CC BY
36
УДК 664:543 Табл. 3. Ил. 1. Библ. 21.
МАСС-СЕЛЕКТИВНАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГОРМОНАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ В МЯСНОМ СЫРЬЕ. АНАЛИЗ В-АГОНИСТОВ
Куликовский А.В., канд. техн. наук, Кузнецова О.А., канд. техн. наук, Иванкин А.Н., доктор хим. наук ФГБНУ «ВНИИМП им. В.М. Горбатова»
MASS-SELECTIVE IDENTIFICATION OF HORMONAL DRUGS IN THE MEAT RAW. ANALYSIS OF В-AGONISTS
Kulikovskii A.V., Kuznetsova O.A., Ivankin A.N.
The V.M. Gorbatov All-Russian Meat Research Institute
Ключевые слова:
гормоны, ß-агонисты, мясное сырье
Реферат.
Описан метод определения гормональных стимуляторов роста домашних животных ß-агонистов. Подобраны условия проведения измерений методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором (ВЭЖХ-МС/МС). Оптимизированы процессы подготовки проб из органов и тканей животных. В результате оптимизации условий элюирования, степень извлечения искомых ß-агонистов составила от 69 до 87 %, нижний предел количественного определения для всех ß-агонистов был не менее 1 мкг/кг. Показано, что твердофазная экстракция повышает селективность определения гор-монональных препаратов в мясном сырье, позволяет минимизировать влияние органических примесей на результат измерений. За счет перевода анализируемых веществ из большого объема жидкой матрицы в твердую фазу сорбента можно сконцентрировать даже следовые количества ß-агонистов. Однако при такой пробоподготовке не исключены потери при смыве с картриджа, поэтому для расчёта степени извлечения желательно использование изотопно-меченых внутренних стандартов ß-агонистов. В материале представлены методические рекомендации для анализа 11-и ß-агонистов в качестве которых использовали: тербуталин, циматерол, сальбутамол, рактопамин, тулобутерол, кленбутерол, мабутерол, зилпатерол, пропранолол, мапентерол, сальметерол.
Гормональные препараты применяются в ряде стран для интенсификации выращивания скота и птицы. Так, например, использование запрещенных сегодня к применению в РФ стильбенов в виде добавки в корм 10 мг в день на одно животное позволяет получать привесы скота 10-27 % при экономии кормов
Keywords:
hormones, B-agonists, raw meat
Summary.
Describes a method of determining the hormonal growth promotants pets-6-agonists. Selected conditions of measurement method for high-performance liquid chromatography with mass spectrometric detection (HPLC-MS/MS). Optimized processes for the preparation of samples of organs and tissues of animals. As a result of optimization of elution conditions, the degree of extraction of desired 6-agonists ranged from 69 to 87 %, the lower limit of quantification for all 6-agonist was not less than 1 ^g/kg. It is shown that the solid phase extraction improves the selectivity of gormononal definition of drugs in meat raw materials, to minimize the effect of organic impurities in the measurement result. Through translation of analyzed substances from large volume liquid matrix in the solid phase of the sorbent can be concentrated even trace amounts of 6-agonists. However, this sample does not exclude losses when flushing with the cartridge, therefore, to calculate the degree of extraction it is advisable the use of isotope-labeled internal standards of 6-agonists. In the material presented methodical recommendations for the analysis of eleven 6-agonist which used: terbutaline, ractopamine, salbutamol, cimaterol, clenbuterol, tulobuterol, mabuterol, zilpaterol, propranolol, mapenterol, salmeterol. The authors are grateful to the Russian Science Foundation for the financial support in the implementation of this research according to the scientific project # 15-16-00008.
на 8-14 %, что эквивалентно получению 10-20 $ чистой прибыли на каждый вложенный доллар [1-4].
Введение
Метаболизм фармакологических стимуляторов роста приводит к их выведению из организма животных в течение 100-200 дней, однако и в более поздние сро-
ки можно обнаружить до 10 % исходного количества введенного препарата в органах и тканях животного. Обладая высокой биологической активностью, остатки таких веществ представляют исключительную опасность для человека, потребляющего мясо, полученное с применением гормональных технологий, поэтому применение гормонов при выращивании скота и птицы законодательно запрещено во многих странах [5-7].
Учитывая высокую привлекательность применения гормональных технологий выращивания и их опасность для человека, необходим контроль за остатками гормонов в мясе и мясной продукции, в первую очередь поступающих по импорту [8].
На основании действующих директив Европейского Союза ЕС 469/86, ЕС 675/92, ЕС 1430/94, ЕС 3426/93, ЕС 23/96 и ЕС 22/96 в странах Евросоюза осуществляется систематический контроль за остаточным содержанием гормональных препаратов в мясе и мясной продукции (мясо скота и птицы) по следующим препаратам (таблица 1) [9,10].
Таблица 1. Европейские нормы содержания гормонов
*) ГХ-МС - газовая хроматография с масс-спектрометрическим детектором, РИА - радиоиммунологический анализ, ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография, ИФА -иммуноферментный анализ, ТСХ- тонкослойная хроматография
В нашей стране в соответствии с нормативными требованиями рекомендуется осуществлять контроль за содержанием следующих веществ (таблица 2) [11-13]:
Таблица 2. Нормируемый уровень содержания гормональных препаратов в пищевом сырье в Российской Федерации
NN Наименование Объект контроля Допустимый уровень, мкг/кг
1 Тестостерон** - -
2 Эстрадиол 17b - -
3 Прогестерон** - -
4 Тренболон КРС мясо, печень 2 10
5 Зеранол КРС мясо, печень 2 10
6 Карбадокс свиньи мясо, печень 5 10
7 Соматотропин КРС мясо, печень 0
8 Дексаметазон КРС мясо, печень 0,5 2,5
9 Азаперон свиньи мясо, почки 60 100
**) Контроль по международным требованиям
б-агонисты - группа веществ, которые наряду со стероидными гормонами применяются в качестве стимуляторов роста животных. Хотя fi-агонисты не являются стероидными гормонами, по фармакологическим свойствам их можно сравнить с ними. Эти вещества обладают сильным антикатаболическим действием и способствуют увеличению мышечной массы [14]. Другое действие этих препаратов обусловлено значительным жиросжигающим действием, что приводит к получению постного мяса, пользующегося большим спросом на рынке. Вместе с тем при потреблении с пищей у человека 6-агонисты могут спровоцировать тахикардию, повышение артериального давления и другие нарушения, вплоть до летального исхода [15]. Особую опасность представляет потребление такой продукции людьми с сердечно-сосудистыми заболеваниями [16]. По химическому строению 6-агонисты можно разделить на три основные группы: анилинового (кленбутерол, бромбутерол, мабутерол, мапентерол, цимбутерол), фенольного (салбутамол, карбутерол, рактопамин) и резорцинового (тербуталин) типа [17].
Использование рактопамина в качестве стимулятора роста для повышения продуктивности животных запрещено в 160 странах, включая Китай и страны Европейского Союза (Council Directive 96/22/ЕС; Directive 2003/74/ЕС) [18]. В Российской Федерации по Указанию Главного госветинспектора РФ № 137-1/900 от 04.10.99 и в соответствии с Решением комиссии Таможенного союза № 299 от 28.05.2010 использование ветеринарных препаратов (стимуляторов роста животных, в том числе гормональных препаратов) не допускается [19].
В ряде стран (США, Канаде и др.) некоторые природные и синтетические гормональные стимуляторы роста сельскохозяйственных животных официально
NN Наименование Объект Допустимый уровень, мкг/кг Метод* контроля
1 Тестостерон сыворотка крови 0,5 ГХ-МС,РИА, ВЭЖХ, ИФА
2 Эстрадиол 17b сыворотка крови 0,04 ГХ-МС,РИА, ВЭЖХ, ИФА
3 Метилтесто-стерон сыворотка крови, мясо 2,0 0 РИА, ИФА
4 Этинилэстра-диол мясо 0 ГХ-МС, ВЭЖХ, ИФА
5 Тренболон мясо 0 ГХ-МС, РИА, ВЭЖХ, ИФА
6 Диэтилстильб-эстрол мясо, печень 0 ГХ-МС,РИА, ВЭЖХ, ИФА
7 Зеранол мясо 0 ГХ-МС, ВЭЖХ, ИФА
8 Кленбутерол сыворотка крови, мясо, печень 0 ГХ-МС, ВЭЖХ, ИФА
9 Дексаметазон мясо, печень, сыворотка крови 0,5 2,0 ГХ-МС, ВЭЖХ, ИФА
10 19-нортесто-стерон мясо 1,0 РИА, ИФА
11 Гестагены жир 0 РИА, ВЭЖХ, ИФА
12 Тиреостатики сыворотка крови <100 ГХ-МС,ТСХ, ВЭЖХ
разрешены, поэтому необходим строгий контроль поступающей импортной продукции животного происхождения. В странах ЕС на постоянной основе осуществляется такой контроль в соответствии с Директивой 96/23/ЕС, а введение его в Российской Федерации сдерживает отсутствие нормативно-методической базы [20].
В РФ разработана методика определения остаточных количеств пяти fi-агонистов в кормах, физиологических жидкостях, органах и тканях животных с помощью газовой хроматографии с масс-спектроме-трическим детектором (ГХ-МС) (ГОСТ Р 54032-2010) [21]. Недостатками этой методики являются сложная пробоподготовка и необходимость предварительной дериватизации пробы. Также она не позволяет определять fi-агонисты нового поколения, в том числе рактопамин и зилпатерол, наиболее широко распространенные в США, Аргентине и Австралии.
Цель работы заключалась в разработке новой подтверждающей методики определения 6-агонистов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором (ВЭЖХ-МС/МС), которая не требует сложной дериватизации.
В рамках Межгосударственной программы стандартизации на 2015 г. в ФГБНУ «ВНИИМП им. В.М. Горбатова» разработан метод определения 6-агонистов с помощью ВЭЖХ-МС/МС, позволяющий определять одиннадцать 6-агонистов в мясе и мясной продукции. Метод основан на ферментативном гидролизе пробы пищевого продукта, извлечении бета-аго-нистов смесью изопропилового спирта с этилацетатом и очистке твердофазной экстракцией (ТФЭ). Детектирование 6-агонистов проводили в режиме мониторинга множественных реакций (MRM). Предел количественного определения для всех 6-агонистов составил не менее 1 мкг/кг.
Объекты и методы исследований
В качестве реактивов использовали: этилацетат для ВЭЖХ, уксусную кислоту, производства Sigma-Aldrich (США), хлорную кислоту, метанол для ВЭЖХ, аце-тонитрил для ВЭЖХ, спирт изопропиловый производства J.T. Baker (США), ацетат натрия, гидроксид натрия, хлорид натрия, муравьиную кислоту Merck (США), аммиак водный Fluca (США), деонизованную воду, полученную на системе MilliQDirect 8 (Франция). В исследованиях использовали картриджи для твердофазной экстракции BondElut (Agilent, США) вместимостью 6 мл с 0,2 г сорбента, а также ^-глю-куронидазу из виноградной улитки (^-Glucuronidase from HelixpomatiaG8885) производства компании Sigma-Aldrich (США).
В качестве стандартов использовали: кленбутерол с содержанием основного вещества (95,0 %), сальбута-мол (96,0 %), рактопамин (99,9 %), тербуталин (98,0 %), сальметерол (98,0 %), пропранолол (99 %), тулобуте-рол (99,9 %), циматерол (99,9 %), мабутерол (99,9 %), мапентерол (99,9 %), зилпатерол (98,0 %) производства компании Sigma-Aldrich (США).
Для подготовки проб к анализу, образец массой
5 г, помещали в центрифужную пробирку. Добавляли 20 см3 0,2М раствора ацетата натрия с pH 5,2. Добавляли 0,250 см3 бета-глюкуронидазы активностью 1000 ед./см3, перемешивали и ставили на водяную баню при температуре 37 °С на 16 ч. Гидролизат центрифугировали 5 мин. при 4000 оборотов в мин. 4 см3 суперна-танта отбирали в центрифужную пробирку, добавляли 5 см3 0,1М раствора хлорной кислоты, доводили pH хлорной кислотой до 1±0,3, пробу центрифугировали 10 мин. Супернатант переносили в пробирку, доводили pH до 11,0 10М раствором гидроксида натрия. В пробирку добавляли 10 см3 3М раствора хлорида натрия и 10 см3 смеси изопропилового спирта с этилацета-том (6:4), перемешивали, центрифугировали 5 мин., экстракцию повторяли дважды. Органический слой изопропилового спирта с этилацетатом упаривали на роторном испарителе Heidolph Laborota 4003 при 40 °С. Сухой остаток растворяли в 5 см3 0,2М раствора ацетата натрия pH 5,2, и проводили твердофазную экстракцию (ТФЭ). Для этого картриджи BondElut (Agilent, США) предварительно активировали 3 см3 метанола и 3 см3 дистиллированной воды. Раствор пробы наносили на картридж со скоростью 1 см3/мин. Картридж промывали 2 см3 дистиллированной воды и 2 см3 раствора 2 % муравьиной кислоты. Аналиты элюировали 5 см3 5 % раствора аммиака в метаноле со скоростью 1 см3/мин. Элюат упаривали досуха на роторном испарителе при 40 °С. Сухой остаток растворяли в 1 см3 смеси 1 % муравьиной кислоты с метанолом (9:1). Раствор пропускали через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм и проводили ВЭЖХ-МС/МС анализ.
Анализ проводили на системе высокоэффективной жидкостной хроматографииAgilent1200 (США) с трех квадрупольным масс-спектрометром Agilent 6410B.
Разделение осуществляли на колонке AgilentXDB-C18 (4,6х50 мм, 1,8 мкм) в режиме градиентного элюирования: в течение 1 мин., уравновешивание хроматографической колонки - 98 % элюента А (1 % раствор муравьиной кислоты) и 2 % элюента В (смесь ацетонитрила с метанолом (1:1)), после ступенчатый градиент до 65 % элюента А и 35 % элюента В за 3 мин., далее до 10 % элюента А и 90 % элюента В за 4 мин. Температура колонки 40 °С. Объем вводимой пробы 10 мкл, скорость элюирования 400 мклмин-1.
Ионизацию проводили распылением в электрическом поле (ESI). Для анализа были подобраны следующие параметры масс-спектрометрического детектирования:
Температура источника - 100 °С;
Температура газа десольвации - 350 °С;
Скорость потока газа десольвации - 5 дм3/мин;
Давление иглы распылителя - 45 psi (3,1 Бар).
Условия детектирования оптимизировали в ручном режиме. Напряжение на фрагменторе оптимизировали с шагом 10 V по максимальному отклику протонирован-ного молекулярного иона. Энергию диссоциации (CE) оптимизировали с шагом 1V по максимальному отклику характерного дочернего иона. При этом, соотношение сигнал/шум (S/N) молекулярного иона должно быть не менее 1:10.
Результаты исследования и их обсуждение
Условия регистрации аналитических сигналов в режиме мониторинга множественных реакций (MRM) представлены в таблице 3.
Таблица 3. Параметры воздействия на ионы в режиме MRM и условия ионизации распылением в электрическом поле (ESI) с регистрацией положительных ионов
условия действия фермента. Гидролиз проводили в течение 16 часов при температуре 37 °С в ацетатном буфере рН 5,2. Для осаждения белков после гидролиза использовали раствор хлорной кислоты.
Аналит Молекулярный ион, m/z Дочерние йоны, m/z Напряжение на фраг-менторе (Frag), В Энергия диссоциации (CE), В
Кленбутерол 277,2 203,1 259,1 100 12 5
Сальбутамол 240,2 148,2 222,1 100 15 5
Рактопамин 302,2 164,2 284,1 110 12 6
Тербуталин 226,1 152,2 170,2 100 12 6
Сальметерол 416,3 380.3 398.4 130 17 10
Пропранолол 260,2 116,2 183,2 120 15 15
Тулобутерол 228,1 154.1 172.2 100 12 5
Циматерол 220,1 160,2 202,1 90 12 3
Мабутерол 311,2 237.1 293.2 110 13 7
Мапентерол 325,3 237.1 307.2 110 12 5
Зилпатерол 262,2 244,2 202,2 100 7 17
Идентификацию fi-агонистов проводили по абсолютному времени удерживания хроматографических пиков целевых веществ, регистрируемых в режиме мониторинга множественных реакций (MRM) с использованием средств программного обеспечения «Mass Hunter Workstation» (Agilent, США). Строили градуировочную зависимость площади пика определяемых 6-агонистов от концентрации в пробе. Коэффициент линейной корреляции полученной градуировочной зависимости составил по пикам 6-агонистов не менее 0,99. Полученные хроматограммы стандартных образцов 6-агонистов и калибровочные кривые даны на рисунке 1.
Основной сложностью разработки мультиком-понентного метода определения 6-агонистов анилинового, фенольного и резорцинового типа являются различия в полярности и особенности метаболизма. 6-агонисты анилинового типа такие, как мапентерол, кленбутерол, цимбутерол, практически не образуют конъюгированных форм с глюкуроновой и серной кислотами. В то время как 6-агонисты фенольного (сальбутамол) и резорцинового (тербутапин) типа образуют полярные глюкурониды и сульфаты в процессе метаболизма [14]. Учитывая данные особенности, для гидролиза коньюгированных форм был применен ферментативный препарат ^-глюкуронидаза из виноградной улитки (G8885), подобраны оптимальные
Рисунок 1. Хроматограмма градуировочных растворов С-агонистов - общий ионный ток и MRM переходы (1- тербуталин, 2 - циматерол, 3 - сальбутамол, 4 -рактопамин, 5 - тулобутерол, 6 - кленбутерол, 7 - мабутерол, 8 - зилпатерол, 9 -пропранолол, 10 - мапентерол, 11- сальметерол)
Были проведены исследования с целью выявления нижнего предела количественного определения (LLOQ) и определения степени извлечения в ходе подготовки проб. Для этого в пробы вносили смесь стандартных растворов 6-агонистов. Извлечение 6-агонистов анилинового, фенольного и резорцинового типа проводили методом жидкостно-жидкост-ной экстракции смесью изопропилового спирта с этилацетатом. При анализе экстрактов происходило подавление ионизации матрицей вследствие недостаточной очистки проб. Применение ТФЭ позволило минимизировать «эффект матрицы» и достигнуть стабильного аналитического сигнала. Для ТФЭ были использованы картриджи BondElut (Agilent, США). В состав картриджа ТФЭ входят обращеннофазные и ионообменные компоненты, которые позволяют за счет гидрофобных взаимодействий и ионного обмена одновременно определять 6-агонисты анилинового, фенольного и резорцинового типа.
Одной из основных задач постановки метода являлась минимизация потерь 6-агонистов, связанных непосредственно с процедурой пробоподготовки. Для исключения возможности присутствия в анализируемой пробе органических загрязнителей, были оптимизированы условия элюирования для ТФЭ. После жидкость-жидкостной экстракции, упаривали органический растворитель и перерастворяли пробу в ацетатном буфере pH 5,2, это позволяло уменьшить примеси за счет неполярных взаимодействий. Картридж промывали 2 см3 дистиллированной воды и 2 см3 раствора 2 % муравьиной кислоты, что позволяло избавиться от нейтральных примесей и способствовало селективному удержанию положительно заряженных молекул 6-агонистов на картридже. Для
смыва 6-агонистов в элюат был добавлен амммиак, что приводило к нейтрализации аминогрупп 6-агонистов, а также разрушению гидрофобных взаимодействий и ионных связей. При подборе условий элюирования эмпирически было установлено, что для смыва 6- аго-нистов анилинового, фенольного и резорцинового типа требуется не менее 5 см3 элюата.
В результате оптимизации условий элюирования, степень извлечения искомых 6-агонистов составила от 69 до 87 %, нижний предел количественного определения для всех веществ был не менее 1 мкг/кг. ТФЭ повышает селективность определения 6-агонистов и позволяет минимизировать влияние органических примесей на результат измерений. За счет перевода анализируемых веществ из большого объема жидкой матрицы в твердую фазу сорбента можно сконцентрировать даже следовые количества 6-агонистов. Однако при ТФЭ не исключены потери при смыве с картриджа, поэтому для расчёта степени извлечения желательно использование изотопно-меченых внутренних стандартов 6-агонистов.
Заключение
Приведенные выше процедуры позволяют значительно снизить суммарную погрешность масс-спектрометрической методики анализа, за счет уменьшения влияния и стандартизации процедуры пробоподготовки.
Исследование выполнено при финансовой поддержке гранта Российского научного фонда (проект № 15-16-00008).
© КОНТАКТЫ:
Куликовский Андрей Владимирович
V +7 (495) 676-9891 а [email protected]
Кузнецова Оксана Александровна а [email protected]
Иванкин Андрей Николаевич а [email protected]
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
1. Anderson P.T., Johnson B.J., Dikeman M. Growth of meat animals . Metabolic Modifiers. Encyclopedia of Meat Sciences (Second Edition).Elsevier, 2014, P. 62-69.
2. Bartus R/T., Betourne A., Basile A., Peterson B. L., Glass J., Boulis N.M. 02-Adrenoceptor agonists as novel, safe and potentially effective therapies for Amyotrophic lateral sclerosis// Neurobiology of Disease. - 2016. - V.85. № 1. - P. 11-24.
3. Martins S.I., Madeira M.D., Sa S.I. Effects of gonadal steroids and of estrogen receptor agonists on the expression of estrogen receptor alpha in the medial preoptic nucleus of female rats // Neuroscience. - 2015. - V.310. - № 12. - P. 63-72.
4. Farouk M.M., Regenstein J.M., Pirie M.R., Najm R., Bekhit A.E.D., Knowles S.O. Spiritual aspects of meat and nutritional security: Perspectives and esponsibilities of the Abrahamic faiths // Food Research International. -2015. - V. 76. - № 10. - P. 882-895.
5. Xiong L., Gao Y.Q., Li W.H., Yang X.L., Shimo S.P.Simple and sensitive monitoring of 02-agonist residues in meat by liquid chromatography-tandem mass spectrometry using a QuEChERS with preconcentration as the sample treatment // Meat Science. - 2015. - V. 105. № 7. - P. 96-107.
6. Gao F., Wu M., Zhang Y., Wang G., Wang Q., He P., Fang Y.Sensitive determination of four 02-agonists in pig feed by capillary electrophoresis using on-line sample preconcentration with contactless conductivity detection //Journal of Chromatography B. - 2014. - V. 973. - №12. - P. 29-32.
7. Weber M.J., Dikeman M.E., Jaeger J.R., Unruh J.A., Murray L., Houser T.A. Effects of feeding a single or sequence of beta-adrenergic agonists on cull cow meat quality //Meat Science. -2013. - V. 93. - №2. - P. 275-281.
8. Bungo T., Kawamura K., Izumi T., Dodo K.I., Ueda H. Feeding responses to ц-, 5- and к-opioid receptor agonists in the meat-type chick //Pharmacology Biochemistry and Behavior. - 2004. - V.78. - № 8ю - P. 707-710.
9. Ivankin A.N., Karpo B.S., Galkin A.V. Analysis of
REFERENCES:
1. Anderson P.T. Growth of meat animals. Metabolic Modifiers. Encyclopedia of Meat Sciences (Second Edition) // P.T. Anderson, B.J. Johnson, M. Dikeman. - London: Elsevier, 2014. - P. 62 - 69.
2. Bartus R.T. 02-Adrenoceptor agonists as novel, safe and potentially effective therapies for amyotrophic lateral sclerosis // R.T. Bartus, A. Betourne, A. Basile, B. L. Peterson, J. Glass, N.M. Boulis. - Neurobiology of disease, 2016. V. 85. № 1. - P. 11 - 24.
3. Martins S.I. Effects of gonadal steroids and of estrogen receptor agonists on the expression of estrogen receptor alpha in the medial preoptic nucleus of female rats // S.I. Martins, M.D. Madeira, S.I. Sa. - Neuroscience, 2015. V. 310. № 12. - P. 63 - 72.
4. Farouk M.M. Spiritual aspects of meat and nutritional security: Perspectives and esponsibilities of the Abrahamic faiths // M.M. Farouk, J.M. Regenstein, M.R. Pirie, R. Najm, A.E.D. Bekhit, S.O. Knowles. - Food research international, 2015. V. 76. № 10. - P. 882 - 895.
5. Xiong L. Simple and sensitive monitoring of 02-agonist residues in meat by liquid chromatography-tandem mass spectrometry using a QuEChERS with preconcentration as the sample treatment // L. Xiong, Y.Q. Gao, W.H. Li, X.L. Yang, S.P. Shimo. - Meat Science, 2015. V. 105. № 7. - P. 96 - 107.
6. Gao F. Sensitive determination of four 02-agonists in pig feed by capillary electrophoresis using on-line sample precon-centration with contactless conductivity detection // F. Gao, M. Wu, Y. Zhang, G. Wang, Q. Wang, P. He, Y. Fang. - Journal of chromatography B, 2014. V. 973. № 12. - P. 29 - 32.
7. Weber M.J. Effects of feeding a single or sequence of beta-ad-renergic agonists on cull cow meat quality // M.J. Weber, M.E. Dikeman, J.R. Jaeger, J.A. Unruh, L. Murray, T.A. Houser. -Meat science, 2013. V. 93. № 2. - P. 275 - 281.
8. Bungo T. Feeding responses to 5- and K-opioid receptor agonists in the meat-type chick // T. Bungo, K. Kawamura, T. Izumi, K.I. Dodo, H. Ueda. - Pharmacology biochemistry and behavior, 2004. V. 78. № 8. - P. 707 - 710.
agricultural toxicants in meat products by ELISA method // Congr. proceed. 44-th ICOMST, 1998, 30 Aug. - 4 Sept.1998. V.I., Barcelona, Spain. - P. 374-375.
10. Иванкин А.Н., Неклюдов А.Д., Суханова С.И., Галкин А.В. Анализ остаточного содержания вредных препаратов в мясных продуктах с использованием метода ELISA // Мясная индустрия . -1998. - №3. - С.49-51.
11. Указание по организации Государственного ветеринарного надзора за содержанием гормональных стимуляторов роста и тиреостатиков в продуктах животного происхождения, утв. Приказом Департамента ветеринарии от 04.10.99 №12-7-1-900.
12. Правила по организации государственного ветеринарного надзора за содержанием гормональных стимуляторов роста и тиреостатиков в продукции животного происхождения от 18.08.99 №604.
13. Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н., Бердутина А.В., Карпо Б.С., Галкин А.В. Экологическая безопасность мясных продуктов. Анализ гормонов // Хранение и переработка сельхозсырья. - 1999. - № 3. - С. 27 - 30.
14. Scientific Opinion of the Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDAP) on a request from the European Commission on the safety evaluation of ractopamine //The EFSA Journal.- 2009. - V. 1041. - Р.52.
15. El-Armouche A., Gocht F., Jaeckel E. Long-term ^-adrenergic stimulation leads to downregulation of protein phosphatase inhibitor-1 in the heart // European Journal of Heart Failure.-2007.- V. 9.- P.1077.
16. Widstrand C., Larsson F., Fiori M., Civitareale C., Mirante S., Brambilla G. Evaluation of MISPE for the multi-residue extraction of в-agonists from calves urine // Journal of Chromatography B. - 2004. - V. 804. - № 5. - P. 85-91.
17. Pearen M.A., Ryall J.G., Lynch G.S., Muscat G. Expression profiling of skeletal muscle following acute and chronic P2-adrenergic stimulation: implications for hypertrophy, metabolism and circadian rhythm // BMC Genomics. - 2009. -V. 10. - P.448.
18. Council Directive 96/22/ЕС of 29 April 1996 concerning on the use in stockfarming of certain substаnces having a hormonal or thyrostatic action and of beta-agonists, and repealing Directives 81/602/EEC, 88/146/EEC and 88/299/EEC // Official Journal of the European Communities. L. 125. P.3.
19. Единые санитарно-эпидемиологические и гигиенические требования к товарам, подлежащих санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю), утв. Решением комиссии таможенного союза № 299 от 28.05.2010 г.
20. Anonymous (1996) Council Directive 96/23/EC of 29 April 1996 on measures to monitor certain substances and residues thereof in live animals and animal products, and repealing Directives 85/358/EEC and 86/469/EEC and Decisions 89/187/ EEC and 91/664/EEC, and in particular Art. 21. OfficialJournalo ftheEuropeanCommunitiesL125(23 May 1996). P.10.
21. ГОСТ Р 54032-2010 Продукты пищевые, корма, продовольственное сырье. Метод определения содержания бета-адреностимуляторов с помощью газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектором. -М.: Стандартинформ, 2011.- 16 с.
9. Ivankin A.N. Analysis of agricultural toxicants in meat products by ELISA method // A.N. Ivankin, B.S. Karpo, A.V. Galkin. - Congr. proceed. 44-th ICOMST. 30 Aug. - 4 Sept. 1998. V. I. Barcelona, Spain. - P. 374 - 375.
10. Ivankin A.N. Analiz ostatochnogo soderdgania vrednih pre-paretov v myasnih productah s ispolzovaniem metoda ELISA [Analysis of harmful drugs residues in meat products by using the ELISA] // A.N. Ivankin, A.D. Neklyudov, S.I. Suhanova, A.V. Galkin. - Meat industry (rus). 1998. № 3. C. 49 - 51.
11. Ukazanie po organizatsii Gosudarstvenogo veterinarnogo nadzora za soderdganiem gormonalinih stimulyatorov rosta tireostatikov v productah givotnogo proishogdenia, utv. Pri-kazom Departamenta veterinarii [Note on the Organization of State veterinary supervision over the content of hormonal growth promotants and tireostatikov in animal products, approved by the Decree of the Department of veterinary medicine] 04.10.99. №12-7-1-900.
12. Pravila po organizatsii Gosudarstvenogo veterinarnogo nadzora za soderdganiem gormonalinih stimulyatorov rosta i tireostatikov v productah givotnogo proishogdenia [Rules on organization of State veterinary supervision over the content of hormonal growth promotants and tireostatikov in products of animal origin] 8.08.99. № 604.
13. Neklyudov A.D. Ekologicheskaya bezopasnost myasnih pro-ductov. Analiz hormonov // A.D. Neklyudov, A.N. Ivankin, A.V. Berdutona, B.S. Karpo, A.V. Galkin. - Storage and processing raw material, 1999. № 3. - C. 27 - 30.
14. Scientific Opinion of the Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDAP) on a request from the European Commission on the safety evaluation of ractopa-mine // The EFSA Journal, 2009. V. 1041. - P. 52.
15. El-Armouche A. Long-term adrenergic stimulation leads to downregulation of protein phosphatase inhibitor-1 in the heart // A. El-Armouche, F. Gocht, E. Jaeckel. - European journal of heart failure, 2007. V. 9. - P. 1077.
16. Widstrand C. Evaluation of MISPE for the multi-residue extraction of 0-agonists from calves urine // C. Widstrand, F. Lars-son, M. Fiori, C. Civitareale, S. Mirante, G. Brambilla. - Journal of chromatography B, 2004. V. 804. № 5. - P. 85 - 91.
17. Pearen M.A. Expression profiling of skeletal muscle following acute and chronic 02-adrenergic stimulation: implications for hypertrophy, metabolism and circadian rhythm // M.A. Pearen, J.G. Ryall, G.S., Lynch, G., Muscat B.M.C. - Genomics, 2009. V. 10. - P. 448.
18. Council Directive 96/22/EC of 29 April 1996 concerning on the use in stockfarming of certain substances having a hormonal or thyrostatic action and of beta-agonists, and repealing Directives 81/602/EEC, 88/146/EEC and 88/299/EEC // Official Journal of the European Communities. L. 125. P.3.
19. Edinie sanitarno-epidemiologiheskie i gigieniheskie tre-bovania k tovaram, podlegashih sanitarno-epidemiologiches-komu nadzoru, utv. Resheniem komissii Tamosgenogo soyuza [Common sanitary-epidemiological and hygienic requirements for goods subject to sanitary-epidemiological supervision (control), approved by decision of the Commission of the Customs Union] № 299. 28.05.2010.
20. Anonymous (1996) Council Directive 96/23/EC of 29 April 1996 on measures to monitor certain substances and residues thereof in live animals and animal products, and repealing Directives 85/358/EEC and 86/469/EEC and Decisions 89/187/EEC and 91/664/EEC, and in particular Art. 21. Official Journal of the European Communities L125(23 May 1996). P.10.
21. GOST R 54032-2010 Produkti pisevie, korma, prodovolst-vennoe sirie. Metod opredelenia sodergania beta-adrenostimu-latorov s pomoshu gazovoip hromatografii s mass-spektrometri-heskim detektorom. [State standard RU № 54032-2010. Food, feed, food raw materials. Method for determination of content of beta-adrenostimulatorov by gas chromatography with mass spectrometric detector.] - M.: Standartinform, 2011. - 16 c.
