больных с гистологически подтвержденным диагнозом РМЖ (I—II стадия) (случай) и 60 практически здоровых женщин (контроль) в возрасте от 50 до 78 лет. Образцы плазмы онкологических пациентов получали перед проведением хирургической операции и других видов лечения. Образцы крови собирали в пластиковые пробирки с этилендиаминтетра-уксусной кислотой, центрифугировали (3600 об./мин) при комнатной температуре в течение 10 мин, аликвоты по 100 мкл замораживали и хранили при температуре — 80 °С. Перед исследованием их оттаивали при комнатной температуре в течение 15 мин и немедленно обрабатывали. Образцы плазмы больных РМЖ и контрольной группы произвольно делили на подгруппы (75 и 45) для построения классификационных моделей (процесс обучения) с помощью биоинформационного пакета «СИпРгоТоок 2.1» («Вгакег Daltoшcs») (СРТ) и внешней оценки их дискриминационной способности (25 и 15).
Предварительное фракционирование плазмы проводили с помощью магнитных микрочастиц «MB-WCX» («Вгакег Daltonics»), покрытых слабой катионообменной фазой, по методике производителя. Подготовку МАЛДИ-пластин («Вгикег 384 МТР АпЛогСЫр») выполняли как описано ранее [13].
Профилирование протеома плазмы крови проводили на время-пролетном тандемном масс-спектрометре «иН;гаПех II» («Вгикег Daltonics») [14].
Для сравнения наборов обучающих данных (случай— контроль) использовали биоинформационный пакет СРТ. Математические алгоритмы визуализации СРТ идентифицировали, выдвигали на первый план и локализовали те ионы спектров, площади пиков которых достоверно различались в сравниваемых группах образцов. Применяли методы классической статистики (пакет СРТ) в комбинации с различными алгоритмами построения классификационных моделей, такими, как генетический алгоритм (ГА), метод опорных векторов (МОВ), контролируемые нейтронные сети (КНС), алгоритм быстрой классификации (АБК).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Анализ различных участков масс-спектров после фракционирования позволил выявить пики в диапазоне масс от 1 до 20 кДа, которые отвечали в основном однозарядным ионам протонированных пептидов/протеинов. В обучающем тесте детектировали около 380 различных пиков/спектров при отношении сигнал/шум > 2 в диапазоне масс от 1000 до 20000 Да (325 для 1—10 кДа, 55 для 10—20 кДа), что давало матрицу из 380 х 120 интен-
сивностей (площадей) пиков для двух классов. Данные статистической обработки, часть из которых представлена в табл. 1, свидетельствовали, что 263 пика имели достоверно различающиеся уровни сигнала (р < 0,01) в масс-спектрах образцов плазмы больных РМЖ и контроля. Анализ усредненных масс-спектров показал, что у больных РМЖ интенсивность 256 пиков увеличивалась, а 7 пиков — уменьшалась. Все эти ионы относились к
дифференциально экспрессированным пептидам/белкам, которые можно рассматривать в качестве потенциальных маркеров РМЖ. Для иллюстрации различий в усредненных масс-спектрах двух изучаемых групп на рис. 1 представлен отдельный участок спектра в диапазоне масс 3300—3650 Да. Пики с т^ 3425 и 3477 Да характеризуются различной интенсивностью для 2 классов (больных РМЖ и здоровых женщин) и соответствуют
Таблица 1
Часть результатов статистического анализа усредненных масс-спектров плазмы крови пациентов 2 групп (РМЖ/контроль) после обработки программой CPT
Mass DAve PTTA Ave1 Ave2 StdDev1 StdDev2
13 863,15 0,68 7,71035E-29 0,89 0,2 0,31 0,1
14 627,91 0,77 1,54076E-27 0,99 0,23 0,35 0,12
14 696,43 0,63 8,85182E-27 0,81 0,18 0,3 0,1
19 897,16 1,07 8,85182E-27 1,39 0,32 0,51 0,21
13 314,18 0,47 2,66235E-26 0,66 0,19 0,22 0,1
13 084,29 0,96 6,84876E-26 1,31 0,35 0,46 0,2
13 355,92 0,61 6,84876E-26 0,84 0,23 0,29 0,13
17 052,23 0,88 1,62856E-25 1,19 0,31 0,4 0,22
13 275,46 0,7 3,12248E-25 0,96 0,26 0,36 0,14
13 085,3 0,55 6,84876E-25 0,74 0,18 0,28 0,1
13 699,28 0,38 5,8970E-24 0,51 0,13 0,21 0,07
16 904,45 0,47 5,46074E-23 0,62 0,16 0,22 0,14
18 586,13 0,66 9,66036E-23 0,9 0,24 0,36 0,15
17 382,83 1,48 8,62262E-22 2,01 0,53 0,82 0,34
17 254,97 1,26 5,30887E-22 1,71 0,45 0,67 0,34
13 442,97 0,54 6,97574E-22 0,76 0,22 0,31 0,12
16 736,14 0,66 1,08069E-21 0,87 0,21 0,32 0,2
15 646,21 0,48 2.2563E-21 0,6 0,13 0,23 0,15
12 511,46 0,72 6,5158E-21 1,05 0,33 0,42 0,17
12 866,78 0,22 1,13976E-20 0,32 0,1 0,12 0,06
12 688,80 0,63 7,12572E-20 0,93 0,3 0,36 0,17
AveN — среднее значение для площади пика класса N; DAve — разница средних значений площадей пиков для двух классов; Mass — m/z иона; PTTA — величина p для t-теста; StdDevN — стандартное отклонение значения площади пика для класса N.
4.5
4,0 -
3.5 -
3300 3350 3400 3450 3500 3550 3600 3650
m/z
Рисунок 1. Участок усредненных масс-спектров МАЛДИ-пептидов/протеинов образцов плазмы крови (РМЖ/кон-троль), захваченных магнитными микрочастицами со слабой катионообменной фазой.
пептидам/протеинам с повышенной экспрессией у больных РМЖ.
В этой связи наибольший интерес вызывают пептиды/протеины, представленные в масс-спектре прото-нированными ионами со значениями т^ 13 863, 14 628, 14 696, 14 897, 13 314 Да, интенсивности которых с наибольшей статистической достоверностью различались между двумя классами. Эти пики расположены в верхней части табл. 1 и имеют самые низкие значения р (;-тест). Для иллюстрации дискриминационной способности комбинации из двух пиков масс-спектра на рис. 2 представлено двумерное распределение их площадей (в произвольных единицах) для каждого образца (РМЖ/ контроль), используемого в процессе обучения СРТ. Порядковые номера пиков в спектре и их величины т^ указаны над осями Х и Y. По оси Х отложены значения площадей для пика с тА 13 863 Да, по оси Y — для пика с
160 -
0,05 0,10 0,15
Pk 362,13 863 Да
Рисунок 2. Способность идентифицировать источник образцов плазмы крови (РМЖ/контроль), основанная на значениях площадей пиков с m/z 13 863 и 14 628 Да (в условных единицах) в процессе обучения CPT.
т^ 14 628 Да. Эллипсами выделены стандартные отклонения этих значений для каждого класса. Приведенный график демонстрирует, что большая часть значений площадей этих пиков меньше в образцах контрольной группы (кружки) по сравнению с образцами больных РМЖ (крестики). В дальнейшем дискриминационная способность некоторых из перечисленных пиков была подтверждена с помощью 4 классификационных алгоритмов при построении моделей.
Для формирования моделей использовали классификаторы с набором различных параметров и сравнивали полученные результаты. Генерацию моделей проводили во всем диапазоне масс-спектра от 1000 до 20 000 Да. Для предварительной оценки прогнозирующей способности моделей использовали протокол перекрестной проверки, в котором программа СРТ случайно выбирала 2/3 данных в качестве набора обучения и 1/3 — как испытательный набор, чтобы определить, насколько правильно данная модель позволяла прогнозировать РМЖ. В табл. 2 представлены результаты перекрестной проверки, которые демонстрируют высокую распознавательную способность метода ГА и МОВ (> 97%).
Полученные наборы пиков, отличающие образцы плазмы крови больных РМЖ от контроля, в дальнейшем использовали для внешней проверки в независимой серии из 40 образцов. Основываясь на результатах испытательной серии, вычисляли чувствительность и специфичность построенных дискриминационных моделей. Согласно данным, представленным в табл. 3, наивысшие значения этих параметров имелись у наборов пиков, выявленных методом ГА. Данная модель разделяла образцы плазмы крови пациентов РМЖ и контроля с чувствительностью 95% и со специфичностью 97%. Анализ качественного состава модели ГА, представленного в табл. 4, показал, что она состояла из 5 пиков, уровни сиг-
Таблица 2
Результаты перекрестной проверки дискриминационных моделей, построенных с помощью различных классификаторов
Название алгоритма Перекрестная валидация,%
средняя по классам боль- ные РМЖ кон- троль распозна- вательная способ- ность
Генетический алгоритм 99 99 99 100
Метод опорных векторов 98 97 99 100
Нейтронные сети с учителем 91 86 97 99
Алгоритм быстрой классификации 92 85 98 93
Таблица 3
Чувствительность и специфичность построенных дискриминационных моделей (данные внешней проверки с помощью дополнительной серии образцов), %
нала которых для двух классов достоверно различались (р < 0,01). Для сравнения в табл. 5 приведены подобные параметры для модели, построенной с помощью МОВ и состоящей из 7 пиков, в которой уровни сигнала только
4 пиков достоверно различались (р < 0,01) для двух классов. Эта дискриминационная модель разделяла образцы плазмы крови пациентов РМЖ и контроля с чувствительностью 60% и со специфичностью 96% (см. табл. 3).
ОБСУЖДЕНИЕ
Обнаружение и идентификация маркеров для раннего выявления, мониторинга клинического течения заболевания и индивидуализации лечения является приоритетным направлением онкологии. Научные открытия в этой области приведут к оптимизации методов раннего выявления и лечения злокачественных опухолей и в результате — к снижению смертности от них.
За прошедшее десятилетие опубликованы данные [6—12], описывающие различия в УПЛДИ-ВП-масс-спектрах протеомов образцов сыворотки, полученных от больных РМЖ и женщин контрольной группы. Недавно Y. Fan и соавт. [6] исследовали 128 образцов сыворотки
Таблица 4
Качественный состав дискриминационной модели, построенной с помощью генетического алгоритма
Таблица 5
Качественный состав дискриминационной модели, построенной с помощью метода опорных векторов
Индекс пика Масса (m/z), Да Области интегрирования, используемые для классификации
стартовая масса (m/z), Да конечная масса (m/z), Да
99 2622,52 2613,04 2630,92
103 2732,96 2727,42 2737,96
107 2790,28 2781,99 2795,30
115 2916,73 2910,34 2920,73
191 4711,49 4702,36 4721,35
354 12 948,27 12 912,25 12 980,94
380 19 897,16 19 863,67 19 942,92
больных РМЖ и 158 образцов практически здоровых женщин с использованием двух типов УПЛДИ-ВПМС. Применяя алгоритм классификации (дерево решения), авторы предложили модель из трех потенциальных маркеров РМЖ (пики ионов с т^ 6630, 8139 и 8942 Да), концентрации которых были выше в образцах сыворотки больных РМЖ. Представленные пики ионов также обнаружены нами в масс-спектрах фракции катионных белков плазмы крови больных и контрольной группы, и характер изменения их сигналов совпадает с данными этих авторов. Чувствительность при использовании моделей на базе этих маркеров для обнаружения РМЖ составила 96,45%, специфичность — 94,87% [6]. Маркер-кандидат, которому отвечает ион с т^ 6630 Да, идентифицирован как аполипопротеин С-Г Другие два потенциальных маркера (8139 и 8942 Да), уровни которых увеличиваются в сыворотке больных РМЖ при переходе от I к IV стадии заболевания, представляют собой усеченную форму компонента комплемента С3а и компонент комплемента С3а соответственно [6].
В другом исследовании [7] с помощью УПЛДИ-ВПМС были проанализированы образцы сыворотки 75 больных РМЖ и 26 лиц контрольной группы. Спектры генерировали на 8 чипах !МАС30 № и Q10 pH. Для построения классификационной модели с помощью алгоритма дерева решений были автоматически выбраны 3 пика. Эффективность созданной модели, которая в дальнейшем использовалась для перекрестной валидации, составила от 68 до 87%.
А. Lebгecht и соавт. [8] изучали 20 образцов сыворотки, полученных у 10 больных РМЖ, и 10 контролей. Спектры получали методом УПЛДИ-ВПМС на 3 различных чипах. Диагностические наборы позволяли отличать онкологических больных от контроля со специфичностью и с чувствительностью около 90%. С. ВеПисо и со-
Индекс пика Масса (m/z), Да Области интегрирования, используемые для классификации
стартовая масса (m/z), Да конечная масса (m/z), Да
79 2288,35 2285,11 2293,32
89 2448,57 2433,92 2459,40
261 7007,05 6988,34 7017,46
380 19 897,16 19 863,67 19 942,92
1 1007,22 1005,68 1010,06
Классификационные алгоритмы Чувстви- тельность Специ- фичность
Генетический алгоритм 95 97
Метод опорных векторов 60 96
Контролируемые нейтронные сети 88 95
Алгоритм быстрой классификации 68 93
авт. [9] исследовали методом УПЛДИ-ВПМС сыворотку от 150 больных РМЖ (I стадия) и 150 субъектов контрольной группы. Образцы произвольно делили на группу для обучения методу (109 контролей и 109 случаев) и для анализа слепым методом (46 контролей и 46 случаев). Дискриминационный набор состоял из 7 пиков и обеспечивал чувствительность 95,6% и специфичность 86,5%.
В отличие от этих исследований, мы использовали технологию МАЛДИ-ВПМС, которая разработана значительно лучше, чем УПЛДИ-ВПМС [15]. При профилировании плазмы, полученной от больных РМЖ и контрольной группы, мы обнаружили ряд ионов, которые соответствовали пептидам/протеинам с различными уровнями экспрессии. Нами обнаружены потенциальные маркеры, различные комбинации которых позволяли разделять образцы плазмы больных РМЖ и контрольной группы с чувствительностью и со специфичностью > 90%. В зависимости от типа классификатора были созданы качественно различные модели, проверка которых на дополнительной серии образцов слепым методом позволяла проводить отбор наиболее эффективных из них. Самую высокую чувствительность и специфичность обеспечивала модель, сформированная ГА (> 95%). Представленные результаты указывают на то, что модель, построенная ГА, обладает наибольшей эффективностью при разделении образцов плазмы крови больных РМЖ и контрольной группы. Можно утверждать с большой долей вероятности, что отобранные маркеры обладают высокими дискриминационными свойствами. Тем не менее число проанализированных нами образцов плазмы крови больных РМЖ относительно невелико, что может сказаться на проверке качества представленных моделей. В этой связи необходимы дальнейшие исследования для подтверждения и уточнения полученных результатов.
Кроме того, отдельные пептиды (например, с m/z 13 863, 14 628, 14 696, 19 897, 13 314 Да), интенсивность которых с наибольшей статистической достоверностью позволяла отличить плазму больных РМЖ от плазмы контрольной группы, могут рассматриваться в качестве потенциальных маркеров РМЖ и нуждаются в дополнительном исследовании.
В представленной работе мы применили МАЛДИ-ВПМС-анализ плазмы крови и определили значения m/z пиков, которые отвечают потенциальным маркерам РМЖ и могут в дальнейшем использоваться для разработки технологий, связанных с маркерами плазмы крови. Основное преимущество такого подхода заключается в высокой надежности и производительности масс-спектрометрических методов. После идентификации и синтеза ключевых белков могут быть созданы антитела для разработки высокопроизводительных, дешевых тест-систем. В дальнейшем эти наборы могут быть включены в проспективные испытания для оценки прогностического значения этих белков в распознавании рака.
заключение
Разработана, унифицирована и апробирована новая методология поиска маркеров РМЖ — профилирование низкомолекулярных протеомов (1—20 кДа) плазмы крови. Данный подход включал три основных
компонента: роботизированную предварительную подготовку образцов, МАЛДИ-ВПМС, обработку данных с помощью биоинформационного пакета программ. При фракционировании плазмы использовались магнитные частицы с катионообменным покрытием для специфического захвата биомолекул. Данная платформа была оптимизирована и успешно использовалась для автоматизированной подготовки клинических образцов перед масс-спектрометрическим анализом. Проведение анализа с помощью МАЛДИ-ВПМС обеспечивало высокую чувствительность, специфичность, воспроизводимость, необходимые для анализа сложных протеомов. Изучена возможность использования различных классификационных алгоритмов программного пакета CPT для генерации диагностически значимых наборов пептидов/ протеинов из данных по масс-спектрометрическому профилированию плазмы крови больных РМЖ и контрольной группы. Продемонстрированы возможности и перспективность разработанного подхода для обнаружения потенциальных маркеров РМЖ.
ЛИТЕРАТУРА
1. Заридзе Д. Г. Профилактика рака. Руководство для врачей. — М.: ИМАПресс, 2009.
2. Заридзе Д. Г. Эпидемиология и скрининг рака молочной железы // Вопр. онкол. — 2002. — Т. 4—5. — С. 489—495.
3. Заридзе Д. Г. Скрининг злокачественных опухолей с использованием методов лучевой диагностики // Вестн. РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН. — 2004. — Т. 1—2. — С. 49—52.
4. Breast cancer Screening. IARC Handbook of Cancer Prevention. International Agency for Research of Cancer. World Health Organization. — IARC Press, 2002.
5. Шевченко В. Е. Современные масс-спектрометрические методы в ранней диагностике рака // Масс-спектрометрия. — 2004. — Т. 1, № 2. — С. 103—126.
6. Detection and identification of potential biomarkers of breast cancer / Fan Y., Wang J., Yang Y., Liu Q., Fan Y., Yu J., Zheng S., Li M., Wang J. // J. Cancer. Res. Clin. Oncol. — 2010. — Vol. 136, N 8. — P. 1243—1254.
7. Detection of breast cancer by surface-enhanced laser desorption/ ionization time-of-flight mass spectrometry tissue and serum protein profiling / Gast M. C., van Dulken E. J., van Loenen T. K., Kingma-Vegter F., Westerga J., Flohil C. C., Knol J. C., Jimenez C. R., van Gils C. H., Wessels L. F., Schellens J. H., Beijnen J. H. // Int. J. Biol. Markers. — 2009. — Vol. 24, N3. — P. 130—141.
8. Surface-enhanced Laser Desorption / Ionisation Time-of-flight Mass Spectrometry to Detect Breast Cancer Markers in Tears and Serum // Lebrecht A., Boehm D., Schmidt M., Koelbl H., Grus F. H. // Cancer Genomics Proteomics. — 2009. — Vol. 6, N 2. — P. 75—83.
9. Serum proteomic analysis identifies a highly sensitive and specific discriminatory pattern in stage 1 breast cancer / Belluco C., Pet-ricoin E. F., Mammano E., Facchiano F., Ross-Rucker S., Nitti D., Di Maggio C., Liu C., Lise M., Liotta L. A., Whiteley G. // Ann. Surg. Oncol. — 2007. — Vol. 14, N 9. — P. 2470—2476.
10. A novel approach toward development of a rapid blood test for breast cancer / Vlahou A., Laronga C., Wilson L., Gregory B., Fournier K., McGaughey D., Perry R. R., Wright G. L., Semmes O. J. // Clin. Breast Cancer. — 2003. — Vol. 4. — P. 203—209.
11. Proteomics and bioinformatics approaches for identification of serum biomarkers to detect breast cancer / Li J., Zhang Z., Rosenzweig J., Wang Y. Y., Chan D. W. // Clin. Chem. — 2002. — Vol. 48. — P. 1296— 1304.
12. SELDI-TOF-MS: the proteomics and bioinformatics approaches in the diagnosis of breast cancer / Hu Y., Zhang S., Yu J., Liu J., Zheng S. // Breast. — 2005. — Vol. 14. — P. 250—255.
13. Профилирование низкомолекулярного протеома плазмы крови для обнаружения потенциальных маркеров рака легкого / Шевченко В. Е., Арноцкая Н. Е., Трифонова О. П., Дашкевич А. С.,
Юрченко В. А., Заридзе Д. Г. // Масс-спектрометрия. — 2007. — Т. 4, № 4. — С. 245—254.
15. Serum peptide profiling by magnetic particle-assisted, automated sample processing and MALDI-TOF mass spectrometry / Villanueva J., Philip J., Entenberg D., Chaparro C. A., Tanwar M. K., Holland E. C., Temps P. // Anal. Chem. — 2004. — Vol. 76. — P. 1560—1570.
14. Shevchenko V. E, Arnotskaya N. E., Zaridze D. G. Detection of lung cancer using plasma protein profiling by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry // Eur. J. Mass. Spectrom. — 2010. — Vol. 16, N 4. — P. 539—549.
Поступила 12.04.2011
Valeriy Evgenievich Shevchenko1, Madina Khasuyeva2,
Irina Vladimirovna Poddubnaya3, Natalia Arsenievna Arnotskaya4,
Marat Azatovich Taipov5, Valentina Alexandrovna Yurchenko6,
David Georgievich Zaridze7
MASS-SPECTROMETRIC PROFILING OF BLOOD PLASMA LOW-MOLECULAR PROTEOME TO DETECT POTENTIAL BREAST CANCER MARKERS
1 DSc, PhD, DSc, Professor, Head, Oncoproteomics Laboratory, Department of Tumor Epidemiology and Prevention, Carcinogenesis Research. Institute, N. N. Blokhin RCRC RAMS (24, Kashirskoe sh., Moscow, 115478, RF)
2 Postgraduate Student, Chair of Oncology, RMAPE (2/1, ul. Barrikadnaya, Moscow, 123836, RF)
3 MD, PhD, DSc, Professor, Associate Member of RAMS, Prorector for Teaching, RMAPE (2/1, ul. Barrikadnaya, Moscow, 123836, RF)
4 MSc, Senior Researcher, Oncoproteomics Laboratory, Department of Tumor Epidemiology and Prevention, Carcinogenesis Research Institute, N. N. Blokhin RCRC RAMS (24, Kashirskoe sh., Moscow, 115478, RF)
5 Laboratory Researcher, Oncoproteomics Laboratory, Department of Tumor Epidemiology and Prevention, Carcinogenesis Research Institute, N. N. Blokhin RCRC RAMS (24, Kashirskoe sh., Moscow, 115478, RF)
6 MSc, PhD, Senior Researcher, Tumor Epidemiology Unit, Department of Tumor Epidemiology and Prevention, Carcinogenesis Research Institute, N. N. Blokhin RCRC RAMS (24, Kashirskoe sh., Moscow, 115478, RF)
7 MD, PhD, DSc, Professor, Associate Member of RAMS, Head, Department of Tumor Epidemiology and Prevention, Carcinogenesis Research. Institute, N. N. Blokhin RCRC RAMS (24, Kashirskoe sh., Moscow, 115478, RF)
Address for correspondence: Shevchenko Valeriy Evgenievich, Oncoproteomics Laboratory, Department of Tumor Epidemiology and Prevention, Carcinogenesis Research Institute, N. N. Blokhin RCRC RAMS, 24, Kashirskoe sh., Moscow, 115478, RF; e-mail: vshev@nm.ru
Identification of biological markers for early detecting and monitoring of breast cancer is one of the most important fields of cancer research. In this study we developed a new procedure for discovery of tumor markers, which involves profiling of low-molecular blood plasma proteomes (1-20 KDa). Our approach consisted of three basic components: robotics pre-preparation of samples, matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry and bioinformatics software for mass spectral data processing. We analyzed 100 samples of blood plasma from breast cancer patients and 60 control samples. A combination of certain peptides/proteins has been identified that allows high sensitivity and specificity differentiation of plasma from breast cancer patients and plasma from controls. These peptides/proteins can be used in future as potential breast cancer markers.
Keywords: biomarkers, breast cancer, proteome profiling, blood plasma.
