CC BY
165
КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Валентина Николаевна Кондратова1, Нина Алексеевна Пирогова2,
Вера Николаевна Степина3, Борис Константинович Поддубный4, Евгений Григорьевич Матякин5, Владимир Эдуардович Гурцевич6, Анатолий Владимирович Лихтенштейн7
МАРКЕРЫ ВИРУСА ЭПШТЕЙНА—БАРР ПРИ РАКЕ НОСОГЛОТКИ
1 Научный сотрудник, лаборатория биохимии опухолей НИИ канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)
2 Ведущий программист, Централизованный научно-организационный отдел ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)
3 Д. м. н., старший научный сотрудник, лаборатория вирусного канцерогенеза НИИ канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)
4 Д. м. н., профессор, заведующий, отделение эндоскопическое НИИ клинической онкологии ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)
5 Д. м. н., профессор, заведующий, отделение опухолей верхних дыхательно-пищеварительных путей НИИ клинической онкологии ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)
6 Д. м. н., профессор, заслуженный деятель науки РФ, заведующий, лаборатория вирусного канцерогенеза НИИ канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)
7 Д. б. н., заведующий, лаборатория биохимии опухолей НИИ канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)
Адрес для переписки: 115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24, лаборатория вирусного канцерогенеза НИИ канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН, Лихтенштейн Анатолий Владимирович; e-mail: alicht@crc.umos.ru
Основными целями данного исследования были изучение у российских больных раком носоглотки и у пациентов с другими опухолями полости рта (ДОПР) иммунного ответа на внедрение вируса Эпштейна—Барр при одновременном подсчете в плазме крови этих больных числа копий вирусной ДНК и оценка содержания в ней тотальной (геномной) ДНК. В работе использовали плазму крови 26 больных раком носоглотки, 13 больных с другими опухолями полости рта и 50 здоровых лиц. Полимеразную цепную реакцию в реальном времени использовали для количественной оценки вирусных последовательностей в плазме крови, а метод плавления ДНК с высоким разрешением — для оценки полиморфизма полученных в полимеразной цепной реакции ампликонов. Получены следующие результаты: 1) наиболее специфическим маркером рака носоглотки являются повышенные титры 1дА антител к капсидному антигену вируса Эпштейна—Барр; 2) повышение концентрации вирусной ДНК в плазме крови характерно как для рака носоглотки, так и для других опухолей полости рта; 3) ни один из исследованных маркеров не обладает 100% чувствительностью; 4) почти у всех больных раком носоглотки уровень хотя бы одного из исследованных маркеров существенно превышает норму, что обусловливает целесообразность применения всей панели для повышения чувствительности диагностики; 5) у ряда онкологических больных ампликоны вирусной ДНК обнаруживают полиморфизм нуклеотидной последовательности.
Ключевые слова: вирус Эпштейна—Барр, рак носоглотки, вирус-специфические антитела, вирусная ДНК, ПЦР в реальном времени, диагностика рака.
Рак носоглотки (РНГ) — одна из форм злокачественных новообразований человека, ассоциированных с вирусной инфекцией [1]. Этиологическим фактором РНГ
признан вирус Эпштейна—Барр (ВЭБ) [2]. Важным средством диагностики и скрининга РНГ, широко применяемым в эндемичных районах (Китай, Тайвань, Гонконг),
зз
является обследование пациентов для выявления в сыворотке крови вирус-специфических антител к ВЭБ [3; 4].
Помимо иммунологической серодиагностики в последние годы активно развивается генетическая серодиагностика, основанная на анализе присутствующих в крови внеклеточных (так называемых циркулирующих) нуклеиновых кислот. Эти молекулы, высвобождающиеся из гибнущих в организме клеток, могут служить маркерами того или иного патологического процесса, в частности опухолевого роста [5—7]. Так, в крови больных РНГ посредством полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) постоянно находят большое число копий вирусной ДНК. Этот количественный метод был эффективно применен для диагностики и мониторинга РНГ, а также для оценки эффективности его лечения [8; 9].
Сопоставление иммунологического и генетического подходов, отражающих разные, но при этом взаимосвязанные стороны патологического процесса (иммунную реакцию организма на инфекцию, с одной стороны, и распад пораженных вирусом клеток, с другой), представляется для указанных выше целей особенно перспективным. Действительно, у больных РНГ между результатами иммунологического и генетического тестирования обнаружена корреляция, хотя в целом значимость ДНК-диагностики (число копий вирусного генома в 1 мл плазмы) оказалась, по данным ряда авторов, существенно выше [10; 11].
Поскольку иммунологические и генетические исследования у больных РНГ проводились исключительно в регионах, эндемичных для этого заболевания, оставалось неясным, существует ли подобная корреляция между показателями иммунологического и генетического тестирования у больных РНГ в неэндемичном регионе, каковым является Россия.
Исходя из изложенного целью нашего исследования стало изучение у российских больных РНГ и лиц с ДОПР иммунного ответа на ВЭБ при одновременном подсчете в плазме крови числа копий вирусной ДНК. Кроме того, представлялось важным определить у этих же больных еще один показатель — содержание в плазме крови тотальной геномной ДНК. Для выявления возможной гетерогенности вирусных ампликонов использовали эффективный современный метод плавления ДНК [12].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Клинические образцы
Материалом для исследования служила плазма крови больных, проходивших лечение в ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН: 26 больных с морфологически установленным диагнозом РНГ, 13 больных с опухолями, не локализованными в носоглотке (ДОПР). В качестве контрольных были исследованы образцы плазмы крови 50 здоровых лиц.
Реакция непрямой иммунофлюоресценции
Для определения титра IgG- и 1дА-антител к капсид-ному антигену вируса Эпштейна—Барр (ВКА) использо-
© Кондратова В. Н., Пирогова Н. А., Степина В. Н., Поддубный Б. К., Матякин Е. Г., Гурцевич В. Э., Лихтенштейн А. В., 2012 УДК 616.327.2-006.6:578.825.13:577.2.088
вали клеточную линию P3HR1, продуцирующую вирус и его капсидный антиген. После обработки клеток индуктором 12-0-тетрадеканоил-форбол-13-ацетатом (20 нг/мл) в течение 3—6 сут в популяции появляется примерно 10% клеток, содержащих антиген. Реакцию непрямой флюоресценции проводили как описано ранее [13].
Выделение циркулирующей ДНК
Кровь (5 мл), собранную в пробирки с ЭДТА, центрифугировали при 1500 g, плазму отбирали и хранили при температуре 60 °С. Образцы объемом 0,5—1,0 мл де-протеинизировали фенолом и хлороформом, после чего обессоливали путем диализа или центрифугирования через фильтры «Amicon» (задерживают молекулы массой более 10 кД). Для выделения нуклеиновых кислот из плазмы крови применили оригинальный метод (изотахо-форез в агарозном геле), который обеспечивает полное извлечение всех молекул независимо от размера, что особенно важно при исследовании фрагментированной ДНК [14]. Полоску ДНК объемом 10—20 мкл собирали и доводили до 100 мкл раствором ТЕ (10 мМ трис-HCl, pH 8, 1 мМ ЭДТА). Количество ДНК определяли флуориметри-чески с красителем SYBR Green I на приборе Plate Reader Chameleon V multilabel counter («Hidex Oy», Финляндия).
ПЦР в реальном времени
Число копий вирусной ДНК в 1 мл плазмы крови определяли посредством ПЦР-РВ. Для построения калибровочных кривых использовали ДНК диплоидных клеток Namalwa, содержащих 2 интегрированных вирусных генома; при этом исходили из соотношения 3,3 пг геномной ДНК — 1 копия вирусной ДНК [15].
Для ПЦР-РВ использовали праймеры к фрагменту размером 76 пар нуклеотидов в области BamHI-W вирусной ДНК (GenBank accession number V01555): sense primer — W-44F (5'-CCCAACACTCCACCACACC); antisense primer — W-119R (5'-TCTTAGGAGCTGTCCGAGGG); флуоресцентный зонд W-67T (5'-FAM-
CACACACTACACACACCCACCCGTCTC-RTQ1) [8]. В качестве контроля способности ДНК плазмы служить матрицей в ПЦР использовали уникальный ген K-RAS, как описано ранее [16]. Реакцию вели в 96-луночных планшетах на приборе CFX96 («Bio-Rad Laboratories», США) в 50 мкл реакционной смеси («Синтол», Россия), содержащей 0,3 мкМ каждого из праймеров, 25 нМ флуоресцентного зонда, 4 мМ MgCl2, 200 мМ каждого дНТФ,
1 ед. Taq-полимеразы, 10 мкл раствора ДНК в буфере ТЕ (соответствует 50 мкл плазмы). В каждый анализ включали 2 негативных контроля (образцы, не содержащие ДНК). Условия ПЦР: денатурация 5 мин при температуре 95 °C; 40 циклов 15 с при температуре 95 °С и 30 с при температуре 56,5 °C. Данные ПЦР-РВ анализировали при помощи программы Bio-Rad CFX manager.
Плавление ДНК
В опытах плавления ампликонов вместо флуоресцентного зонда TaqMan использовали в ПЦР-РВ флуоресцентный краситель EvaGreen («Синтол», Россия), сохраняя прежние условия амплификации (см. выше). После амплификации ДНК прогревали в течение 1 мин при температуре 95 °C, затем 2 мин при 50 °C, после чего плави-
ли от 55 до 90 °С (шаг 0,3 °С, выдержка 12 с). Pезультаты анализировали с использованием Bio-Rad Precision Melt Analysis software («Bio-Rad Laboratories», США).
Статистический анализ
Содержание тотальной и вирусной ДНК в плазме крови лиц, входящих в состав разных групп, сравнивали посредством непараметрического критерия (U-критерий Манна—Уитни). Pассчитывали точное значение р (различия считали статистически значимыми при р < 0,05). Титры антител представляли в виде их среднегеометрических значений. Статистическую значимость различий частот изучаемых признаков оценивали с помощью критерия с2, для малых выборок рассчитывали точный критерий Фишера. Меру линейной связи оценивали с помощью коэффициента корреляции рангов Спирмена. Вычисления проводили с помощью статистических пакетов «Statistica for Windows, 6.0» и «SPSS».
РЕЗУЛЬТАТЫ
В плазме крови лиц, принадлежащих к одной из
3 сравниваемых групп (здоровые лица, больные PНГ и пациенты с ДОПP), определяли 4 количественных показателя: содержание тотальной ДНК (т. е. геномной, происходящей из распадающихся клеток организма), вирусной ДНК и титры IgG- и IgA-антител к ВКА.
Кривые амплификации вирусной ДНК сдвигаются влево при увеличении ее исходного содержания в образце (рис. 1, А), что объясняется меньшим значением С^ т. е. того порогового цикла, при котором достигается определенный (превышающий фон) уровень флуоресценции. Линейная зависимость между значением С и логарифмом изначально присутствующих в образце копий вирусной ДНК демонстрирует большой динамический интервал (в пределах 4 порядков величины) и высокую степень точности ПЦP-PВ (рис. 1, Б).
Современные приборы ПЦP-PВ позволяют не только количественно оценить число копий последовательности-мишени, присутствующей в исходном образце, но и определить степень гетерогенности ее нуклеотидной последовательности. Полученные ампликоны анализи-
ровали путем плавления в режиме высокого разрешения (High Resolution Melting Analysis, HRMA) — одним из наиболее эффективных методов выявления генных полиморфизмов и мутаций [12]. Неожиданностью явилось то, что профили плавления ампликонов некоторых онкологических больных (как РНГ, так и ДОПР) имеют, в отличие от таковых здоровых лиц, «двугорбую» форму, свидетельствующую, по-видимому, о полиморфизме их нуклеотидной последовательности (рис. 2). Более детальное исследование этого феномена (степень его распространения, возможное влияние на патогенные свойства вируса) — предмет дальнейших исследований.
Между содержанием тотальной и вирусной ДНК в плазме крови испытуемых лиц во всех группах имеется положительная корреляция (r = 0,9; p < 0,05). У онкологических больных повышены оба эти показателя, однако увеличение содержания вирусной ДНК выражено значительно сильнее и статистически значимо (p < 0,05; U-критерий Манна—Уитни): концентрация вирусной ДНК увеличивается с 980 копий/мл (межквартильный интервал 100—2300 копий/мл) в группе здоровых лиц до 8300 копий/мл (межквартильный интервал 3300— 21000 копий/мл) в группе ДОПР и до 9100 копий/мл (межквартильный интервал 2400—48000 копий/мл) в группе РНГ (см. таблицу). Как и следовало ожидать, вирусная ДНК — более специфичный, чем тотальная ДНК, маркер онкологического процесса, поскольку содержание последней в крови обусловлено суммарным, возникающим в силу множества причин клеточным распадом [17]. При этом следует отметить, что, хотя содержание вирусной ДНК у больных РНГ заметно выше, чем у пациентов с ДОПР (рис. 3), эти различия статистически незначимы.
На рис. 3 представлены титры IgG- и IgA-антител к ВКА, а также содержание вирусной ДНК у здоровых лиц и онкологических больных. Видно, что исследованные показатели претерпевают однотипные изменения: от практически фоновых значений (у здоровых лиц) и несколько его превышающих (у отдельных пациентов с ДОПР) до существенно возрастающих (у больных РНГ). Можно констатировать, что наиболее специфическим
Число циклов ПЦР
Б Логарифм исходного числа копий вирусной ДНК
Рисунок 1. Количественная оценка вирусной ДНК методом ПЦР-РВ. Горизонтальная линия обозначает превышающий фон уровень флуоресценции, который используется для определения порогового числа циклов (С^; ЯРЫ — относительные единицы флуоресценции. Эффективность амплификации Е — 97,9%, коэффициент корреляции Я2 — 0,999. Кривые: 1 — 7 копий вирусного генома;
2 — 38 копий; 3 — 190 копий; 4 — 950 копий; 5 — 4750 копий; 6 — 23 750 копий.
А. Кривые амплификации (зависимость интенсивности флуоресценции от числа циклов ПЦР). Б. Линейная зависимость С от числа копий вирусной ДНК, изначально присутствующих в образце (в логарифмическом масштабе).
Таблица
Содержание вирусной ДНК и титры IgG- и 1дЛ-антител к ВКА в плазме крови больных раком носоглотки, больных другими опухолями полости рта и здоровых лиц (контроль)
Группы Число обследо- ванных Тотальная ДНК, нг/мл Вирусная ДНК, копии/мл Титры антител
медиана МКИ медиана МКИ ДО/ВКА 1дА/ВКА
СГТ МКИ СГТ МКИ
Контроль 50 51 35—65 980 100—2300 2,3 1 — 10 1,3 1—1
ДОПР 13 78а 57—111 8300б 3300—21000 39в 20—80 1,5 1—1
РНГ 26 68 29—146 9100б 2400—48000 850вг 640—1280 114д 40—320
МКИ — межквартильный интервал; СГТ — среднегеометрический титр антител.
а р < 0,05 по сравнению с содержанием тотальной ДНК в контрольной группе (и-критерий Манна—Уитни). б р < 0,05 по сравнению с содержанием вирусной ДНК в контрольной группе (и-критерий Манна—Уитни). в р < 0,05 по сравнению с частотой !дО/ВКА-позитивных случаев в контрольной группе (критерий с2). г р < 0,02 по сравнению с частотой !дО/ВКА-позитивных лиц в группе пациентов с ДОПР (критерий с2).
д р < 0,05 по сравнению с частотой !дА/ВКА-позитивных лиц в контрольной группе и группе пациентов с ДОПР (критерий с2).
показателем РНГ являются повышенные по сравнению с таковыми у здоровых лиц и пациентов с ДОПР титры 1дА-антител к ВКА (р < 0,05; критерий с2) (см. таблицу). Повышение титров IgG-антител к ВКА до 320, как и повышение уровня вирусной ДНК (почти до 40 000 копий в 1 мл плазмы), в редких случаях могут наблюдаться и у отдельных пациентов с ДОПР. И то, и другое, по-видимому, объясняется индивидуальными особенностями иммунной реакции организма на растущую в нем опухоль.
Данные, представленные на рис. 3, свидетельствуют о том, что ни один из исследованных маркеров не обладает 100% чувствительностью в отношении РНГ (уровень любого маркера, будучи повышенным в одном случае, может оказаться в пределах нормы в другом). Поэтому важна оценка диагностической значимости не только индивидуальных маркеров, но и их совокупности. На рис. 4 представлены результаты определения 3 маркеров (IgG-и 1дА-антител к ВКА, а также вирусной ДНК) у каждого из обследованных лиц. Оказалось, что у всех 26 больных РНГ, за единственным исключением, хотя бы один из 3 исследованных показателей превышает максимальные
его значения у здоровых лиц и пациентов с ДОПР. Таким образом, полученные данные позволяют сделать вывод, что использование всей панели маркеров может способствовать более надежной диагностике РНГ.
ОБСУЖДЕНИЕ
Сопоставление ряда серологических (иммунологических и генетических) маркеров ВЭБ, предпринятое в данной работе и проведенное на клиническом материале больных РНГ в России, имеет характер пилотного исследования. Иммунологические сдвиги, отмеченные нами у больных с опухолями головы и шеи, соответствуют в основном таковым у больных эндемичных районов. Эти сдвиги проявляются в специфическом ддя РНГ повышении титров 1дА-антител к ВКА (что отмечено у большинства, хотя и не у всех больных) и менее специфическом повышении титра IgG-антител к тому же антигену (у пациентов с ДОПР он возрастает иногда до 320; см таблицу).
Повышенные уровни циркулирующей ДНК в плазме крови онкологических больных, по наблюдениям ряда исследователей, имеют диагностическую значимость,
Л
Температура, °С
Б
Температура, °С
Рисунок 2. Результаты анализа плавления вирусных ампликонов здоровых лиц и онкологических больных. -ЩЯРи)^Т — отрицательная первая производная кривых плавления.
А. Ампликоны здоровых лиц. Б. Ампликоны больных РНГ и лиц с ДОПР
Рисунок 3. Содержание !д0- и 1дА-антител к ВКА, а также вирусной ДНК в плазме крови здоровых лиц и онкологических больных. I — здоровые лица (контроль); II — пациенты с ДОПР; III — больные РНГ А. ^й. Б. ^А. В. Копии вирусной ДНК.
т. к., вероятно, отражают растущую массу опухоли [18— 21]. Ряд авторов, однако, оспаривают это мнение [22; 23]. Позиции обеих сторон уязвимы для критики, поскольку общеупотребительные методы выделения циркулирующей ДНК далеко не количественны [23], а принятый в большинстве работ способ измерений, основанный на ПЦР-РВ, не учитывает сильной фрагментации циркулирующей ДНК и, следовательно, неспособности многих мелких фрагментов участвовать в реакции амплифика-
ции [21; 24]. Ранее нами был разработан количественный метод выделения циркулирующей ДНК (изотахофорез в агарозном геле) [14], что позволило нам более объективно оценить значение этого диагностического показателя. В наших исследованиях у онкологических больных обеих групп (РНГ и ДОРП) отмечено повышение уровня как тотальной, так и вирусной ДНК (см. таблицу). Последнее наблюдение (обнаружение вирусных последовательностей в плазме крови не только больных РНГ, но и у пациентов с ДОПР и даже здоровых лиц) довольно неожиданно. Хотя подобные наблюдения делались и ранее [8; 10], в исследованной нами группе здоровых лиц пропорция «носителей» вирусной циркулирующей ДНК оказалась неожиданно высокой (около 50%). В настоящее время неизвестно, чем объясняется это явление: случайностью ли, обусловленной относительно небольшой выборкой, спецификой генетического и/или иммунного статуса исследованной нами популяции неэндемичного по РНГ региона или же особенностями методического подхода (иным, в частности, чем прежде, и более количественным способом извлечения циркулирующей ДНК). Выяснение как этого вопроса, так и возможности применения данного подхода для мониторинга заболевания и эффективности его лечения, нуждается в дальнейших исследованиях.
Наиболее специфичным в отношении РНГ, судя по нашим данным, являются повышенные титры 1дА антител к ВКА (см. таблицу). Однако поскольку этот тест, как и другие, не обладает 100% чувствительностью, представляется оправданным применение всей панели маркеров: 1дА- и IgG-антитела к ВКА и вирусная ДНК. Это кажется тем более целесообразным, что появляется возможность дискриминировать разные типы опухолей этой локали-
350 ООО
х
с[
0
1
£
250 000
200 000
150 000
100 000
50 000
1 2 Динин
I
А
3000
2500
2000
1500
1000
500
а
1
а.
Рисунок 4. Содержание !дО- и 1дА-антител к ВКА, а также вирусной ДНК в плазме крови здоровых доноров и онкологических больных (индивидуально). 1 — ВЭБ; 2 — ^й-антитела к ВКА; 3 — ^А-антитела к ВКА.
А. Здоровые лица (контроль). Б. Пациенты с ДОПР. В. Больные РНГ
зации: превышение любым из этих показателей фоновых величин должно насторожить врача в отношении возможной опухоли в области головы и шеи, а превышение определенных «пороговых» уровней (IgA/BKA — > 0, IgG/BKA — > 320, вирусная ДНК — > 40 000 копий/мл) может указывать на наличие РНГ (см. рис. 4).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В плазме крови онкологических больных (опухоли головы и шеи) статистически значимо повышены титры IgA- и IgG-антител к ВКА, а также содержание вирусной ДНК. Наиболее специфичным для РНГ является повышение титров IgA-антител к ВКА. Поскольку ни один из исследованных маркеров не обладает 100% чувствительностью в отношении РНГ, представляется целесообразным использование всей их панели (практически у каждого больного РНГ хотя бы один из маркеров превышает «пороговый» уровень). У ряда онкологических больных ампликоны вирусной ДНК обнаруживают полиморфизм нуклеотидной последовательности. Это наблюдение нуждается в дальнейшем исследовании, поскольку может иметь отношение к туморогенным свойствам разных изолятов ВЭБ.
Работа поддержана грантом. РФФИ (проект №10-04-00060а).
ЛИТЕРАТУРА
1. Hildesheim A., Levine P. H. Etiology of nasopharyngeal carcinoma: a review // Epidemiol. Rev. — 1993. — Vol. 15. — P. 466—485.
2. Genome-wide scan for familial nasopharyngeal carcinoma reveals evidence of linkage to chromosome 4 / Feng B. J., Huang W., Shugart Y. Y., Lee M. K., Zhang F., Xia J. C., Wang H. Y., Huang T. B., Jian S. W., Huang P., Feng Q. S., Huang L. X., Yu X. J., Li D., Chen L. Z., Jia W. H., Fang Y., Huang H. M., Zhu J. L., Liu X. M., Zhao Y., Liu W. Q., Deng M. Q., Hu W. H., Wu S. X., Mo H. Y., Hong M. F., King M. C., Chen Z., Zeng Y. X. // Nat. Genet. — 2002. — Vol. 31. — P. 395—399.
3. Follow-up studies on Epstein—Barr virus IgA/VCA antibody-positive persons in Zangwu County, China / Zeng Y., Zhong J. M., Li L. Y., Wang P. Z., Tang H., Ma Y. R., Zhu J. S., Pan W. J., Liu Y. X., Wei Z. N. // Intervirology. — 1983. — Vol. 20. — P. 190—194.
4. Serological diagnosis of nasopharyngeal carcinoma by enzyme linked immunosorbent assay: optimization, standardization and diagnostic criteria / Ng M. H., Chen H. L., Luo R. X., Chan K. H., Woo P. C., Sham J. S., Huang J., Seto W. H., Smith P., Griffin B. E. // Chin. Med. J. (Engl.). — 1998. — Vol. 111. — P. 531—536.
5. Circulating nucleic acids and apoptosis / Lichtenstein A. V., Melkonyan H. S., Tomei L. D., Umansky S. R. // Ann. N. Y. Acad. Sci. — 2001. — Vol. 945. — P. 239—249.
6. Sidransky D. Emerging molecular markers of cancer // Nat. Rev. Cancer. — 2002. — Vol. 2. — P. 210—219.
7. Cell-free and cell-bound circulating DNA in breast tumours: DNA quantification and analysis of tumour-related gene methylation / Skvortsova T. E., Rykova E. Y., Tamkovich S. N., Bryzgunova O. E., Starikov A. V., Kuznetsova N. P., Vlassov V. V., Laktionov P. P. // Br. J. Cancer. — 2006. — Vol. 94. — P. 1492—1495.
8. Quantitative analysis of cell-free Epstein—Barr virus DNA in plasma of patients with nasopharyngeal carcinoma / Lo Y. M., Chan L. Y., Lo K. W., Leung S. F., Zhang J., Chan A. T., Lee J. C., Hjelm N. M., Johnson P. J., Huang D. P. // Cancer Res. — 1999. — Vol. 59. — P. 1188—1191.
9. Epstein—Barr virus DNA in serum/plasma as a tumor marker for nasopharyngeal cancer / Shotelersuk K., Khorprasert C., Sakdikul S.,
Pornthanakasem W., Voravud N., Mutirangura A. // Clin. Cancer Res. — 2000. — Vol. 6. — P. 1046—1051.
10. Comparison of plasma Epstein—Barr virus (EBV) DNA levels and serum EBV immunoglobulin A/virus capsid antigen antibody titers in patients with nasopharyngeal carcinoma / Shao J. Y., Li Y. H., Gao H. Y., Wu Q. L., Cui N. J., Zhang L., Cheng G., Hu L. F., Ernberg I., Zeng Y. X. // Cancer. — 2004. — Vol. 100. — P. 1162—1170.
11. Comparison of the prognostic impact of serum anti-EBV antibody and plasma EBV DNA assays in nasopharyngeal carcinoma / Twu C. W., Wang W. Y., Liang W. M., Jan J. S., Jiang R. S., Chao J., Jin Y. T., Lin J. C. // Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. — 2007. — Vol. 67. — P. 130— 137.
12. Erali M., Wittwer C. T. High resolution melting analysis for gene scanning // Methods. — 2010. — Vol. 50. — P. 250—261.
13. Гуморальный иммунный ответ к вирусу Эпштейна—Барр в диагностике рака носоглотки (обзор литературы и 30-летний опыт собственных исследований) / Гурцевич В. Э., Степина В. Н., Сенюта Н. Б., Гончарова Е. В., Щербак Л. Н., Душенькина Т. Е., Репкина И. А., Белоусова Н. В., Кондратьева Т. Т., Алиева С. Б., Ахундов А. А., Матякин Е. Г., Поддубный Б. К., Пробатова Н. А., Пачес А. И. // Вестн. РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН. — 2011. — №. 22. — С. 20—29.
14. Tube gel isotachophoresis: A method for quantitative isolation of nucleic acids from diluted solutions / Kondratova V. N., Boteza-tu I. V., Shelepov V. P., Lichtenstein A. V. // Anal. Biochem. — 2011. — Vol. 408. — P. 304—308.
15. Lawrence J. B., Villnave C. A., Singer R. H. Sensitive, high-res-olution chromatin and chromosome mapping in situ: presence and orientation of two closely integrated copies of EBV in a lymphoma line // Cell. — 1988. — Vol. 52. — P. 51—61.
16. DNA melting analysis: Application of the «open tube» format for detection of mutant KRAS / Botezatu I. V., Kondratova V. N., Shelepov V. P., Lichtenstein A. V. // Anal. Biochem. — 2011. — Vol. 419. — P. 302—308.
17. DNA fragments in the blood plasma of cancer patients: quantitations and evidence for their origin from apoptotic and necrotic cells / Jahr S., Hentze H., Englisch S., Hardt D., Fackelmayer F. O., Hesch R. D., Knippers R. // Cancer Res. — 2001. — Vol. 61. — P. 1659—1665.
18. Quantification of free circulating DNA as a diagnostic marker in lung cancer / Sozzi G., Conte D., Leon M., Ciricione R., Roz L., Rat-cliffe C., Roz E., Cirenei N., Bellomi M., Pelosi G., Pierotti M. A., Pasto-rino U. // J. Clin. Oncol. — 2003. — Vol. 21. — P. 3902—3908.
19. Taback B., O'Day S. J., Hoon D. S. Quantification of circulating DNA in the plasma and serum of cancer patients // Ann. N. Y. Acad. Sci. — 2004. — Vol. 1022. — P. 17—24.
20. Quantification of total plasma cell-free DNA in ovarian cancer using real-time PCR / Kamat A. A., Sood A. K., Dang D., Gershen-son D. M., Simpson J. L., Bischoff F. Z. // Ann. N. Y. Acad. Sci. — 2006. — Vol. 1075. — P. 230—234.
21. High Fragmentation Characterizes Tumour-Derived Circulating DNA / Mouliere F., Robert B., Arnau Peyrotte E., Del Rio M., Ychou M., Molina F., Gongora C., Thierry A. R. // PLoS One. — 2011. — Vol. 6. — P.e23418.
22. Quantitative analysis of circulating plasma DNA as a tumor marker in thoracic malignancies / Herrera L. J., Raja S., Gooding W. E., El-Hefnawy T., Kelly L., Luketich J. D., Godfrey T. E. // Clin. Chem. — 2005. — Vol. 51. — P. 113—118.
23. Improved method for isolating cell-free DNA / Schmidt B., Weickmann S., Witt C., Fleischhacker M. // Clin. Chem. — 2005. — Vol. 51. — P. 1561—1563.
24. Novel applications of polymerase chain reaction to urinary nucleic acid analysis / Lichtenstein A. V., Melkonyan H. S., Tomei L. D., Umansky S. R. // Methods Mol. Biol. — 2006. — Vol. 336. — P. 145—154.
Поступила 03.02.2012
Valentina Nikolayevna Kondratova1, Nina Alexeyevna Pirogova2,
Vera Nikolayevna Stepina3, Boris Konstantinovich Poddubny4,
Evgeniy Grigorievich Matyakin5, Vladimir Eduardovich Gurtsevich6, Anatoliy Vladimirovich Lichtenshtein7
EPSTEIN—BARR VIRUS MARKERS IN PATIENTS WITH NASOPHARYNGEAL CARCINOMA
1 MSc, Researcher, Tumor Biochemistry Laboratory, Carcinogenesis Research Institute,
N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center, RAMS (24, Kashirskoye sh., Moscow, RF, 115478)
2 Leading Programmer, Centralized Research Organization Department, N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center,
RAMS (24, Kashirskoye sh., Moscow, RF, 115478)
3 MD, PhD, DSc, Senior Researcher, Viral Carcinogenesis Laboratory, Carcinogenesis Research Institute,
N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center, RAMS (24, Kashirskoye sh., Moscow, RF, 115478)
4 MD, PhD, DSc, Professor, Head, Endoscopy Department, Clinical Oncology Research Institute,
N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center, RAMS (24, Kashirskoye sh., Moscow, RF, 115478)
5 MD, PhD, DSc, Professor, Head, Upper Respiratory and Digestive Tract Tumor Department, Clinical Oncology Research Institute, N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center, RAMS (24, Kashirskoye sh., Moscow, RF, 115478)
6 MD, PhD, DSc, Professor, RF Honored Scientist, Head, Viral Carcinogenesis Laboratory, Carcinogenesis Research Institute, N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center, RAMS (24, Kashirskoye sh., Moscow, RF, 115478)
7 MSc, PhD, DSc, Head, Tumor Biochemistry Laboratory, Carcinogenesis Research Institute,
N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center, RAMS (24, Kashirskoye sh., Moscow, RF, 115478)
Address for correspondence: Lichtenshtein Anatoliy Vladimirovich, Viral Carcinogenesis Laboratory, Carcinogenesis
Research Institute, N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center, RAMS, 24, Kashirskoye sh., Moscow, RF, 115478;
e-mail: alicht@crc.umos.ru
The purpose of this study was to assess immune response to Epstein—Barr virus, to count total (genomic) and viral DNA copy numbers in blood plasma samples from patients with nasopharyngeal carcinoma and patients with other oral tumors. Blood plasma was collected from 26 nasopharyngeal carcinoma patients, 13 patients with other oral tumors and 50 healthy individuals. Real-time polymerase chain reaction was used to quantify viral DNA sequences and high resolution DNA melting was used to assess viral amplicom gene polymorphism. Our findings were as follows: 1) elevated IgA titers of antibody to Epstein—Barr virus capsid antigen were the most specific marker of nasopharyngeal carcinoma; 2) increased plasma viral DNA concentration was characteristic of both nasopharyngeal carcinoma and other oral tumors; 3) none of the markers studied demonstrated a 100% sensitivity; 4) practically every patient with nasopharyngeal carcinoma demonstrated a higher than normal level of at least one of the markers that suggested the need to use the entire panel to improve the test sensitivity; and 5) high resolution DNA melting analysis detected genetic polymorphism of viral amplicons in some of the patients with nasopharyngeal carcinoma and other oral tumors.
Key words: Epstein—Barr virus, nasopharyngeal carcinoma, virus-specific antibody, viral DNA, real-time PCR, cancer diagnosis.
